胃粘膜细胞系GES-1和MC微卫星DNA不稳定性及杂合性缺失研究
作者：王永信 柯 杨
单位：北京医科大学肿瘤研究所，肿瘤遗传室，北京，100034
关键词：细胞系；微卫星DNA不稳定；杂合性缺失
解剖学报980324 摘 要 为了解细胞在体外传代过程中以及在细胞离体诱导癌变过程中，遗传不稳定性及其规律，选择了11个多态微卫星DNA标记(MS)，采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术对本室建立的永生性胃粘膜细胞系GES-1的不同代数(P8、P21、P58、P100)及化学致癌剂转化的GES-1细胞系MC进行了MS的微卫星DNA不稳定(microsatellite instability, MSI)及杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)分析。结果发现，8代以前的细胞与正常细胞相比，有较高的MSI和LOH(4/11)，而从8代以后随传代时间延长降至1/11，并基本稳定在这一频率。经过化学致癌剂处理的MC细胞并未出现显著增加的MSI和LOH。结果提示，胃粘膜细胞系中，高频率的MS突变(MSI和LOH)可能是SV40整合到细胞基因组中的结果，与MNNG剂无关，细胞系建成后，具有相对稳定的遗传状态。
, http://www.100md.com
目前，离体细胞培养在肿瘤研究中仍然占有重要地位，人类恶性肿瘤80%以上起源于上皮细胞。GES-1细胞系是柯杨等[1]1992年建立的可在体外长期稳定传代，且在裸鼠中不致瘤的人胃粘膜永生性细胞系。MC细胞系[2]是用不同剂量的化学致癌剂甲硝基亚硝胍(MNNG)对人胃粘膜永生性细胞系GES-1的21代进行处理获得，其细胞形态发生了改变，集落形成率增加，获得停泊非依赖性生长的特性。GES-1和MC细胞系已广泛用于离体癌变的研究[3]，体外培养的细胞，其遗传稳定性一直是广为关注的问题，而人们对此知之甚少。为了明确这一问题，我们对GES-1和MC细胞系进行MSI和LOH观察，以了解细胞在体外传代过程中以及在细胞离体诱导癌变过程中，遗传不稳定性及其规律。
材料和方法
1.实验材料
GES-1细胞系：分别选择其第8、21、58、100代(P8、P21、P58、P100)和MC(第53代)细胞系。
, 百拇医药
2.细胞系培养及DNA提取
不同的代数(P8、P21、P58、P100)GES-1细胞系和经化学致癌剂处理后的MC细胞系，按本室自建的低血清方法培养。培养液的制备见文献[4]。贴壁细胞长到80%满后，用PBS或生理盐水洗2次，置于1.5ml Eppendorf管中，分别加入1ml Hert buffer和100μl蛋白酶K，于37℃过夜，酚-氯仿-异戊醇抽提，紫外分光光度计定量后备用。
3.PCR反应
11个MS引物购自美国Research Genetics Inc(表1)，20μl PCR反应体系中加入基因组DNA 10～100ng，上、下游引物各10pmol/L,10×PCR buffer 1μl 50～200μmol/L 4×dNTP,0.5IU Taq DNA聚合酶。经94℃30s、50～60℃ 30s、72℃ 30s 35个循环，72℃5min。
, http://www.100md.com
4.结果判定
5μl PCR产物94℃变性5min，上样于8%聚丙烯酰胺凝胶1×TBE，25℃或4℃，恒功率45W，待二甲苯青接近下缘时，关闭电源，取下凝胶。银染后观察结果。将细胞系标本与其相应的母本DNA PCR产物同时上样比较，若细胞系的某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上，则记为LOH；若细胞系的条带与正常母本相比出现，则等位基因条带的增多或大小改变记为MSI。实验结果采用X2检验。
结果和讨论
我们对SV40转化的GES-1细胞不同代数(P8、P21、P58、P100)和化学致癌剂进一步诱变的GES-1细胞MC(第53代)，以原代细胞的DNA作为正常对照。分别检测了11个位点的MSI和LOH发生频率，结果见表2。D1S243、D2S123、D11S904、D5S407 4个位点均未发现MSI和LOH，而D3S1067和D4S414两位点各阶段细胞系均为LOH。D2S119和D2S136位点分别在P8和P21细胞为正常，而P58后均有突变发生(MSI或LOH)。细胞的多数突变(4/11)发生在8代以前，在这之后检测的3个代数MSI和LOH出现率逐渐降低(1/11)。GES-1细胞在21代时经MNNG处理后，命名为MC细胞，后者也未因化学致癌剂的处理，表现有明显升高的MSI和LOH。细胞建系初期(P8)与正常母体对照，细胞具有较多的MSI和LOH(4/11)，而在这以后的P21、P58、P100代中与前一代被检测代数相比MSI和LOH有所降低(1/11)。这表明在细胞建株后的传代过程中，随代数增加趋于稳定，并未出现人们担心的体外细胞培养可能造成不断的变异现象。而GES-1早代细胞的较高的MSI和LOH可能是SV40转化细胞的效应。化学致癌剂处理后的细胞MC与其母本GES-1的P21代相比也没有MSI和LOH的显著性增加。说明MNNG的作用并不表现在造成细胞的MSI和LOH。胃粘膜细胞系中，高频率的MSI和LOH可能是SV40整合到细胞基因组中的结果，与MNNG剂无关，细胞一旦建系后，随着传代次数增加而趋于稳定。
