大鼠实验性脾虚证胃粘膜生长抑素mRNA原位杂交研究*
作者：王秀琴 曾晓蓓 尚宏伟 王兴翠 杨 进
单位：首都医科大学组织学胚胎学教研室，北京 100054
关键词：生长抑素；D细胞；胃粘膜；实验性脾虚证；原位杂交；大鼠
解剖学报980316 摘 要 为探讨脾虚证时生长抑素分泌失常的机理，用Wistar雄性大鼠24只，分为正常对照组、实验性脾虚组、自然恢复组和中药治疗组。4组动物同时处死，取胃制成恒冷箱切片，以地高辛标记的生长抑素cRNA为探针，用原位杂交法显示胃粘膜D细胞中的生长抑素mRNA，并对细胞内杂交信号进行了显微分光光度计测定。结果表明，与对照组相比，脾虚组胃粘膜D细胞mRNA表达增强，细胞密度增大。与自然恢复组相比，中药治疗组的D细胞mRNA的表达和细胞密度与对照组相近。本研究提示，脾虚证大鼠胃粘膜D细胞生长抑素mRNA的高表达导致生长抑素合成增高，并对其意义进行了讨论。
, http://www.100md.com
近年来，对于脾虚证机理的研究，多以脾胃学说的“胃主受纳，主降；脾主运化，主升”；“内伤脾胃，百病由生”[1]理论出发。对脾虚证病人及实验性脾虚动物进行了消化吸收障碍机理的研究[2]。我们和一些学者的研究表明，动物实验和脾虚证病人消化道胃肠激素分泌出现异常[3，4]，可能是导致消化吸收障碍的重要原因。已有报道，在消化性溃疡、萎缩性胃炎时D细胞减少[5，6]。本室先前的工作证实，实验性脾虚证时胃幽门粘膜D细胞内生长抑素含量增多[3]。目前对脾虚证明胃肠激素分泌失常，尚无基因调控的实验依据。为此本研究用地高辛标记的生长抑素(SOM)mRNA探针，观察脾虚证大鼠胃粘膜D细胞生长抑素mRNA表达，意图进一步探讨脾虚证生长抑素分泌失常的机理。
材料和方法
1.实验动物分组
成年雄性Wistar大鼠(Ⅱ级动物，中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供)24只，体重130～150g,随机分为4组：对照组5只，实验脾虚组7只，自然恢复组6只，中药治疗组6只。实验性脾虚组用破气苦降药和饮食失节相结合的方法[7]，并稍增加了大黄的剂量，致成脾虚动物模型。破气苦降药按厚朴：枳实：大黄为3∶3∶3的比例，冷水浸泡20min，煮沸20min，过滤浓缩成100%煎剂(含生药1kg/L)，隔日灌服，1日2次，每次3ml(药量为2g生药/100g体重)，喂药当日禁食，次日自由进食，喂养42d，致成脾虚证模型。对照组按脾组法灌服自来水，每次3ml,但饮食不限，饲养42d。中药治疗组为在致成脾虚证后，用加味加君子汤[7]治疗。汤剂成分的比例为炙黄芪：党参：伏苓：炒白术：炙甘草=2∶2∶2∶2∶1的比例，制成100%煎剂，隔日灌服，每日2次，每次3ml(药量相当于1.5g生药/100g体重)，正常饮食，喂养21d。自然恢复组按治疗组法灌服自来水、剂量及时间同治疗组。4组动物于1d\,21d和42d时称量体重。
, 百拇医药
2.取材和制片
4组动物同时取材，取材前禁食12h。于腹腔注射6%水合氯醛(0.5mol/100g体重)麻醉后，心脏取血处死。取胃沿胃小弯剪开，用生理盐水洗净胃内容物，沿胃长轴取宽约6mm、长约1.5cm的组织块，液氮骤冷，保存于-20℃～-40℃冰箱，次日制恒冷箱切片，厚10μm，裱贴于涂有含焦碳酸二乙酯(DEPC)的明胶的载玻片上，室温吹干，4%多聚甲醛固定20min,70%乙醇固定10min。然后进行原位杂交。
3.原位杂交程序(按Hoefler方法进行[8]
3.1 杂交前处理：切片依次入PBS(pH7.2)漂洗4次，每次5min;0.1mol/L甘氨酸(PBS配制)5min；0.4%Triton X-100(PBS配制)室温漂洗15min;1mg/L蛋白酶K 37℃消化30min;4%多聚甲醛5min;PBS漂洗2次，每次5min;0.25%乙酸酐(0.1mol/L，用三乙醇胺新鲜配制)室温10min;2×SSC 10min。
, 百拇医药
3.2 杂交：滴加0.5mg/L地高辛标记的生长抑素cRNA探针(上海第二军医大学组织学胚胎学教研室制试剂盒)的杂交液，覆盖Parafilm膜，置湿盒内于43℃杂交12～16h。 3.3 杂交后处理：杂交后的式片依次入4×SSC，37℃,15min;含RNase A的2×SSC(20mg/L)，37℃,30min,用以消化多余的探针；入1×SSC和0.5×SSC，37℃各15min；0.05mol/L PBS 室温洗3次，每次5min。将碱性酶酶标记的抗地高辛抗体(来源同cRNA探针试剂盒，1∶1 000稀释)滴在切片上，用Parafilm膜覆盖，置湿盒内室温孵育4h。然后依次入0.05mol/L PBS，4次，每次5min;TSM12次，每次5min；TSM22次，每次5min。滴加NBT(硝基四氮唑蓝，400mg/L)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸，200mg/L)混合液，置湿盒内避光显色3～4h；入0.05mol/L PBS 漂洗2次，每次5min；双蒸水洗；甘油明胶封片。
, 百拇医药
4.原位杂交阴性对照
杂交液免去地高辛标记的cRNA探针或杂交前用RNaseA，37℃处理30min。
5.定量分析
5.1 杂交信号定量分析：将4组动物杂交阳性细胞用显微分光光度计(MPV-COM，BI，Leica)作定量测定。显微放大倍数为10×40。每组各测5例动物，每例随机测50个细胞，将测得的平均光密度值(MOD)作统计学分析。
5.2 细胞密度测定：普通光学显微镜10×10放大倍数下，用0.1×0.1mm的网格目镜测微尺，将测微尺的一侧置于胃粘膜的基底面，从胃幽门开始，连续测量10个测量尺面积的区域，计数这些区域的阳性细胞数，然后计算出细胞密度。所得数据作方差分析。
结 果
, 百拇医药
1.脾虚动物模型的复制
大鼠灌服致脾虚的中药煎剂后，第3d开始，喂药当日出现软便，次日恢复。随着造模时间延长，喂药当日出现溏便，次日可见软便。20d以后可见溏便脏尾、懒动、毛枯槁无滑、食欲减退、拱背、体重增长缓慢；随着时间延长，这些体症逐渐加重。脾虚组动物出现的这些体征与临床脾虚证所见相似。30d后，偶有动物死亡，但模型成功率一般不低于95%。灌服加味四君子汤后，大鼠出现的体征明显减轻并好转。溏便恢复较快、食量增加、毛光滑、体重增加较馔 。自然恢复组动物的体征不如治疗组恢复快。各组动物的体重见表1。对各组动物体重的统计学分析，结果为脾虚组动物体重明显低于对照组(P<0.01)。中药治疗组动物体重增加高于自然恢复组，但与对照组相比有差异(P<0.05)，说明未恢复到正常水平。
表1 4组动物的体重变化
Table 1 Changes of body weight in 4 groups animals 组别
, 百拇医药
group
动物只数
number of animals
体 重(g) (
±s)body weight (g)
体重增长量(g)(±s)
body weight grown(g)
致脾虚证天数
days of spleen deficiency induced
, 百拇医药
