生后小鼠颌下腺神经生长因子基因表达的发育变化
作者：陆 璐 丁 斐* 曹 铮* 顾 静*顾晓松* 汪家政** 范 明**
单位：南通医学院组织学胚胎学教研室，*分子生物学教研室，南通 226001；**军事医学科学院基础医学研究所，北京
关键词：神经生长因子；颌下腺；发育；原位杂交；小鼠
解剖学报980314 摘 要 为了探讨在发育过程中小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)基因表达的变化，应用原位杂交组织化学技术和图像分析方法对新生至2月龄ICR雄性小鼠颌下腺NGF mRNA的相对含量及分布进行研究。结果显示：新生小鼠颌下腺未见NGF mRNA杂交信号，8～10d龄小鼠颌下腺NGF原位杂交信号呈阴性至弱阳性。12～14d龄小鼠颌下腺NGF原位杂交信号呈弱阳性，分布于纹状管上皮细胞胞浆中。1月龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号均呈阳性，位于细胞核周围胞浆中。2月龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号呈强阳性，主要分布在上皮细胞核下部胞浆。实验结果提示，雄性小鼠颌下腺NGF基因在生后1～2周龄间开始转录，NGF mRNA含量在2月以前随年龄的增长而增多。
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神经生长因子(NGF)是调节神经系统重要的生物活性分子之一，大量的体外实验证实它是周围神经系统交感神经元、感觉神经元及中枢神经系统胆碱能神经元发育、分化、行使正常功能必不可少的营养分子[1]。近来研究表明，NGF还参与调节免疫、造血、内分泌和生殖等系统的功能[2]。NGF广泛存在于动物体内，以成年雄性小鼠颌下腺中含量最高。颌下腺合成与分泌的NGF一部分随唾液进入消化道，一部分直接进入血液发挥生物学作用。颌下腺NGF的含量受到多种激素和年龄变化的影响。甲状激素、雄性激素、肾上腺皮质激素等都对颌下腺NGF的合成具有调节作用[3,4]。尽管NGF已研究多年，但对NGF合成的基因调节及其调节的分子机理还不十分清楚，随着现代分子生物学技术的发展，使人们有可能从分子水平对NGF作进一步深入研究。新生小鼠颌下腺不存在NGF蛋白，在生长发育过程中NGF逐渐出现,并随着年龄的增长而增多[2]。本实验采用地高辛(digoxigenin,dig)标记的人(human,h) NGF\-βDNA探针，检测新生至2月龄ICR雄性小鼠颌下腺NGF mRNA的相对含量及分布，以探讨生长发育过程中颌下腺NGF基因表达的变化。
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材料和方法
1.h NGFβDNA探针的制备
将hNGFβDNA基因片段克隆入PUC19质粒，转入JM103菌种(上述3种材料均由军事医学科学院基础医学研究所提供)，体外培养扩增，收集后用碱性法裂解细菌，酚-氯仿-异戊醇分步抽提法提取质粒DNA，纯化后经HindⅢ内切酶线性化作模板备用。按照Ullrich[5]报道的人NGF 基因DNA序列，分别合成两个19聚核苷酸引物，编码区为38-56的片段和346-364的片段，其核苷酸序列分别为：引物1，5′-GAATTCTCGGTGTGTGACA-3′；引物2，5′-CTATCTCACAGCCTTCCTG-3′。以人NGF基因片段为模板，使用地高辛标记探针试剂盒(Boehringer公司)，通过PCR扩增方法[6]制备dig-h NGF\-βDNA探针。
2.标本制备与处理
, http://www.100md.com 选用新生和生后8～10d、12～14d、1月、2月雄性ICR小鼠各8只(由本院实验动物中心提供)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理盐水经左心室快速冲洗，4%多聚甲醛-0.1mol/L PBS灌注，取颌下腺后固定数小时，0.1mol/L PBS漂洗后入10%～30%苷糖-0.1mol/L PBS过夜，常规冰冻切片(厚(10～15 μm),裱贴于原位杂交专用载玻片上，4℃冰箱贮存备用。
3.原位杂交
参照陆璐[7]方法进行。主要步骤如下：0.3%Triton X-100 10min,蛋白酶K(1mg/L)37℃30min，43℃预杂交1h，43℃杂交12～16h。4×SSC 至0.1×SSC梯度漂洗各2×10min。抗地高辛抗血清-碱性磷酸酶(anti-Dig-AP)结合物(1∶500)4℃过夜，以硝基蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)显色(含左旋咪唑0.5g/L)。阴性对照以预杂交液代替杂交液和用无关DNA探针代替NGF DNA探针，其余步骤同实验组。
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4.图像分析
应用AST 386-25和PCVISION PLUS图像处理卡(美国Imaging技术公司)组成的图像处理系统，通过Olympus BP-2显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统。每张切片抽取10个视野，分别测量不同年龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管的直径、面积以及原位杂交阳性信号的灰度值(定义为灰度值越小，阳性反应越强)。调节电压、光圈，使各切片在相同条件下测量。结果以Kewman-Kleuls法进行统计学分析。
