大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)/PBR322衍生质粒作为人IL-6表达系统的研究
作者：狄凯军 刘世广 章秋珩 章静波
单位：中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005
关键词：白细胞介素-6(IL-6)；大肠杆菌(λ衍生噬菌体)[BL21(DE3)]；聚合酶链反应(PCR)
解剖学报/980415 摘 要 为探索人白细胞介素-6(IL-6)在原核细胞中高效表达的途径，选用BL21(DE3)/PET-28作为表达系统，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增了hIL-6的互补DNA(cDNA)的编码区，引入了EcoRI和Hind Ⅲ位点。用限制性内切酶EcoRI和Hind Ⅲ酶切后，克隆于PET-28载体的相应位点，转化DH5α。选出阳性克隆，经DNA序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转入DH5α，筛选阳性克隆，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。全细菌裂解液进行十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结合固化蛋白质的免疫学测定(Western-blot)杂交进行分析。结果表明：Western-blot杂交发现有与抗IL-6特异结合的蛋白带，以4h的产量最多，激光扫描显示IL-6的吸收峰占总吸收面积的37%(4h诱导)。分子量约为27kD。实验显示，人IL-6在原核细胞中实现了高效表达，表达产物具有IL-6的免疫活性。
, 百拇医药
白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，具有多种生物学作用，诸如诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖和分化，增强CTL和NK细胞的杀伤活性；协同刺激造血细胞的分化和血细胞的生长[1]；诱导神经细胞的分化[2]，并具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[3]等。为探索人IL-6在原核细胞中高效表达的途径，本实验采用大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)BL21(DE3)原核表达体系，为进一步研究其功能、应用及产量提供先期资料。
材料和方法
1.菌株与质粒
菌株BL21(DE3)、DH5α为本室冻存；表达载体PET-28a(+)为中国医学科学院基础所郑德先教授惠赠；PUC13-IL-6由日本大阪大学Taga教授惠赠。
2.引物设计、合成与聚合酶链反应(PCR)扩增
, 百拇医药
根据成熟IL-6编码序列设计一对引物：
P1中含EcoRI酶切位点，ATG起始密码和成熟hIL-6的5'端部分氨基酸编码序列；P2中含HindⅢ酶切位点、TAA终止密码和hIL-6的3'端部分氨基酸编码基因的互补序列。以PUC-13-IL-6为模板，常规进行PCR反应。
3.表达质粒的构建及鉴定
用LMP法回收PCR产物，分别用限制性内切酶EcoRI、HindⅢ酶切PCR产物和载体PET-28a(+)，然后进行连接反应，用连接产物转化感受态菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。
4.DNA序列测定
采用美国应用生物系统公司(ABI)的373ADNA序列测定自动分析仪，用Tag酶标记T7引物，以PCR方法进行测序反应。
, 百拇医药
5.诱导质粒PETIL-6表达
将重组质粒转化BL21(DE3)，挑出一新形成的克隆，于37℃活化表达克隆，再以1∶25接种于LB培养基扩增至菌密度OD600=0.6,加入1mmol/L进行诱导表达，分别于1h、2h、4h、7h取样，冰上放置5 min，4℃，8 000r/min离心，收集菌体。
6.SDS-PAGE凝胶密度扫描和Western-blot分析
于收集的菌体中加入1×SDS凝胶加样缓冲液100μl，100℃煮沸3 min，取15μl进行SDS-PAGE[4]，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%。电泳结束后考马斯亮蓝染色。凝胶密度扫描测定蛋白含量。Western-blot分析方法见文献[4]。应用鼠抗IL-6McAb及HRP标记羊抗鼠IgG抗体。
结果和讨论
, 百拇医药
1.常规PCR扩增
采用合成的引物，以PUC13-IL-6为模板，进行常规PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现1条0.56kb大小的带。
2.表达载体PETI的构建
PCR扩增的人完整IL-6编码基因经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切后与相同酶解的PET-28a(+)体外重组，转入E.coli DH5α中。转入的克隆经小提质粒及限制性内切酶分析，证明编码完整的人IL-6基因插入质粒PET-28a(+)的EcoRI和Hind Ⅲ酶切位点之间(图1)。
图1 克隆的酶切鉴定 M.分子量标记 C.经EcoRI和Hind Ⅲ双酶切的克隆质粒
Fig.1 Restriction enzyme screening of colony M:Molecular marker of Hind Ⅲ digested Lamda DNA C:EcoRI and Hind Ⅲ digested plasmids of colony