中药治疗天数
days of Chinese herbs treatment
对照组
normal control group
15
134.267±7.285
354.0±30.624
219.733±30.082
脾虚组
spleen deficiency syndrome group
27
, 百拇医药
129.593±7.143
204.741±34.135
75.296±33.569*
自然恢复组
spontaneous recovery group
15
212.267±22.154
327.4±19.675
115.133±17.639
中药治疗组
therapeutic group
, http://www.100md.com
15
234.2±25.18
380.933±38.951
148.667±28.928**
* 42d脾虚组与对照组相比，P<0.01 ** 21d中药治疗组接近于对照组，但两组的差异具有显著性，P<0.05 * as compared with normal control group,P<0.01 ** as compared with normal control group,P<0.052.组织学观察
光镜下未见胃幽门粘膜异常(图1)，可见生长抑素mRNA杂交阳性细胞(D细胞)分布于胃窦粘膜的中下层，数目多(图2)。胃底和胃体粘膜阳性细胞较少，散在于粘膜中。阳性细胞轮廓清楚，多呈圆形、椭圆形、梭形或不规则形，有的细胞可见伸出突起(图5)。阳性细胞胞质内含有蓝紫色的碱性磷酸酶反应产物，呈细颗粒状，有的细胞呈深色，有的呈浅色。胞核为阴性。大多数细胞核被反应产物所掩盖，也可见少数细胞核无反应产物掩盖。阴性对照切片不着色，表明无杂交阳性反应产物。正常对照线胃窦粘膜内杂交阳性D细胞胞质呈浅蓝色，表示杂交信号弱。细胞少，分布稀疏(图3，7)且密底低。实验性脾虚组胃窦粘膜内杂交阳性细胞呈深蓝色，表示杂交信号强，细胞数目多且密度增大(图4，8)。自然恢复组胃窦粘膜内杂交阳性细胞比对照组染色深，但比脾虚组染色浅，表示杂交信号比对照组强，而弱于脾虚组(图5)。中药治疗组胃窦粘膜内杂交阳性细胞呈浅蓝色，表示杂交信号弱。细胞密度低(图6)，与对照组相近。4组动物胃体和胃底粘膜杂交阳性细胞稀少，杂交反应与胃窦的相似。
, http://www.100md.com
3.杂交信号和细胞密度的测定
用显微分光光度计测定4组动物杂交反应产物的光密度值(平均光密度值，MOD)，结果见表2。统计学处理表明，脾虚组MOD值明显高于对照组(P<0.01)，有显著性差异。中药治疗组的MOD值低于自然恢复组(P<0.01)有显著性差异，与对照组相近(P>0.05)，差异无显著性意义。
4组动物胃粘膜D细胞密度测定的结果见表3。与对照组相比，脾虚组D细胞密度增大(P<0.01)，有显著性差异。与自然恢复组相比，中药治疗组D细胞数目减少，细胞密度降低(P<0.01)差异显著，与对照组相似(P>0.05)，差异无显著性。
表2 胃粘膜内D细胞生长抑素mRNA表达的定量测定
Table 2 Quantitative measurement of somatostatin mRNA expression of D cells in gastric mucosa 组别group
, 百拇医药
动物只数
number of
animals
测定细胞数
cell number
measured
MOD(±s)
对照组(normal control group)
5
250
0.477±0.147
, 百拇医药
脾虚组(spleen deficiency syndrome group)
5
250
0.736±0.225*
自然恢复组(spontaneous recovery group)
5
250
0.775±0.169
中药治疗组(therapentic group)
5
250
, 百拇医药
0.498±0.064**
* 脾虚组与对照组相比，P<0.01 **中药治疗组与对照组相比，P>0.05；中药治疗组与自然恢复组比较，P<0.01 * as compared with normal control group,P<0.01 ** as compared with normal control group,P>0.05 ** as compared with spontaneous recovery group P<0.01MOD.平均光密度值(mean optic density)表3 胃粘膜D细胞杂交阳性细胞密度的测定
Table 3 Cell density of smatiostatin mRNA positive
D cells in gastric mucosa 组别
, http://www.100md.com
group
动物数
number of
animals
测定细胞数
number of
areas
细胞密度(±s)
cell density
对照组(normal control group)
5
, 百拇医药
50
0.458±0.137
脾虚组(spleen deficiency syndrome group)
5
50
1.418±0.332*
自然恢复组(spontaneous recovery group)
5
50
1.038±0.262
中药治疗组(therapentic group)
, 百拇医药
5
50
0.564±0.144**
* 脾虚组与对照组相比，P<0.01 **中药治疗组与对照组相比，P>0.05；与自然恢复组相比，P<0.01
as compared with morntal controt group,P<0.01as compared with normal control group,P>0.05；as compared with spontaneous recovery group,P>0.01讨论
已知，胃肠道存在多种内分泌细胞，它们分泌不同的肽类激素[9]，对食物的消化吸收起着重要的调节作用。目前，对肽和蛋白质激素的研究，已从肽和蛋白的翻译水平深入到基因的转录水平[10]。本研究用地高辛标记的生长抑素cRNA为探针，观察了胃粘膜D细胞生长抑素mRNA的转录变化。结果证明，与对照组相比，脾虚组胃粘膜D细胞的密度增高，杂交信号强；经定量测定，杂交产物含量高于对照组，且细胞密度高，表明脾虚组D细胞内mRNA表达增强。细胞内mRNA的表达水平反映DNA分子上编码其肽链的基因转录水平[11]。这表明脾虚组D细胞内编码生长抑素的基因处于较高的转录水平。从基因转录出的mRNA直接参与蛋白质和多肽的翻译和合成。由于脾虚组D细胞内mRNA增多，可使生长抑素的合成增强，这与我们先前对D细胞的免疫组织化学的研究结果一致[3]。马建伟等[12]报道，临床脾虚病人和脾虚动物，胃窦组织和血清中生长抑素含量都高于对照组，也支持我们的结果[3]。这表明正常对照组D细胞免疫反应产物较钞是由于基因表达水平较低所致，而不是由于激素释放增加所致。自然恢复组胃粘膜D细胞杂交信号较强，杂交显色程度介于对照组与脾虚组之间，表明mRNA的表达量较高，而且细胞密度略有降低，但与脾虚组接近。中药治疗组D细胞杂交产物少，细胞显色浅，表示mRNA的表达较弱，细胞密度降低，与对照组相似，两组无显著性差异(P>0.05)。这说明加味四君子汤能调节D细胞生长抑素mRNA的表达，使脾虚证出现的症理变化，如生长抑素分泌失调得到纠正。