结 果
在ICR小鼠颌下腺内，dig-h NGFβDNA探针与其互补的mRNA杂交信号主要分布在纹状管和颗粒曲管的上皮细胞，呈蓝色或紫蓝色颗粒，位于细胞的胞浆中。新生小鼠颌下腺管道系统较细，部分呈闭合状态，未见NGF杂交信号(图1)。8～10d龄小鼠颌下腺纹状管细长，分支较少，NGF原位杂交信号呈阴性或弱阳性(图2)。12～14d小鼠颌下腺的纹状管NGF原位杂交信号均呈弱阳性，大部分分布于细胞基底部，小部分位于近腔面胞质中(图3)。1月龄小鼠颌下腺纹状管管径明显发育增粗，分支增多，部分纹状管管径扩大转变成颗粒曲管。纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号明显增强，位于细胞核周围胞浆中(图4，5)。2月龄小鼠大部分纹状管进一步增粗、弯曲，发育成颗粒曲管，在同一视野可看到许多粗大而分支的管腔，颗粒曲管上皮细胞呈高柱状，境界清楚，细胞核位于细胞的下1/3。NGF原位杂交信号更强，主要集中在上皮细胞下半部胞浆内(图6，7)。颗粒曲管上皮细胞原位杂交信号的强度不尽相同，有些很强，有些较弱，未加dig-h NGFβDNA探针和以无关DNA探针代替NGF DNA探针的对照组颌下腺切片均无杂交信号(图8，9)。
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图像分析结果显示，雄性小鼠颌下腺导管的直径及面积在生长发育过程中增长较快，尤其是在出生2周后成倍增长，2月龄小鼠颗粒曲管的面积比12～14d小鼠纹状管的面积增大8倍左右，较1月龄小鼠增大3倍左右。dig-h NGFβDNA探针原位杂交信号的灰度值在12～14d龄小鼠和新生小鼠之间出现明显差异(P<0.05)，此后灰度值持续减少，12～14d龄小鼠与1月龄小鼠以及1月龄小鼠与2月龄小鼠之间均存在明显差异(附表)。
附表 小鼠颌下腺生长发育阶段分泌导管图像分析参数(
±s)
Table Morphometry analysis of submandibular gland secretory duct of
mice during postnatal development 组别
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groups
视野数(个)
numbers
平均直径(μm)
average diameter
平均面积(μm2)
average area
平均灰度
average IOD
1d龄(1day)
10
9.53±1.41
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73.48±22.45
198.00±12.97
8～10d龄(8-10 days)
10
12.23±1.94
130.59±39.12
192.80±9.52
12～14d龄(12-14 days)
10
15.03±2.53
176.27±39.51
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184.60±10.75
1月龄(1month)
10
22.06±3.58
391.84±118.15
153.45±8.71
2月龄(2 months)
10
42.60±9.94
1533.69±698.68
128.34±9.32
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注：(1)平均灰度值，8～10d龄组与1d龄组和12～14d龄组之间比，均P>0.05。1d龄组与12～14d龄组比，P<0.05。其余各组间比，均P<0.01。(2)平均直径和平均面积各组间比，均P<0.01。
(1)Average IOD comparison between day 8-10 group and day 1 group and between day 8-10 group and day 12-14 group,P>0.05,between day 1 group and day 12-14 group,P<0.05;among the rest groups,P<0.01.(2)Average diameter and average area comparison among every groups,P<0.01.讨 论
NGF是一种体液因子，最初由Bucker和Montalcini于40年前在小鼠肉瘤组织中发现，由于它对鸡胚背根节和交感神经节的生长发育有明显的促进作用，故命名为神经生长因子(nerve growth factor,NGF)。在以后的研究中发现NGF广泛存在于动物正常组织中，大量的实验又证明NGF及NGF mRNA在大多数外周组织和神经系统中的分布与NGF敏感神经纤维的分布相一致，即NGF具有靶源性神经营养作用，但也有相当一部分组织例外，这些组织包括唾液腺、前列腺、精囊腺、睾丸、卵巢、骨髓、脾等多种非神经系统的器官，其中以成年雄性小鼠颌下腺内NGF的含量最高，这提示NGF是一个多功能的生长因子。为什么小鼠颌下腺中含有较高水平的NGF以及颌下腺合成的NGF的功能作用尚不十分清楚。人们对小鼠、大鼠、人等颌下腺NGF的氨基酸序列、亚基特点、生物合成及受体的特性、分布和合成等已进行了广泛的研究[8,9]，但有关颌下腺NGF基因水平的研究则时间不长。小鼠和人NGF基因于80年代才被克隆成功，此后大鼠和一些其他动物的NGF基因也相继被克隆[5,10]。