, 百拇医药
3.DNA序列测定
PET-28a(+)-IL-6质粒DNA序列分析证明，IL-6全长编码区内未发现核苷酸突变，引入了ATG启始密码和TAA终止密码。
4.PETI的诱导表达及Western-blot分析
将重组质粒转入BL21(DE3)，IPTG诱导后不同时间收获的菌体与相同培养的菌体对照一起进行SDS-PAGE及Western-blot分析，结果显示诱导的BL21(DE3)/PETI裂解物中确实存在能特异地与抗IL-6 McAb结合的蛋白，分子量为27kD(图2)，表明目的基因已被成功地诱导表达，其产物的抗原性与人IL-6相同。凝胶密度扫描分析证明，表达的人γIL-6蛋白占总菌体蛋白的31%。活化扩增的同一阳性克隆经IPTG诱导1h即有少量人γIL-6表达，表达产物随诱导时间的延长而增加，诱导4h达峰值，继续延长诱导时间，人γIL-6蛋白表达量反而下降。细菌生长状态研究提示，当BL21(DE3)生长菌密度至0.6时，人γIL-6诱导表达产率较高。
, 百拇医药
图2 Western blot分析结果 M.蛋白分子量标记 1.BL21(DE3)阴性对照 2.未经诱导的样品 3.诱导1h后的样品 4.诱导2h后的样品 5.诱导4h后的样品 6.诱导7h后的样品 7.诱导4h后的样品经Western-blot分析
Fig.2 Western blot analysis M.Protein Molecular Marker 1.BL21(DE3) 2.samples collected immediately before induction3.sample collected 1h after induction 4.sample collected 2h after induction 5.sample collected 4h after induction 6.sample collected 7h after induction 7.Western-blot of samples collected 4h after induction
, 百拇医药
PET表达体系是目前在大肠杆菌中克隆和表达融合蛋白的最佳体系之一[5]，本实验选用BL21(DE3)/PET28作为表达体系有许多优点：(1)PET-28a(+)使用T7Lac启动子，其上游的LacI编码足够的Lac抑制子，阻断T7RNA聚合酶的产生和其对外源基因的转录，使基础表达水平降到最低，可提高重组质粒的稳定性。(2)PET-28的BamHI下游含有转录终止信号，阻止通读，转录的mRNA3'-尾形成二级环状结构，可阻止降解，延长寿命。(3)BL21株缺乏OmpT外膜蛋白酶，有利于防止表达产物在提纯时降解。(4)携带T7RNA聚合酶基因的噬菌体DE3已整合于细菌基因组，可通过IPTG诱导使之表达，进而启动T7Lac启动子，开始目的基因转录和翻译。(5)PET-28含有His.Taq寡聚组氨酸链，因而在多种情况下都可以便利经济地进行纯化。这一系统特别适合表达对细菌有毒性的外源蛋白。
本实验运用BL21(DE3)/PET-28a(+)体系成功地高效表达人IL-6，此产物的纯化及生物学活性测定正在进行之中，这将为我们以及有关实验室进一步探讨人IL-6的功能及其应用提供有参考价值的资料。
, http://www.100md.com
收稿1997-09 修回1997-12
参考文献
[1]Kishimoto T. The biology of Interleukin-6.Blood, 1989,74(1):1
[2]Saton T, Nakamura S, Taga T, et al. Induction of neuronal differentiation in PC12 cells by B-cell stimulatory factor 2/interleukin 6. Mol Cell Biol, 1988,8(8):3546
[3]路力生，田志刚.白细胞介素-6与肿瘤免疫.国外医学免疫学分册，1991，14(6)：298
[4]Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual.2nd ed. NewYork: Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989:880
, 百拇医药
[5]公茂凯，章静波，刘德培等.BL21(DE3)/PET-11作为人IL-2表达系统的研究.中国医学科学院学报，1996，18(1)：60
THE STUDY OF BL21(DE3)/PET-28 AS AN
EXPRESSION SYSTEM OF HUMAN IL-6
EXPRESSION SYSTEM OF HUMAN IL-6
Di Kaijun, Liu Shiguang, Zhang Qiuheng,Zhang Jingbo△,(Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical
College, Chinese Acadamy of Medical Sciences, Beijing)
, http://www.100md.com