, 百拇医药
生长抑素的主要作用是对多种激素的释放起抑制作用，但不影响激素的合成[13]。此外它对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和唾液淀粉酶等释放起抑制作用[14]，并对小肠吸收糖、氨基酸、甘油三酯和离子起抑制作用。近来也有报道，生长抑素也抑制胃泌素mRNA的表达[15]。正常状态下，生长抑素合成和分泌处于较低水平的动态平衡，使消化吸收处于正常状态。本研究证明，当动物处于脾虚体征明显的阶段时，胃粘膜D细胞生长抑素mRNA表达高，生长抑素合成增多。当激素合成达到一定程度时，可能进入释放阶段。由此推测，激素的合成和释放存在一个动态循环，可能在某一时间以合在为主，另一时间以释放为主。对脾虚证病人和动物实验研究表明，脾虚症是以消化吸收功能低下为主的多器官和多系统功能减弱的综合病理变化[1]。我们的研究证明，脾虚证时生长抑素合成和分泌增强可能是脾虚发病的一个因素。但脾虚证时生长抑素与其他胃肠激素之间的相互关系如何，有待继续深入探讨。
收稿1997-04 修回1997-09
, 百拇医药
图版说明
图1 正常对照组HE染色显示胃窦粘膜结构 ×100
图2 正常对照组生长抑素mRNA阳性细胞稀疏分布在胃窦粘膜中下部，箭头示粘膜的基底面 ×100
图3 正常对照组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，分布稀疏 ×100
图4 脾虚组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，细胞密度大 ×100
图5 自然恢复组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，细胞密度低于脾虚组(图4)，但高于对照组(图3)，可见阳性细胞伸出突起(箭头) ×100
图6 中药治疗组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，细胞密度与对照组相近(图3) ×100
, 百拇医药
图7 正常对照组胃窦粘膜D细胞的mRNA杂交信号弱，胞质呈浅色 ×200
图8 脾虚组胃窦粘膜D细胞的mRNA交杂信号强，胞质呈深色 ×200
Explanation of figures
Fig.1 Light micrograph showing the structure of pyloric mucosa in normal control group.H E stain. ×100(A reference picture for visualization of the distribution of somatostatin mRNA positive cells)
Fig.2 Light micrograph showing the structure of pyloric mucosa in normal control group.Two arrows denote basal surface of mucosa.The somatostatin mRNA positive cells staned deeply and distribute in middle and basal parts of the mucosa.in situ hybridization. ×100
, 百拇医药
Fig.3 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing sparse distribution in pyloric mucosa of normal control group.in situ hybridization. ×100
Fig.4 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing higher cell density in pyloric mucosa of “spleen deficiency syndrome”group.in situ hybridization. ×100
Fig.5 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cell sin spontaneous recovery group,the cell density is lower than “spleen deficiency syndrome”group(Fig.4)and a cell process can be seen in a positive cell(arrow).in situ hybridization ×100
, http://www.100md.com
Fig.6 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing the cell densitiy in therapeutic group is approximate to normal control group(Fig.3).in situ hybridization ×100
Fig.7 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing the mRNA hybridization signal is relatively weak in control group.Some cells are deep in color,but other cells are various in shade.in situ hybridization. ×200
Fig.8 Light micrograph of somatostatin mRNA positive cells,showing the mRNA hybridization signal is strong in experimental spleen deficiency syndrome group.The cell density is higher and all positive cells stained deeply.in situ hybridization. ×200
, http://www.100md.com
* 北京市中医管理局资助课题(No.JX95305)
参考文献
[1]吴咸中，高金亮主编.脾虚证的现代研究.天津：天津科技译证出版社，1992：2～11，255～256
[2]危北海主编.中医脾胃学说——胃.北京：北京出版社，1994：79～97
[3]王秀琴，杨 进、刘绍杰等.大鼠实验性脾虚证胃粘膜内分泌细胞变化的免疫组织化学研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1992，1(1)：49