在克隆出的几种动物NGF基因中，人们发现小鼠与人的NGF基因最为相似。两者的核苷酸序列和氨基酸排列具有高度同源性。我们利用dig-h NGF\-βDNA探针，对NGF基因在小鼠颌下腺中的表达和在发育过程中的变化进行了研究，结果显示NGFmRNA定位于纹状管和颗粒曲管的上皮细胞中。在出生1周内尚无NGF mRNA转录。在出生后1～2周雄性小鼠颌下腺中，纹状管NGF原位杂交信号已开始呈现，但很弱。生后1月龄的雄性小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号迅速增强。2月龄雄性小鼠大部分纹状管已发育形成管道高度弯曲、管径明显增粗的颗粒曲管[11]，NGF原位杂交信号在颗粒曲管中很强。这表明雄性小鼠在出生后1～2周期间颌下腺中NGF mRNA开始从DNA转录，此后逐渐增加，1月龄左右的雄性小鼠颌下腺中NGF mRNA迅速增多，至2月龄时NGF mRNA继续保持高水平的转录。不同年龄的小鼠颌下腺中NGF蛋白的含量变化较大，新生小鼠颌下腺中不含NGF，在成年之前NGF随年龄的增大而增多，成年后达到最高水平[2]。从小鼠出生至成年，颌下腺中NGF mRNA的变化趋势与NGF蛋白含量的变化趋势基本相似，表明在小鼠生后发育中颌下腺NGF基因表达主要是由转录水平调控的。
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颌下腺NGF的合成受到多种激素的调控[12]，成年雄性小鼠颌下腺NGF含量大大高于雌性小鼠，在生长发育过程中雄性小鼠NGF及NGF mRNA含量的增加在性成熟期最为显著，表明在正常发育过程中，雄激素是调节颌下腺NGF合成的主要激素之一。雄激素能促进颌下腺纹状管细胞的增殖并促进纹状管细胞向颗粒曲管的分化，同时增加颌下腺的NGF基因转录[13]。因此，雄性小鼠性成熟后颌下腺NGF蛋白含量的迅速增加除NGF mRNA水平增高外，单位面积中颗粒曲管数量的增多也起着重要作用。我们在雌性小鼠颌下腺NGF mRNA表达研究中曾看到NGF mRNA的分布与雄性小鼠相同，主要存在于纹状管和颗粒曲管，但杂交信号明显弱于雄性小鼠，在有杂交信号的纹状管和颗粒曲管上皮细胞之间常可见到部分阴性细胞，杂交阳性管道的密度亦显著低于雄性小鼠[7]。上述发现也同时证明雄性激素在小鼠颌下腺NGF mRNA的表达及NGF合成中发挥着重要的作用。
Aloe 和Walker等[14，15]发现甲状腺激素也能增加成年和未成年小鼠颌下腺NGF的含量和浓度。Black[3]等人在实验中发现在甲状腺激素的作用下，小鼠颌下腺NGF含量的增加与NGF mRNA水平的提高基本呈平行关系，说明甲状腺激素对颌下腺NGF基因的调节与雄性激素相似，也发生在转录水平，它们的具体作用机理目前仍不十分明确。有学者认为雄激素和甲状腺激素主要通过与靶细胞上受体结合，形成激素-受体复合物，粘附于特异的DNA序列并与之相互作用，进而影响靶基因的转录。
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收稿1997-06 修回1998-01
图版说明
图1 新生小鼠颌下腺无NGF杂交信号 ×200
图2 10d龄小鼠颌下腺与dig-h NGF\-β DNA探针杂交，纹状管呈阴性或弱阳性信号 ×400
图3 12d龄小鼠颌下腺纹状管NGF杂交信号呈弱阳性 ×400
图4 1月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈阳性 ×200
图5 1月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈阳性 ×400
图6 2月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈强阳性 ×200
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图7 2月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈强阳性 ×400
图8 以预杂交液代替杂交液对照组，颌下腺未见杂交信号 ×400
图9 以无关探针原位杂交作对照组，颌下腺未见杂交信号 ×400
Explanation of figures
Fig.1 No hybridized signal for NGF mRNA could be seen in the submandibular gland of newborn mice. ×200
Fig.2 In situ hybridization of NGF mRNA showed negative or very weak signals in the secretory striated ducts of the 10th day mice. ×400
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Fig.3 In situ hybridization of NGF mRNA showed weak signals in the secretory striated ducts of the 12th day mice. ×400
Fig.4 In situ hybridization of NGF mRAN showed middle positive signals in granular convoluted tubules of the lst month mice. ×200