IL-6 is a multifunctional cytokine, our experiment is aimed at making it clear that the passway of the high expression of IL-6 in prokaryotic cell. In the present experiment, BL21(DE3)/PET-28 was used as expressing system. We amplified the coding region of hIL-6 cDNA by PCR, introduced into a EcoRI site and a HindⅢ site. We recovered the DNA fragment, cleaved out by EcoRI and HindⅢ and then subcloned into PET-28 and transformed into DH5. We picked out positive colonies. DNA sequencing showed that non-specific mutation has not been found in its coding region. We transformed recombined plasmid into BL21(DE3) and screened positive colonies. After IPTG induction, the cell lysate was used directly for SDS-PAGE, combined with the result of Western-blot. We found a specific binding band on SDS-PAGE and the amount after 4 hours induction reached to the most. Laser scanning was also carried out and the result showed that the absorption area of IL-6 band is 37% of total area (samples collected after 4 hour induction). The molecular weight is about 27 kD. The result suggests that the expressed product has hIL-6 immunological activity.
KEY WORDS Interleukin-6;BL21(DE3);Polymerase Chain Reaction(PCR)
△Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical College, Chinese Acadamy of Medical Sciences, Beijing 100005, China, 百拇医药
单位：中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所，北京100005
关键词：白细胞介素-6(IL-6)；大肠杆菌(λ衍生噬菌体)[BL21(DE3)]；聚合酶链反应(PCR)
解剖学报/980415 摘 要 为探索人白细胞介素-6(IL-6)在原核细胞中高效表达的途径，选用BL21(DE3)/PET-28作为表达系统，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增了hIL-6的互补DNA(cDNA)的编码区，引入了EcoRI和Hind Ⅲ位点。用限制性内切酶EcoRI和Hind Ⅲ酶切后，克隆于PET-28载体的相应位点，转化DH5α。选出阳性克隆，经DNA序列分析，表明其编码区内无非特异突变。将重组质粒转入DH5α，筛选阳性克隆，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。全细菌裂解液进行十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结合固化蛋白质的免疫学测定(Western-blot)杂交进行分析。结果表明：Western-blot杂交发现有与抗IL-6特异结合的蛋白带，以4h的产量最多，激光扫描显示IL-6的吸收峰占总吸收面积的37%(4h诱导)。分子量约为27kD。实验显示，人IL-6在原核细胞中实现了高效表达，表达产物具有IL-6的免疫活性。
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白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能的细胞因子，具有多种生物学作用，诸如诱导T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖和分化，增强CTL和NK细胞的杀伤活性；协同刺激造血细胞的分化和血细胞的生长[1]；诱导神经细胞的分化[2]，并具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[3]等。为探索人IL-6在原核细胞中高效表达的途径，本实验采用大肠杆菌菌株(λ衍生噬菌体)BL21(DE3)原核表达体系，为进一步研究其功能、应用及产量提供先期资料。
材料和方法
1.菌株与质粒
菌株BL21(DE3)、DH5α为本室冻存；表达载体PET-28a(+)为中国医学科学院基础所郑德先教授惠赠；PUC13-IL-6由日本大阪大学Taga教授惠赠。
2.引物设计、合成与聚合酶链反应(PCR)扩增
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根据成熟IL-6编码序列设计一对引物：
P1中含EcoRI酶切位点，ATG起始密码和成熟hIL-6的5'端部分氨基酸编码序列；P2中含HindⅢ酶切位点、TAA终止密码和hIL-6的3'端部分氨基酸编码基因的互补序列。以PUC-13-IL-6为模板，常规进行PCR反应。