[4]张忠兵，张学庸，陈希陶等.脾虚泄泻者肠粘膜中SP和VIP初步探讨.中国中西医结合杂志，1991，11(3)：144
[5]张学庸，张忠兵，陈希陶等.胃十二脂肠溃疡病患者胃窦G细胞和D细胞分布的研究.中华内科杂志，1984，23(4)：207
, http://www.100md.com
[6]Chayvialle JAP,Descos F,Bernard C,et al.Somatostatin in mucosa of stomach and duodenum in gastric duodenal disease.Gastroenterol,1978,75(1):13
[7]陈小野主编.实用中医证候动物模型学.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：184～189
[8]Hoefler H,Childers H,Montminy MR,et al.In situ hybridization method for the detection of somatostatin mRNA in tissue section using antisense RNA probes.Histochem J,1986,18(11-12):597
[9]Rombout JHW,Vander Grinten C P M,Peeze Binkhorst F M,et al.Immunocytochemical identification and localization of peptide hormones in the gastro-enteropancreatic(GEP)endocrine system of the mouse and a stomachless fish,Barbus conchonius.Histochemistry,1986,84(4～6):471
, 百拇医药
[10]苏慧慈著.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994：259～275
[11]陈诗书，汤雪明主编.医学细胞与分子生物学.上海：上海医科大学出版社，1995：379～386
[12]马建伟，徐丽梅，郝 刚等.脾虚证与血浆和胃窦组织中生长抑素关系探讨.实用中西医结合杂志，1995，8(11)：644
[13]Arnold R,Lankisch P C.Somatostatin and the gastrointestinal tract.Clin Gastroenterol,1980,9(3):733
[14]潘伯荣，张学庸.D细胞、生长抑素和胃肠道疾病.《国外医学》消化系疾病分册，1984，4(4)：206
[15]Larsson LI,Houggqqrd DM.Evidence for paracrine somatostatinergic regulation of gastrin gene expression by double-staining cytochemistry and quantitation.J Histochem Cytochem,1994,42(1):37
, http://www.100md.com
IN SITU HYBRIDIZATION STUDY ON SOMATOSTATIN mRNA
EXPRESSION IN GASTRIC MUCOSA IN “EXPERIMENTAL
SPLEEN DEFICIENCY SYNDROME”RATS
Wang Xiuqin△,Zeng Xiaopei,Shang Hongwei,Wang Xingcui,Yan Jin
(Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing)
In this study,24 adult Wistar rats were used and divided into 4 groups:(1)normal control group;(2)“experimental spleen deficiency syndrome”group induced by rhubarb combined with imbalance of food supply;(3)spontaneous recovery group;and (4)therapeutic group treated with Chinese herbs——“plus si jun zi decoction”.Small tissue pieces from stomach of 4 groups were removed and processed for in situ hybridization with digoxigenin labelled somatostatin cRNA probe.The hybridization reactivity in the positive cells was measured by microspectrocytophotometer(MPV-COMBI,Leica) and the density of positive cells was counted by micrometry.The results show that the hybridization reactivity and the density of somatostatin mRNA positive cells(D cell)in the “experimental spleen deficiency syndrome” group are higher than the normal control group,and statistical analysis shows significant difference between the two groups(P<0.01).As compared with the spontaneous recovery group,the expression of somatostatin mRNA in the therapeutic group is approximate to the normal control group.This study demonstrates both the expression of somatostatin mRNA and the density of D cells are higher in “experimental spleen deficiency syndrome”group than the normal control group,and suggests the change of gene expression of somatotatin leads to the hormonal disorder.