, 百拇医药
表1 本实验所用的引物资料
Table 1 A summary of MS primers used in the experiments 染色体
chromosome
位点
locus
杂合性
heterozygosity
染色体定位
map
重复类型
type
, http://www.100md.com
片段大小(bp)
allele size/bp
1
D1S243
0.8740
1
二核苷酸 dinucleotide
142-170
2
D2S119
0.8100
2p23-P15
, http://www.100md.com
二核苷酸 dinucleotide
214-232
2
D2S123
0.7730
2
二核苷酸 dinucleotide
197-227
2
D2136
0.7470
2p14-p13
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
91-111
2
D2147
0.7250
2p14-p13
二核苷酸 dinucleotide
126-144
2
D2S389
0.7300
2
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
189-219
3
D2S1067
0.8600
3p21.1-p14.3
二核苷酸 dinucleotide
230-244
3
D3S1577
0.6900
3p12
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
221-235
4
D4S414
0.8930
4
二核苷酸 dinucleotide
227-242
5
D5S407
0.8680
5
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
107-127
8
D8S279
0.8790
8
二核苷酸 dinucleotide
229-257
11
D11S904
0.8340
11p14-p13
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
185-201
表2 胃粘膜细胞系的MSI和LOH的频率
Table 2 Frequency of MSI and LOH in gastric epithelial cell lines 位 点
locus
GES-1细胞系
CES-1
MC细胞系
MC
8代
, 百拇医药 P8
21代
P21
58代
P58
100代
P100
D1S243
N
N
N
N
N
D2S119
, http://www.100md.com
N
L
L
L
L
D2S123
N
N
N
N
N
D2S136
N
N
, 百拇医药
L
L
M
D2S147
M
M
M
M
M
D3S1067
L
L
L
L
, 百拇医药
L
D3S1577
N
N
N
M
M
D4S414
L
L
L
L
L
D5S407
, 百拇医药
N
N
N
N
N
D8S279
M
M
M
M
M
D11S904
N
N
, http://www.100md.com
N
N
N
Rate of MSI
and LOH
4/11
1/11
1/11
1/11
2/11
N:正常，normal;L.杂合性缺失，(LOH)M.微卫星不稳定性，(MSI)与原代细胞比较 Compared with primary cells与前一代细胞比较Compared with former passage与P21代细胞比较 Compared with P21收稿 1997-06 修回 1997-11
, 百拇医药
参考文献
[1]柯 杨，宁 涛，高 燕等.人胃粘膜上皮细胞原代培养及其生物学鉴定.解剖学报，1992，23(4)：390
[2]苏秀兰,柯 杨,王 冰等.MNNG对人胃粘膜上皮细胞系GES-1的作用研究.中华肿瘤杂志，1995，17(增刊)：43
[3]王 冰,苏秀兰,宁 涛等.MNNG诱导人胃粘膜上皮细胞系GES-1及正常胃粘膜标本原癌基因的激活，中华肿瘤杂志，1996，18(1)：6
[4]柯 杨，宁 涛，王 冰等.人胃粘膜上皮细胞GES-1的建立及其生物学特性.中华肿瘤杂志，1994，16(1)：7
STUDIES OF MICROSATELLITE INSTABILITY AND LOSS OF
, 百拇医药
HETEROZYGOSITY IN HUMAN GASTRIC EPITHELIAL
CELL LINES(GES-1 AND MC) AT DIFFERENT
PASSAGES AND CARCINOGENESIS STAGES
Wang Yongxin, Yang Ke
(Laboratory of Cancer Genetics, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing)