Fig.5 In situ hybridization of NGF mRAN showed middle positive signals in granular convoluted tubules of the lst month mice. ×400
Fig.6 In situ hybridization of NGF mRAN showed strong positive signals in granular convoluted tubules of the 2nd month mice. ×200
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Fig.7 In situ hybridization of NGF mRAN showed strong positive signals in granular convoluted tubules of the 2nd month mice. ×400
Fig.8 By using prehybridization solution to replace hybridization solution,no positive cell was observed in submandibular gland. ×400
Fig.9 By using non-relative probe,no hybridized signal was observed in submandibular gland. ×400
参考文献
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NERVE GROWTH FACTOR GENE EXPRESSION IN
SUBMANDIBULAR GLAND OF MICE DURING
POSTNATAL DEVELOPMENT
Lu Lu△,Ding Fei*,Cao Zheng*,Gu Jing*,Gu Xiaosong*,Wang Jiazheng**,Fan Ming**
(Department of Histology and Embryology,*Department of Molecular Biology,Nantong Medical
College,Nantong,**Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Sciences,Beijing)
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In order to explore the change of nerve growth factor(NGF)gene expression in the submandibular gland of male mice during development,the present study investigated the relative content and distribution of NGF mRNA in the submandibular glands of male ICR mice from the lst day of birth to 2nd month,by using in situ hybridization and morphometry.The results showed that no hybridized signal for NGF mRNA could be seen in the submandibular gland of newborn mice.In situ hybridization of NGF mRNA presented negative or very weak positive signals in some mice from the 8th day to 10th day and presented weak positive signals in all mice from the 12th day to 14th day.Their hybridized signals were localized in the secretory striated ducts.In situ hybridization of NGF mRNA is positive in the lst month mice and strong positive in the 2nd month mice.The hybridization signals were distributed in the granular convoluted tubules besides secretory striated ducts.The signal was extranuclear and was much stronger at the bases of cells.The study suggested that NGF gene in submandibular gland of male ICR mice began transcription from week 1 to week 2 after birth and the relative content increased as it developed before adult.