KEY WORDS Somatotatin;D cell;Gastric mucosa;“Experimental Spleen Deficiency Syndrome”;In situ hybridization;Rat
△ Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China, 百拇医药
单位：首都医科大学组织学胚胎学教研室，北京 100054
关键词：生长抑素；D细胞；胃粘膜；实验性脾虚证；原位杂交；大鼠
解剖学报980316 摘 要 为探讨脾虚证时生长抑素分泌失常的机理，用Wistar雄性大鼠24只，分为正常对照组、实验性脾虚组、自然恢复组和中药治疗组。4组动物同时处死，取胃制成恒冷箱切片，以地高辛标记的生长抑素cRNA为探针，用原位杂交法显示胃粘膜D细胞中的生长抑素mRNA，并对细胞内杂交信号进行了显微分光光度计测定。结果表明，与对照组相比，脾虚组胃粘膜D细胞mRNA表达增强，细胞密度增大。与自然恢复组相比，中药治疗组的D细胞mRNA的表达和细胞密度与对照组相近。本研究提示，脾虚证大鼠胃粘膜D细胞生长抑素mRNA的高表达导致生长抑素合成增高，并对其意义进行了讨论。
, http://www.100md.com
近年来，对于脾虚证机理的研究，多以脾胃学说的“胃主受纳，主降；脾主运化，主升”；“内伤脾胃，百病由生”[1]理论出发。对脾虚证病人及实验性脾虚动物进行了消化吸收障碍机理的研究[2]。我们和一些学者的研究表明，动物实验和脾虚证病人消化道胃肠激素分泌出现异常[3，4]，可能是导致消化吸收障碍的重要原因。已有报道，在消化性溃疡、萎缩性胃炎时D细胞减少[5，6]。本室先前的工作证实，实验性脾虚证时胃幽门粘膜D细胞内生长抑素含量增多[3]。目前对脾虚证明胃肠激素分泌失常，尚无基因调控的实验依据。为此本研究用地高辛标记的生长抑素(SOM)mRNA探针，观察脾虚证大鼠胃粘膜D细胞生长抑素mRNA表达，意图进一步探讨脾虚证生长抑素分泌失常的机理。
材料和方法
1.实验动物分组
成年雄性Wistar大鼠(Ⅱ级动物，中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供)24只，体重130～150g,随机分为4组：对照组5只，实验脾虚组7只，自然恢复组6只，中药治疗组6只。实验性脾虚组用破气苦降药和饮食失节相结合的方法[7]，并稍增加了大黄的剂量，致成脾虚动物模型。破气苦降药按厚朴：枳实：大黄为3∶3∶3的比例，冷水浸泡20min，煮沸20min，过滤浓缩成100%煎剂(含生药1kg/L)，隔日灌服，1日2次，每次3ml(药量为2g生药/100g体重)，喂药当日禁食，次日自由进食，喂养42d，致成脾虚证模型。对照组按脾组法灌服自来水，每次3ml,但饮食不限，饲养42d。中药治疗组为在致成脾虚证后，用加味加君子汤[7]治疗。汤剂成分的比例为炙黄芪：党参：伏苓：炒白术：炙甘草=2∶2∶2∶2∶1的比例，制成100%煎剂，隔日灌服，每日2次，每次3ml(药量相当于1.5g生药/100g体重)，正常饮食，喂养21d。自然恢复组按治疗组法灌服自来水、剂量及时间同治疗组。4组动物于1d\,21d和42d时称量体重。
, 百拇医药
2.取材和制片
4组动物同时取材，取材前禁食12h。于腹腔注射6%水合氯醛(0.5mol/100g体重)麻醉后，心脏取血处死。取胃沿胃小弯剪开，用生理盐水洗净胃内容物，沿胃长轴取宽约6mm、长约1.5cm的组织块，液氮骤冷，保存于-20℃～-40℃冰箱，次日制恒冷箱切片，厚10μm，裱贴于涂有含焦碳酸二乙酯(DEPC)的明胶的载玻片上，室温吹干，4%多聚甲醛固定20min,70%乙醇固定10min。然后进行原位杂交。
3.原位杂交程序(按Hoefler方法进行[8]
3.1 杂交前处理：切片依次入PBS(pH7.2)漂洗4次，每次5min;0.1mol/L甘氨酸(PBS配制)5min；0.4%Triton X-100(PBS配制)室温漂洗15min;1mg/L蛋白酶K 37℃消化30min;4%多聚甲醛5min;PBS漂洗2次，每次5min;0.25%乙酸酐(0.1mol/L，用三乙醇胺新鲜配制)室温10min;2×SSC 10min。
, 百拇医药
3.2 杂交：滴加0.5mg/L地高辛标记的生长抑素cRNA探针(上海第二军医大学组织学胚胎学教研室制试剂盒)的杂交液，覆盖Parafilm膜，置湿盒内于43℃杂交12～16h。 3.3 杂交后处理：杂交后的式片依次入4×SSC，37℃,15min;含RNase A的2×SSC(20mg/L)，37℃,30min,用以消化多余的探针；入1×SSC和0.5×SSC，37℃各15min；0.05mol/L PBS 室温洗3次，每次5min。将碱性酶酶标记的抗地高辛抗体(来源同cRNA探针试剂盒，1∶1 000稀释)滴在切片上，用Parafilm膜覆盖，置湿盒内室温孵育4h。然后依次入0.05mol/L PBS，4次，每次5min;TSM12次，每次5min；TSM22次，每次5min。滴加NBT(硝基四氮唑蓝，400mg/L)和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸，200mg/L)混合液，置湿盒内避光显色3～4h；入0.05mol/L PBS 漂洗2次，每次5min；双蒸水洗；甘油明胶封片。
, 百拇医药
4.原位杂交阴性对照
杂交液免去地高辛标记的cRNA探针或杂交前用RNaseA，37℃处理30min。
5.定量分析
5.1 杂交信号定量分析：将4组动物杂交阳性细胞用显微分光光度计(MPV-COM，BI，Leica)作定量测定。显微放大倍数为10×40。每组各测5例动物，每例随机测50个细胞，将测得的平均光密度值(MOD)作统计学分析。
5.2 细胞密度测定：普通光学显微镜10×10放大倍数下，用0.1×0.1mm的网格目镜测微尺，将测微尺的一侧置于胃粘膜的基底面，从胃幽门开始，连续测量10个测量尺面积的区域，计数这些区域的阳性细胞数，然后计算出细胞密度。所得数据作方差分析。
结 果
, 百拇医药
1.脾虚动物模型的复制
大鼠灌服致脾虚的中药煎剂后，第3d开始，喂药当日出现软便，次日恢复。随着造模时间延长，喂药当日出现溏便，次日可见软便。20d以后可见溏便脏尾、懒动、毛枯槁无滑、食欲减退、拱背、体重增长缓慢；随着时间延长，这些体症逐渐加重。脾虚组动物出现的这些体征与临床脾虚证所见相似。30d后，偶有动物死亡，但模型成功率一般不低于95%。灌服加味四君子汤后，大鼠出现的体征明显减轻并好转。溏便恢复较快、食量增加、毛光滑、体重增加较馔 。自然恢复组动物的体征不如治疗组恢复快。各组动物的体重见表1。对各组动物体重的统计学分析，结果为脾虚组动物体重明显低于对照组(P<0.01)。中药治疗组动物体重增加高于自然恢复组，但与对照组相比有差异(P<0.05)，说明未恢复到正常水平。
表1 4组动物的体重变化
Table 1 Changes of body weight in 4 groups animals 组别
, 百拇医药
group
动物只数
number of animals
体 重(g) (
±s)body weight (g)体重增长量(g)(
±s)body weight grown(g)