3.表达质粒的构建及鉴定
用LMP法回收PCR产物，分别用限制性内切酶EcoRI、HindⅢ酶切PCR产物和载体PET-28a(+)，然后进行连接反应，用连接产物转化感受态菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。
4.DNA序列测定
采用美国应用生物系统公司(ABI)的373ADNA序列测定自动分析仪，用Tag酶标记T7引物，以PCR方法进行测序反应。
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5.诱导质粒PETIL-6表达
将重组质粒转化BL21(DE3)，挑出一新形成的克隆，于37℃活化表达克隆，再以1∶25接种于LB培养基扩增至菌密度OD600=0.6,加入1mmol/L进行诱导表达，分别于1h、2h、4h、7h取样，冰上放置5 min，4℃，8 000r/min离心，收集菌体。
6.SDS-PAGE凝胶密度扫描和Western-blot分析
于收集的菌体中加入1×SDS凝胶加样缓冲液100μl，100℃煮沸3 min，取15μl进行SDS-PAGE[4]，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%。电泳结束后考马斯亮蓝染色。凝胶密度扫描测定蛋白含量。Western-blot分析方法见文献[4]。应用鼠抗IL-6McAb及HRP标记羊抗鼠IgG抗体。
结果和讨论
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1.常规PCR扩增
采用合成的引物，以PUC13-IL-6为模板，进行常规PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现1条0.56kb大小的带。
2.表达载体PETI的构建
PCR扩增的人完整IL-6编码基因经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切后与相同酶解的PET-28a(+)体外重组，转入E.coli DH5α中。转入的克隆经小提质粒及限制性内切酶分析，证明编码完整的人IL-6基因插入质粒PET-28a(+)的EcoRI和Hind Ⅲ酶切位点之间(图1)。
图1 克隆的酶切鉴定 M.分子量标记 C.经EcoRI和Hind Ⅲ双酶切的克隆质粒
Fig.1 Restriction enzyme screening of colony M:Molecular marker of Hind Ⅲ digested Lamda DNA C:EcoRI and Hind Ⅲ digested plasmids of colony
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3.DNA序列测定
PET-28a(+)-IL-6质粒DNA序列分析证明，IL-6全长编码区内未发现核苷酸突变，引入了ATG启始密码和TAA终止密码。
4.PETI的诱导表达及Western-blot分析
将重组质粒转入BL21(DE3)，IPTG诱导后不同时间收获的菌体与相同培养的菌体对照一起进行SDS-PAGE及Western-blot分析，结果显示诱导的BL21(DE3)/PETI裂解物中确实存在能特异地与抗IL-6 McAb结合的蛋白，分子量为27kD(图2)，表明目的基因已被成功地诱导表达，其产物的抗原性与人IL-6相同。凝胶密度扫描分析证明，表达的人γIL-6蛋白占总菌体蛋白的31%。活化扩增的同一阳性克隆经IPTG诱导1h即有少量人γIL-6表达，表达产物随诱导时间的延长而增加，诱导4h达峰值，继续延长诱导时间，人γIL-6蛋白表达量反而下降。细菌生长状态研究提示，当BL21(DE3)生长菌密度至0.6时，人γIL-6诱导表达产率较高。
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图2 Western blot分析结果 M.蛋白分子量标记 1.BL21(DE3)阴性对照 2.未经诱导的样品 3.诱导1h后的样品 4.诱导2h后的样品 5.诱导4h后的样品 6.诱导7h后的样品 7.诱导4h后的样品经Western-blot分析
Fig.2 Western blot analysis M.Protein Molecular Marker 1.BL21(DE3) 2.samples collected immediately before induction3.sample collected 1h after induction 4.sample collected 2h after induction 5.sample collected 4h after induction 6.sample collected 7h after induction 7.Western-blot of samples collected 4h after induction
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PET表达体系是目前在大肠杆菌中克隆和表达融合蛋白的最佳体系之一[5]，本实验选用BL21(DE3)/PET28作为表达体系有许多优点：(1)PET-28a(+)使用T7Lac启动子，其上游的LacI编码足够的Lac抑制子，阻断T7RNA聚合酶的产生和其对外源基因的转录，使基础表达水平降到最低，可提高重组质粒的稳定性。(2)PET-28的BamHI下游含有转录终止信号，阻止通读，转录的mRNA3'-尾形成二级环状结构，可阻止降解，延长寿命。(3)BL21株缺乏OmpT外膜蛋白酶，有利于防止表达产物在提纯时降解。(4)携带T7RNA聚合酶基因的噬菌体DE3已整合于细菌基因组，可通过IPTG诱导使之表达，进而启动T7Lac启动子，开始目的基因转录和翻译。(5)PET-28含有His.Taq寡聚组氨酸链，因而在多种情况下都可以便利经济地进行纯化。这一系统特别适合表达对细菌有毒性的外源蛋白。