KEY WORDS Nerve growth factor;Submandibular gland;Development;In situ hybridization;Mouse;
△Department of Histology and Embryology,Nantong Medical College,Nantong 226001,China, http://www.100md.com(陆 璐 丁 斐* 曹 铮* 顾 静*顾晓松* 汪家政** 范 明**)
单位：南通医学院组织学胚胎学教研室，*分子生物学教研室，南通 226001；**军事医学科学院基础医学研究所，北京
关键词：神经生长因子；颌下腺；发育；原位杂交；小鼠
解剖学报980314 摘 要 为了探讨在发育过程中小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)基因表达的变化，应用原位杂交组织化学技术和图像分析方法对新生至2月龄ICR雄性小鼠颌下腺NGF mRNA的相对含量及分布进行研究。结果显示：新生小鼠颌下腺未见NGF mRNA杂交信号，8～10d龄小鼠颌下腺NGF原位杂交信号呈阴性至弱阳性。12～14d龄小鼠颌下腺NGF原位杂交信号呈弱阳性，分布于纹状管上皮细胞胞浆中。1月龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号均呈阳性，位于细胞核周围胞浆中。2月龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号呈强阳性，主要分布在上皮细胞核下部胞浆。实验结果提示，雄性小鼠颌下腺NGF基因在生后1～2周龄间开始转录，NGF mRNA含量在2月以前随年龄的增长而增多。
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神经生长因子(NGF)是调节神经系统重要的生物活性分子之一，大量的体外实验证实它是周围神经系统交感神经元、感觉神经元及中枢神经系统胆碱能神经元发育、分化、行使正常功能必不可少的营养分子[1]。近来研究表明，NGF还参与调节免疫、造血、内分泌和生殖等系统的功能[2]。NGF广泛存在于动物体内，以成年雄性小鼠颌下腺中含量最高。颌下腺合成与分泌的NGF一部分随唾液进入消化道，一部分直接进入血液发挥生物学作用。颌下腺NGF的含量受到多种激素和年龄变化的影响。甲状激素、雄性激素、肾上腺皮质激素等都对颌下腺NGF的合成具有调节作用[3,4]。尽管NGF已研究多年，但对NGF合成的基因调节及其调节的分子机理还不十分清楚，随着现代分子生物学技术的发展，使人们有可能从分子水平对NGF作进一步深入研究。新生小鼠颌下腺不存在NGF蛋白，在生长发育过程中NGF逐渐出现,并随着年龄的增长而增多[2]。本实验采用地高辛(digoxigenin,dig)标记的人(human,h) NGF\-βDNA探针，检测新生至2月龄ICR雄性小鼠颌下腺NGF mRNA的相对含量及分布，以探讨生长发育过程中颌下腺NGF基因表达的变化。
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材料和方法
1.h NGFβDNA探针的制备
将hNGFβDNA基因片段克隆入PUC19质粒，转入JM103菌种(上述3种材料均由军事医学科学院基础医学研究所提供)，体外培养扩增，收集后用碱性法裂解细菌，酚-氯仿-异戊醇分步抽提法提取质粒DNA，纯化后经HindⅢ内切酶线性化作模板备用。按照Ullrich[5]报道的人NGF 基因DNA序列，分别合成两个19聚核苷酸引物，编码区为38-56的片段和346-364的片段，其核苷酸序列分别为：引物1，5′-GAATTCTCGGTGTGTGACA-3′；引物2，5′-CTATCTCACAGCCTTCCTG-3′。以人NGF基因片段为模板，使用地高辛标记探针试剂盒(Boehringer公司)，通过PCR扩增方法[6]制备dig-h NGF\-βDNA探针。
2.标本制备与处理
, http://www.100md.com 选用新生和生后8～10d、12～14d、1月、2月雄性ICR小鼠各8只(由本院实验动物中心提供)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，生理盐水经左心室快速冲洗，4%多聚甲醛-0.1mol/L PBS灌注，取颌下腺后固定数小时，0.1mol/L PBS漂洗后入10%～30%苷糖-0.1mol/L PBS过夜，常规冰冻切片(厚(10～15 μm),裱贴于原位杂交专用载玻片上，4℃冰箱贮存备用。
3.原位杂交
参照陆璐[7]方法进行。主要步骤如下：0.3%Triton X-100 10min,蛋白酶K(1mg/L)37℃30min，43℃预杂交1h，43℃杂交12～16h。4×SSC 至0.1×SSC梯度漂洗各2×10min。抗地高辛抗血清-碱性磷酸酶(anti-Dig-AP)结合物(1∶500)4℃过夜，以硝基蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)显色(含左旋咪唑0.5g/L)。阴性对照以预杂交液代替杂交液和用无关DNA探针代替NGF DNA探针，其余步骤同实验组。
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4.图像分析