致脾虚证天数
days of spleen deficiency induced
, 百拇医药
中药治疗天数
days of Chinese herbs treatment
对照组
normal control group
15
134.267±7.285
354.0±30.624
219.733±30.082
脾虚组
spleen deficiency syndrome group
27
, 百拇医药
129.593±7.143
204.741±34.135
75.296±33.569*
自然恢复组
spontaneous recovery group
15
212.267±22.154
327.4±19.675
115.133±17.639
中药治疗组
therapeutic group
, http://www.100md.com
15
234.2±25.18
380.933±38.951
148.667±28.928**
* 42d脾虚组与对照组相比，P<0.01 ** 21d中药治疗组接近于对照组，但两组的差异具有显著性，P<0.05 * as compared with normal control group,P<0.01 ** as compared with normal control group,P<0.052.组织学观察
光镜下未见胃幽门粘膜异常(图1)，可见生长抑素mRNA杂交阳性细胞(D细胞)分布于胃窦粘膜的中下层，数目多(图2)。胃底和胃体粘膜阳性细胞较少，散在于粘膜中。阳性细胞轮廓清楚，多呈圆形、椭圆形、梭形或不规则形，有的细胞可见伸出突起(图5)。阳性细胞胞质内含有蓝紫色的碱性磷酸酶反应产物，呈细颗粒状，有的细胞呈深色，有的呈浅色。胞核为阴性。大多数细胞核被反应产物所掩盖，也可见少数细胞核无反应产物掩盖。阴性对照切片不着色，表明无杂交阳性反应产物。正常对照线胃窦粘膜内杂交阳性D细胞胞质呈浅蓝色，表示杂交信号弱。细胞少，分布稀疏(图3，7)且密底低。实验性脾虚组胃窦粘膜内杂交阳性细胞呈深蓝色，表示杂交信号强，细胞数目多且密度增大(图4，8)。自然恢复组胃窦粘膜内杂交阳性细胞比对照组染色深，但比脾虚组染色浅，表示杂交信号比对照组强，而弱于脾虚组(图5)。中药治疗组胃窦粘膜内杂交阳性细胞呈浅蓝色，表示杂交信号弱。细胞密度低(图6)，与对照组相近。4组动物胃体和胃底粘膜杂交阳性细胞稀少，杂交反应与胃窦的相似。
, http://www.100md.com
3.杂交信号和细胞密度的测定
用显微分光光度计测定4组动物杂交反应产物的光密度值(平均光密度值，MOD)，结果见表2。统计学处理表明，脾虚组MOD值明显高于对照组(P<0.01)，有显著性差异。中药治疗组的MOD值低于自然恢复组(P<0.01)有显著性差异，与对照组相近(P>0.05)，差异无显著性意义。
4组动物胃粘膜D细胞密度测定的结果见表3。与对照组相比，脾虚组D细胞密度增大(P<0.01)，有显著性差异。与自然恢复组相比，中药治疗组D细胞数目减少，细胞密度降低(P<0.01)差异显著，与对照组相似(P>0.05)，差异无显著性。
表2 胃粘膜内D细胞生长抑素mRNA表达的定量测定
Table 2 Quantitative measurement of somatostatin mRNA expression of D cells in gastric mucosa 组别group
, 百拇医药
动物只数
number of
animals
测定细胞数
cell number
measured
MOD(
±s)对照组(normal control group)
5
250
0.477±0.147
, 百拇医药
脾虚组(spleen deficiency syndrome group)
5
250
0.736±0.225*
自然恢复组(spontaneous recovery group)
5
250
0.775±0.169
中药治疗组(therapentic group)
5
250
, 百拇医药
0.498±0.064**
* 脾虚组与对照组相比，P<0.01 **中药治疗组与对照组相比，P>0.05；中药治疗组与自然恢复组比较，P<0.01 * as compared with normal control group,P<0.01 ** as compared with normal control group,P>0.05 ** as compared with spontaneous recovery group P<0.01MOD.平均光密度值(mean optic density)表3 胃粘膜D细胞杂交阳性细胞密度的测定
Table 3 Cell density of smatiostatin mRNA positive
D cells in gastric mucosa 组别
, http://www.100md.com
group
动物数
number of
animals
测定细胞数
number of
areas
细胞密度(
±s)cell density
对照组(normal control group)
5
, 百拇医药
50
0.458±0.137
脾虚组(spleen deficiency syndrome group)
5
50
1.418±0.332*
自然恢复组(spontaneous recovery group)
5
50
1.038±0.262
中药治疗组(therapentic group)
, 百拇医药
5
50
0.564±0.144**
* 脾虚组与对照组相比，P<0.01 **中药治疗组与对照组相比，P>0.05；与自然恢复组相比，P<0.01
as compared with morntal controt group,P<0.01as compared with normal control group,P>0.05；as compared with spontaneous recovery group,P>0.01讨论
已知，胃肠道存在多种内分泌细胞，它们分泌不同的肽类激素[9]，对食物的消化吸收起着重要的调节作用。目前，对肽和蛋白质激素的研究，已从肽和蛋白的翻译水平深入到基因的转录水平[10]。本研究用地高辛标记的生长抑素cRNA为探针，观察了胃粘膜D细胞生长抑素mRNA的转录变化。结果证明，与对照组相比，脾虚组胃粘膜D细胞的密度增高，杂交信号强；经定量测定，杂交产物含量高于对照组，且细胞密度高，表明脾虚组D细胞内mRNA表达增强。细胞内mRNA的表达水平反映DNA分子上编码其肽链的基因转录水平[11]。这表明脾虚组D细胞内编码生长抑素的基因处于较高的转录水平。从基因转录出的mRNA直接参与蛋白质和多肽的翻译和合成。由于脾虚组D细胞内mRNA增多，可使生长抑素的合成增强，这与我们先前对D细胞的免疫组织化学的研究结果一致[3]。马建伟等[12]报道，临床脾虚病人和脾虚动物，胃窦组织和血清中生长抑素含量都高于对照组，也支持我们的结果[3]。这表明正常对照组D细胞免疫反应产物较钞是由于基因表达水平较低所致，而不是由于激素释放增加所致。自然恢复组胃粘膜D细胞杂交信号较强，杂交显色程度介于对照组与脾虚组之间，表明mRNA的表达量较高，而且细胞密度略有降低，但与脾虚组接近。中药治疗组D细胞杂交产物少，细胞显色浅，表示mRNA的表达较弱，细胞密度降低，与对照组相似，两组无显著性差异(P>0.05)。这说明加味四君子汤能调节D细胞生长抑素mRNA的表达，使脾虚证出现的症理变化，如生长抑素分泌失调得到纠正。