In order to identify the MSI(microsatellite instability, MSI) and LOH(loss of heterozygosity, LOH) frequency in human gastric epithelial cell lines at different passages and carcinogenesis stages. We selected 11 microsatellite markers to examine the gastric epithelial cell lines (GES-1 and MC) for LOH and MSI at the loci using a polymerase chain reaction (PCR).The rates of MSI and LOH were analyzed at 11 loci in 2 cell lines at different passage and stage in carcinogenesis. The high rates of LOH and MSI were observed in GES-1 at passage 8 (4/11) and it decreased to 1/11 with the further passages. MC cell didn′t show higher MSI and LOH significantly. These results suggest that the high MSI and LOH in GES-1 at early passage may reflect the effect of SV40 and the cell line tends to be genetically stable with prolonged passages and MNNG didn′t significantly increase MSI and LOH in these cells.
KEY WORDS Cell line; Microsatellite instability; Loss of heterozygosity
△Laboratory of Cancer Genetics, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100034, China, 百拇医药
单位：北京医科大学肿瘤研究所，肿瘤遗传室，北京，100034
关键词：细胞系；微卫星DNA不稳定；杂合性缺失
解剖学报980324 摘 要 为了解细胞在体外传代过程中以及在细胞离体诱导癌变过程中，遗传不稳定性及其规律，选择了11个多态微卫星DNA标记(MS)，采用PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术对本室建立的永生性胃粘膜细胞系GES-1的不同代数(P8、P21、P58、P100)及化学致癌剂转化的GES-1细胞系MC进行了MS的微卫星DNA不稳定(microsatellite instability, MSI)及杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)分析。结果发现，8代以前的细胞与正常细胞相比，有较高的MSI和LOH(4/11)，而从8代以后随传代时间延长降至1/11，并基本稳定在这一频率。经过化学致癌剂处理的MC细胞并未出现显著增加的MSI和LOH。结果提示，胃粘膜细胞系中，高频率的MS突变(MSI和LOH)可能是SV40整合到细胞基因组中的结果，与MNNG剂无关，细胞系建成后，具有相对稳定的遗传状态。
, http://www.100md.com
目前，离体细胞培养在肿瘤研究中仍然占有重要地位，人类恶性肿瘤80%以上起源于上皮细胞。GES-1细胞系是柯杨等[1]1992年建立的可在体外长期稳定传代，且在裸鼠中不致瘤的人胃粘膜永生性细胞系。MC细胞系[2]是用不同剂量的化学致癌剂甲硝基亚硝胍(MNNG)对人胃粘膜永生性细胞系GES-1的21代进行处理获得，其细胞形态发生了改变，集落形成率增加，获得停泊非依赖性生长的特性。GES-1和MC细胞系已广泛用于离体癌变的研究[3]，体外培养的细胞，其遗传稳定性一直是广为关注的问题，而人们对此知之甚少。为了明确这一问题，我们对GES-1和MC细胞系进行MSI和LOH观察，以了解细胞在体外传代过程中以及在细胞离体诱导癌变过程中，遗传不稳定性及其规律。
材料和方法
1.实验材料
GES-1细胞系：分别选择其第8、21、58、100代(P8、P21、P58、P100)和MC(第53代)细胞系。
, 百拇医药
2.细胞系培养及DNA提取
不同的代数(P8、P21、P58、P100)GES-1细胞系和经化学致癌剂处理后的MC细胞系，按本室自建的低血清方法培养。培养液的制备见文献[4]。贴壁细胞长到80%满后，用PBS或生理盐水洗2次，置于1.5ml Eppendorf管中，分别加入1ml Hert buffer和100μl蛋白酶K，于37℃过夜，酚-氯仿-异戊醇抽提，紫外分光光度计定量后备用。
3.PCR反应