应用AST 386-25和PCVISION PLUS图像处理卡(美国Imaging技术公司)组成的图像处理系统，通过Olympus BP-2显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统。每张切片抽取10个视野，分别测量不同年龄小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管的直径、面积以及原位杂交阳性信号的灰度值(定义为灰度值越小，阳性反应越强)。调节电压、光圈，使各切片在相同条件下测量。结果以Kewman-Kleuls法进行统计学分析。
结 果
在ICR小鼠颌下腺内，dig-h NGFβDNA探针与其互补的mRNA杂交信号主要分布在纹状管和颗粒曲管的上皮细胞，呈蓝色或紫蓝色颗粒，位于细胞的胞浆中。新生小鼠颌下腺管道系统较细，部分呈闭合状态，未见NGF杂交信号(图1)。8～10d龄小鼠颌下腺纹状管细长，分支较少，NGF原位杂交信号呈阴性或弱阳性(图2)。12～14d小鼠颌下腺的纹状管NGF原位杂交信号均呈弱阳性，大部分分布于细胞基底部，小部分位于近腔面胞质中(图3)。1月龄小鼠颌下腺纹状管管径明显发育增粗，分支增多，部分纹状管管径扩大转变成颗粒曲管。纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号明显增强，位于细胞核周围胞浆中(图4，5)。2月龄小鼠大部分纹状管进一步增粗、弯曲，发育成颗粒曲管，在同一视野可看到许多粗大而分支的管腔，颗粒曲管上皮细胞呈高柱状，境界清楚，细胞核位于细胞的下1/3。NGF原位杂交信号更强，主要集中在上皮细胞下半部胞浆内(图6，7)。颗粒曲管上皮细胞原位杂交信号的强度不尽相同，有些很强，有些较弱，未加dig-h NGFβDNA探针和以无关DNA探针代替NGF DNA探针的对照组颌下腺切片均无杂交信号(图8，9)。
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图像分析结果显示，雄性小鼠颌下腺导管的直径及面积在生长发育过程中增长较快，尤其是在出生2周后成倍增长，2月龄小鼠颗粒曲管的面积比12～14d小鼠纹状管的面积增大8倍左右，较1月龄小鼠增大3倍左右。dig-h NGFβDNA探针原位杂交信号的灰度值在12～14d龄小鼠和新生小鼠之间出现明显差异(P<0.05)，此后灰度值持续减少，12～14d龄小鼠与1月龄小鼠以及1月龄小鼠与2月龄小鼠之间均存在明显差异(附表)。
附表 小鼠颌下腺生长发育阶段分泌导管图像分析参数(
±s)Table Morphometry analysis of submandibular gland secretory duct of
mice during postnatal development 组别
, http://www.100md.com
groups
视野数(个)
numbers
平均直径(μm)
average diameter
平均面积(μm2)
average area
平均灰度
average IOD
1d龄(1day)
10
9.53±1.41
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73.48±22.45
198.00±12.97
8～10d龄(8-10 days)
10
12.23±1.94
130.59±39.12
192.80±9.52
12～14d龄(12-14 days)
10
15.03±2.53
176.27±39.51
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184.60±10.75
1月龄(1month)
10
22.06±3.58
391.84±118.15
153.45±8.71
2月龄(2 months)
10
42.60±9.94
1533.69±698.68
128.34±9.32
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注：(1)平均灰度值，8～10d龄组与1d龄组和12～14d龄组之间比，均P>0.05。1d龄组与12～14d龄组比，P<0.05。其余各组间比，均P<0.01。(2)平均直径和平均面积各组间比，均P<0.01。
(1)Average IOD comparison between day 8-10 group and day 1 group and between day 8-10 group and day 12-14 group,P>0.05,between day 1 group and day 12-14 group,P<0.05;among the rest groups,P<0.01.(2)Average diameter and average area comparison among every groups,P<0.01.讨 论
NGF是一种体液因子，最初由Bucker和Montalcini于40年前在小鼠肉瘤组织中发现，由于它对鸡胚背根节和交感神经节的生长发育有明显的促进作用，故命名为神经生长因子(nerve growth factor,NGF)。在以后的研究中发现NGF广泛存在于动物正常组织中，大量的实验又证明NGF及NGF mRNA在大多数外周组织和神经系统中的分布与NGF敏感神经纤维的分布相一致，即NGF具有靶源性神经营养作用，但也有相当一部分组织例外，这些组织包括唾液腺、前列腺、精囊腺、睾丸、卵巢、骨髓、脾等多种非神经系统的器官，其中以成年雄性小鼠颌下腺内NGF的含量最高，这提示NGF是一个多功能的生长因子。为什么小鼠颌下腺中含有较高水平的NGF以及颌下腺合成的NGF的功能作用尚不十分清楚。人们对小鼠、大鼠、人等颌下腺NGF的氨基酸序列、亚基特点、生物合成及受体的特性、分布和合成等已进行了广泛的研究[8,9]，但有关颌下腺NGF基因水平的研究则时间不长。小鼠和人NGF基因于80年代才被克隆成功，此后大鼠和一些其他动物的NGF基因也相继被克隆[5,10]。