, 百拇医药
生长抑素的主要作用是对多种激素的释放起抑制作用，但不影响激素的合成[13]。此外它对胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和唾液淀粉酶等释放起抑制作用[14]，并对小肠吸收糖、氨基酸、甘油三酯和离子起抑制作用。近来也有报道，生长抑素也抑制胃泌素mRNA的表达[15]。正常状态下，生长抑素合成和分泌处于较低水平的动态平衡，使消化吸收处于正常状态。本研究证明，当动物处于脾虚体征明显的阶段时，胃粘膜D细胞生长抑素mRNA表达高，生长抑素合成增多。当激素合成达到一定程度时，可能进入释放阶段。由此推测，激素的合成和释放存在一个动态循环，可能在某一时间以合在为主，另一时间以释放为主。对脾虚证病人和动物实验研究表明，脾虚症是以消化吸收功能低下为主的多器官和多系统功能减弱的综合病理变化[1]。我们的研究证明，脾虚证时生长抑素合成和分泌增强可能是脾虚发病的一个因素。但脾虚证时生长抑素与其他胃肠激素之间的相互关系如何，有待继续深入探讨。
收稿1997-04 修回1997-09
, 百拇医药
图版说明
图1 正常对照组HE染色显示胃窦粘膜结构 ×100
图2 正常对照组生长抑素mRNA阳性细胞稀疏分布在胃窦粘膜中下部，箭头示粘膜的基底面 ×100
图3 正常对照组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，分布稀疏 ×100
图4 脾虚组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，细胞密度大 ×100
图5 自然恢复组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，细胞密度低于脾虚组(图4)，但高于对照组(图3)，可见阳性细胞伸出突起(箭头) ×100
图6 中药治疗组胃窦粘膜内生长抑素mRNA阳性细胞，细胞密度与对照组相近(图3) ×100
, 百拇医药
图7 正常对照组胃窦粘膜D细胞的mRNA杂交信号弱，胞质呈浅色 ×200
图8 脾虚组胃窦粘膜D细胞的mRNA交杂信号强，胞质呈深色 ×200
Explanation of figures
Fig.1 Light micrograph showing the structure of pyloric mucosa in normal control group.H E stain. ×100(A reference picture for visualization of the distribution of somatostatin mRNA positive cells)
Fig.2 Light micrograph showing the structure of pyloric mucosa in normal control group.Two arrows denote basal surface of mucosa.The somatostatin mRNA positive cells staned deeply and distribute in middle and basal parts of the mucosa.in situ hybridization. ×100
, 百拇医药
Fig.3 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing sparse distribution in pyloric mucosa of normal control group.in situ hybridization. ×100
Fig.4 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing higher cell density in pyloric mucosa of “spleen deficiency syndrome”group.in situ hybridization. ×100
Fig.5 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cell sin spontaneous recovery group,the cell density is lower than “spleen deficiency syndrome”group(Fig.4)and a cell process can be seen in a positive cell(arrow).in situ hybridization ×100
, http://www.100md.com
Fig.6 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing the cell densitiy in therapeutic group is approximate to normal control group(Fig.3).in situ hybridization ×100
Fig.7 Light micrograph of the somatostatin mRNA positive cells,showing the mRNA hybridization signal is relatively weak in control group.Some cells are deep in color,but other cells are various in shade.in situ hybridization. ×200
Fig.8 Light micrograph of somatostatin mRNA positive cells,showing the mRNA hybridization signal is strong in experimental spleen deficiency syndrome group.The cell density is higher and all positive cells stained deeply.in situ hybridization. ×200
, http://www.100md.com
* 北京市中医管理局资助课题(No.JX95305)
参考文献
[1]吴咸中，高金亮主编.脾虚证的现代研究.天津：天津科技译证出版社，1992：2～11，255～256
[2]危北海主编.中医脾胃学说——胃.北京：北京出版社，1994：79～97
[3]王秀琴，杨 进、刘绍杰等.大鼠实验性脾虚证胃粘膜内分泌细胞变化的免疫组织化学研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1992，1(1)：49
[4]张忠兵，张学庸，陈希陶等.脾虚泄泻者肠粘膜中SP和VIP初步探讨.中国中西医结合杂志，1991，11(3)：144