本实验运用BL21(DE3)/PET-28a(+)体系成功地高效表达人IL-6，此产物的纯化及生物学活性测定正在进行之中，这将为我们以及有关实验室进一步探讨人IL-6的功能及其应用提供有参考价值的资料。
, http://www.100md.com
收稿1997-09 修回1997-12
参考文献
[1]Kishimoto T. The biology of Interleukin-6.Blood, 1989,74(1):1
[2]Saton T, Nakamura S, Taga T, et al. Induction of neuronal differentiation in PC12 cells by B-cell stimulatory factor 2/interleukin 6. Mol Cell Biol, 1988,8(8):3546
[3]路力生，田志刚.白细胞介素-6与肿瘤免疫.国外医学免疫学分册，1991，14(6)：298
[4]Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual.2nd ed. NewYork: Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989:880
, 百拇医药
[5]公茂凯，章静波，刘德培等.BL21(DE3)/PET-11作为人IL-2表达系统的研究.中国医学科学院学报，1996，18(1)：60
THE STUDY OF BL21(DE3)/PET-28 AS AN
EXPRESSION SYSTEM OF HUMAN IL-6
EXPRESSION SYSTEM OF HUMAN IL-6
Di Kaijun, Liu Shiguang, Zhang Qiuheng,Zhang Jingbo△,(Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical
College, Chinese Acadamy of Medical Sciences, Beijing)
, http://www.100md.com
IL-6 is a multifunctional cytokine, our experiment is aimed at making it clear that the passway of the high expression of IL-6 in prokaryotic cell. In the present experiment, BL21(DE3)/PET-28 was used as expressing system. We amplified the coding region of hIL-6 cDNA by PCR, introduced into a EcoRI site and a HindⅢ site. We recovered the DNA fragment, cleaved out by EcoRI and HindⅢ and then subcloned into PET-28 and transformed into DH5. We picked out positive colonies. DNA sequencing showed that non-specific mutation has not been found in its coding region. We transformed recombined plasmid into BL21(DE3) and screened positive colonies. After IPTG induction, the cell lysate was used directly for SDS-PAGE, combined with the result of Western-blot. We found a specific binding band on SDS-PAGE and the amount after 4 hours induction reached to the most. Laser scanning was also carried out and the result showed that the absorption area of IL-6 band is 37% of total area (samples collected after 4 hour induction). The molecular weight is about 27 kD. The result suggests that the expressed product has hIL-6 immunological activity.
KEY WORDS Interleukin-6;BL21(DE3);Polymerase Chain Reaction(PCR)
△Department of Cell Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Peking Union Medical College, Chinese Acadamy of Medical Sciences, Beijing 100005, China, 百拇医药