在克隆出的几种动物NGF基因中，人们发现小鼠与人的NGF基因最为相似。两者的核苷酸序列和氨基酸排列具有高度同源性。我们利用dig-h NGF\-βDNA探针，对NGF基因在小鼠颌下腺中的表达和在发育过程中的变化进行了研究，结果显示NGFmRNA定位于纹状管和颗粒曲管的上皮细胞中。在出生1周内尚无NGF mRNA转录。在出生后1～2周雄性小鼠颌下腺中，纹状管NGF原位杂交信号已开始呈现，但很弱。生后1月龄的雄性小鼠颌下腺纹状管和颗粒曲管NGF原位杂交信号迅速增强。2月龄雄性小鼠大部分纹状管已发育形成管道高度弯曲、管径明显增粗的颗粒曲管[11]，NGF原位杂交信号在颗粒曲管中很强。这表明雄性小鼠在出生后1～2周期间颌下腺中NGF mRNA开始从DNA转录，此后逐渐增加，1月龄左右的雄性小鼠颌下腺中NGF mRNA迅速增多，至2月龄时NGF mRNA继续保持高水平的转录。不同年龄的小鼠颌下腺中NGF蛋白的含量变化较大，新生小鼠颌下腺中不含NGF，在成年之前NGF随年龄的增大而增多，成年后达到最高水平[2]。从小鼠出生至成年，颌下腺中NGF mRNA的变化趋势与NGF蛋白含量的变化趋势基本相似，表明在小鼠生后发育中颌下腺NGF基因表达主要是由转录水平调控的。
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颌下腺NGF的合成受到多种激素的调控[12]，成年雄性小鼠颌下腺NGF含量大大高于雌性小鼠，在生长发育过程中雄性小鼠NGF及NGF mRNA含量的增加在性成熟期最为显著，表明在正常发育过程中，雄激素是调节颌下腺NGF合成的主要激素之一。雄激素能促进颌下腺纹状管细胞的增殖并促进纹状管细胞向颗粒曲管的分化，同时增加颌下腺的NGF基因转录[13]。因此，雄性小鼠性成熟后颌下腺NGF蛋白含量的迅速增加除NGF mRNA水平增高外，单位面积中颗粒曲管数量的增多也起着重要作用。我们在雌性小鼠颌下腺NGF mRNA表达研究中曾看到NGF mRNA的分布与雄性小鼠相同，主要存在于纹状管和颗粒曲管，但杂交信号明显弱于雄性小鼠，在有杂交信号的纹状管和颗粒曲管上皮细胞之间常可见到部分阴性细胞，杂交阳性管道的密度亦显著低于雄性小鼠[7]。上述发现也同时证明雄性激素在小鼠颌下腺NGF mRNA的表达及NGF合成中发挥着重要的作用。
Aloe 和Walker等[14，15]发现甲状腺激素也能增加成年和未成年小鼠颌下腺NGF的含量和浓度。Black[3]等人在实验中发现在甲状腺激素的作用下，小鼠颌下腺NGF含量的增加与NGF mRNA水平的提高基本呈平行关系，说明甲状腺激素对颌下腺NGF基因的调节与雄性激素相似，也发生在转录水平，它们的具体作用机理目前仍不十分明确。有学者认为雄激素和甲状腺激素主要通过与靶细胞上受体结合，形成激素-受体复合物，粘附于特异的DNA序列并与之相互作用，进而影响靶基因的转录。
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收稿1997-06 修回1998-01
图版说明
图1 新生小鼠颌下腺无NGF杂交信号 ×200
图2 10d龄小鼠颌下腺与dig-h NGF\-β DNA探针杂交，纹状管呈阴性或弱阳性信号 ×400
图3 12d龄小鼠颌下腺纹状管NGF杂交信号呈弱阳性 ×400
图4 1月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈阳性 ×200
图5 1月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈阳性 ×400
图6 2月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈强阳性 ×200
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图7 2月龄小鼠颌下腺颗粒曲管NGF杂交信号呈强阳性 ×400
图8 以预杂交液代替杂交液对照组，颌下腺未见杂交信号 ×400
图9 以无关探针原位杂交作对照组，颌下腺未见杂交信号 ×400
Explanation of figures
Fig.1 No hybridized signal for NGF mRNA could be seen in the submandibular gland of newborn mice. ×200
Fig.2 In situ hybridization of NGF mRNA showed negative or very weak signals in the secretory striated ducts of the 10th day mice. ×400
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Fig.3 In situ hybridization of NGF mRNA showed weak signals in the secretory striated ducts of the 12th day mice. ×400
Fig.4 In situ hybridization of NGF mRAN showed middle positive signals in granular convoluted tubules of the lst month mice. ×200
Fig.5 In situ hybridization of NGF mRAN showed middle positive signals in granular convoluted tubules of the lst month mice. ×400