[5]张学庸，张忠兵，陈希陶等.胃十二脂肠溃疡病患者胃窦G细胞和D细胞分布的研究.中华内科杂志，1984，23(4)：207
, http://www.100md.com
[6]Chayvialle JAP,Descos F,Bernard C,et al.Somatostatin in mucosa of stomach and duodenum in gastric duodenal disease.Gastroenterol,1978,75(1):13
[7]陈小野主编.实用中医证候动物模型学.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：184～189
[8]Hoefler H,Childers H,Montminy MR,et al.In situ hybridization method for the detection of somatostatin mRNA in tissue section using antisense RNA probes.Histochem J,1986,18(11-12):597
[9]Rombout JHW,Vander Grinten C P M,Peeze Binkhorst F M,et al.Immunocytochemical identification and localization of peptide hormones in the gastro-enteropancreatic(GEP)endocrine system of the mouse and a stomachless fish,Barbus conchonius.Histochemistry,1986,84(4～6):471
, 百拇医药
[10]苏慧慈著.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994：259～275
[11]陈诗书，汤雪明主编.医学细胞与分子生物学.上海：上海医科大学出版社，1995：379～386
[12]马建伟，徐丽梅，郝 刚等.脾虚证与血浆和胃窦组织中生长抑素关系探讨.实用中西医结合杂志，1995，8(11)：644
[13]Arnold R,Lankisch P C.Somatostatin and the gastrointestinal tract.Clin Gastroenterol,1980,9(3):733
[14]潘伯荣，张学庸.D细胞、生长抑素和胃肠道疾病.《国外医学》消化系疾病分册，1984，4(4)：206
[15]Larsson LI,Houggqqrd DM.Evidence for paracrine somatostatinergic regulation of gastrin gene expression by double-staining cytochemistry and quantitation.J Histochem Cytochem,1994,42(1):37
, http://www.100md.com
IN SITU HYBRIDIZATION STUDY ON SOMATOSTATIN mRNA
EXPRESSION IN GASTRIC MUCOSA IN “EXPERIMENTAL
SPLEEN DEFICIENCY SYNDROME”RATS
Wang Xiuqin△,Zeng Xiaopei,Shang Hongwei,Wang Xingcui,Yan Jin
(Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing)
In this study,24 adult Wistar rats were used and divided into 4 groups:(1)normal control group;(2)“experimental spleen deficiency syndrome”group induced by rhubarb combined with imbalance of food supply;(3)spontaneous recovery group;and (4)therapeutic group treated with Chinese herbs——“plus si jun zi decoction”.Small tissue pieces from stomach of 4 groups were removed and processed for in situ hybridization with digoxigenin labelled somatostatin cRNA probe.The hybridization reactivity in the positive cells was measured by microspectrocytophotometer(MPV-COMBI,Leica) and the density of positive cells was counted by micrometry.The results show that the hybridization reactivity and the density of somatostatin mRNA positive cells(D cell)in the “experimental spleen deficiency syndrome” group are higher than the normal control group,and statistical analysis shows significant difference between the two groups(P<0.01).As compared with the spontaneous recovery group,the expression of somatostatin mRNA in the therapeutic group is approximate to the normal control group.This study demonstrates both the expression of somatostatin mRNA and the density of D cells are higher in “experimental spleen deficiency syndrome”group than the normal control group,and suggests the change of gene expression of somatotatin leads to the hormonal disorder.
KEY WORDS Somatotatin;D cell;Gastric mucosa;“Experimental Spleen Deficiency Syndrome”;In situ hybridization;Rat
△ Department of Histology and Embryology,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China, 百拇医药