11个MS引物购自美国Research Genetics Inc(表1)，20μl PCR反应体系中加入基因组DNA 10～100ng，上、下游引物各10pmol/L,10×PCR buffer 1μl 50～200μmol/L 4×dNTP,0.5IU Taq DNA聚合酶。经94℃30s、50～60℃ 30s、72℃ 30s 35个循环，72℃5min。
, http://www.100md.com
4.结果判定
5μl PCR产物94℃变性5min，上样于8%聚丙烯酰胺凝胶1×TBE，25℃或4℃，恒功率45W，待二甲苯青接近下缘时，关闭电源，取下凝胶。银染后观察结果。将细胞系标本与其相应的母本DNA PCR产物同时上样比较，若细胞系的某一等位基因条带消失或相对密度减少50%以上，则记为LOH；若细胞系的条带与正常母本相比出现，则等位基因条带的增多或大小改变记为MSI。实验结果采用X2检验。
结果和讨论
我们对SV40转化的GES-1细胞不同代数(P8、P21、P58、P100)和化学致癌剂进一步诱变的GES-1细胞MC(第53代)，以原代细胞的DNA作为正常对照。分别检测了11个位点的MSI和LOH发生频率，结果见表2。D1S243、D2S123、D11S904、D5S407 4个位点均未发现MSI和LOH，而D3S1067和D4S414两位点各阶段细胞系均为LOH。D2S119和D2S136位点分别在P8和P21细胞为正常，而P58后均有突变发生(MSI或LOH)。细胞的多数突变(4/11)发生在8代以前，在这之后检测的3个代数MSI和LOH出现率逐渐降低(1/11)。GES-1细胞在21代时经MNNG处理后，命名为MC细胞，后者也未因化学致癌剂的处理，表现有明显升高的MSI和LOH。细胞建系初期(P8)与正常母体对照，细胞具有较多的MSI和LOH(4/11)，而在这以后的P21、P58、P100代中与前一代被检测代数相比MSI和LOH有所降低(1/11)。这表明在细胞建株后的传代过程中，随代数增加趋于稳定，并未出现人们担心的体外细胞培养可能造成不断的变异现象。而GES-1早代细胞的较高的MSI和LOH可能是SV40转化细胞的效应。化学致癌剂处理后的细胞MC与其母本GES-1的P21代相比也没有MSI和LOH的显著性增加。说明MNNG的作用并不表现在造成细胞的MSI和LOH。胃粘膜细胞系中，高频率的MSI和LOH可能是SV40整合到细胞基因组中的结果，与MNNG剂无关，细胞一旦建系后，随着传代次数增加而趋于稳定。
, 百拇医药
表1 本实验所用的引物资料
Table 1 A summary of MS primers used in the experiments 染色体
chromosome
位点
locus
杂合性
heterozygosity
染色体定位
map
重复类型
type
, http://www.100md.com
片段大小(bp)
allele size/bp
1
D1S243
0.8740
1
二核苷酸 dinucleotide
142-170
2
D2S119
0.8100
2p23-P15
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二核苷酸 dinucleotide
214-232
2
D2S123
0.7730
2
二核苷酸 dinucleotide
197-227
2
D2136
0.7470
2p14-p13
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
91-111
2
D2147
0.7250
2p14-p13
二核苷酸 dinucleotide
126-144
2
D2S389
0.7300
2
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
189-219
3
D2S1067
0.8600
3p21.1-p14.3
二核苷酸 dinucleotide
230-244
3
D3S1577
0.6900
3p12
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
221-235
4
D4S414
0.8930
4
二核苷酸 dinucleotide
227-242
5
D5S407
0.8680
5
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
107-127
8
D8S279
0.8790
8
二核苷酸 dinucleotide
229-257
11
D11S904
0.8340
11p14-p13
, 百拇医药
二核苷酸 dinucleotide
185-201
表2 胃粘膜细胞系的MSI和LOH的频率
Table 2 Frequency of MSI and LOH in gastric epithelial cell lines 位 点
locus
GES-1细胞系
CES-1
MC细胞系
MC
8代
, 百拇医药 P8
21代
P21
58代
P58
100代
P100
D1S243
N
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D2S136