Fig.6 In situ hybridization of NGF mRAN showed strong positive signals in granular convoluted tubules of the 2nd month mice. ×200
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Fig.7 In situ hybridization of NGF mRAN showed strong positive signals in granular convoluted tubules of the 2nd month mice. ×400
Fig.8 By using prehybridization solution to replace hybridization solution,no positive cell was observed in submandibular gland. ×400
Fig.9 By using non-relative probe,no hybridized signal was observed in submandibular gland. ×400
参考文献
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NERVE GROWTH FACTOR GENE EXPRESSION IN
SUBMANDIBULAR GLAND OF MICE DURING
POSTNATAL DEVELOPMENT
Lu Lu△,Ding Fei*,Cao Zheng*,Gu Jing*,Gu Xiaosong*,Wang Jiazheng**,Fan Ming**
(Department of Histology and Embryology,*Department of Molecular Biology,Nantong Medical
College,Nantong,**Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Sciences,Beijing)
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In order to explore the change of nerve growth factor(NGF)gene expression in the submandibular gland of male mice during development,the present study investigated the relative content and distribution of NGF mRNA in the submandibular glands of male ICR mice from the lst day of birth to 2nd month,by using in situ hybridization and morphometry.The results showed that no hybridized signal for NGF mRNA could be seen in the submandibular gland of newborn mice.In situ hybridization of NGF mRNA presented negative or very weak positive signals in some mice from the 8th day to 10th day and presented weak positive signals in all mice from the 12th day to 14th day.Their hybridized signals were localized in the secretory striated ducts.In situ hybridization of NGF mRNA is positive in the lst month mice and strong positive in the 2nd month mice.The hybridization signals were distributed in the granular convoluted tubules besides secretory striated ducts.The signal was extranuclear and was much stronger at the bases of cells.The study suggested that NGF gene in submandibular gland of male ICR mice began transcription from week 1 to week 2 after birth and the relative content increased as it developed before adult.
KEY WORDS Nerve growth factor;Submandibular gland;Development;In situ hybridization;Mouse;
△Department of Histology and Embryology,Nantong Medical College,Nantong 226001,China, http://www.100md.com(陆 璐 丁 斐* 曹 铮* 顾 静*顾晓松* 汪家政** 范 明**)