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, 百拇医药
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D2S147
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D3S1067
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, 百拇医药
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D8S279
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D11S904
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, http://www.100md.com
N
N
N
Rate of MSI
and LOH
4/11
1/11
1/11
1/11
2/11
N:正常，normal;L.杂合性缺失，(LOH)M.微卫星不稳定性，(MSI)与原代细胞比较 Compared with primary cells与前一代细胞比较Compared with former passage与P21代细胞比较 Compared with P21收稿 1997-06 修回 1997-11
, 百拇医药
参考文献
[1]柯 杨，宁 涛，高 燕等.人胃粘膜上皮细胞原代培养及其生物学鉴定.解剖学报，1992，23(4)：390
[2]苏秀兰,柯 杨,王 冰等.MNNG对人胃粘膜上皮细胞系GES-1的作用研究.中华肿瘤杂志，1995，17(增刊)：43
[3]王 冰,苏秀兰,宁 涛等.MNNG诱导人胃粘膜上皮细胞系GES-1及正常胃粘膜标本原癌基因的激活，中华肿瘤杂志，1996，18(1)：6
[4]柯 杨，宁 涛，王 冰等.人胃粘膜上皮细胞GES-1的建立及其生物学特性.中华肿瘤杂志，1994，16(1)：7
STUDIES OF MICROSATELLITE INSTABILITY AND LOSS OF
, 百拇医药
HETEROZYGOSITY IN HUMAN GASTRIC EPITHELIAL
CELL LINES(GES-1 AND MC) AT DIFFERENT
PASSAGES AND CARCINOGENESIS STAGES
Wang Yongxin, Yang Ke
(Laboratory of Cancer Genetics, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing)
In order to identify the MSI(microsatellite instability, MSI) and LOH(loss of heterozygosity, LOH) frequency in human gastric epithelial cell lines at different passages and carcinogenesis stages. We selected 11 microsatellite markers to examine the gastric epithelial cell lines (GES-1 and MC) for LOH and MSI at the loci using a polymerase chain reaction (PCR).The rates of MSI and LOH were analyzed at 11 loci in 2 cell lines at different passage and stage in carcinogenesis. The high rates of LOH and MSI were observed in GES-1 at passage 8 (4/11) and it decreased to 1/11 with the further passages. MC cell didn′t show higher MSI and LOH significantly. These results suggest that the high MSI and LOH in GES-1 at early passage may reflect the effect of SV40 and the cell line tends to be genetically stable with prolonged passages and MNNG didn′t significantly increase MSI and LOH in these cells.
KEY WORDS Cell line; Microsatellite instability; Loss of heterozygosity
△Laboratory of Cancer Genetics, Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100034, China, 百拇医药