V79和V798细胞周期及其调控因子的差异比较*
作者：江 虹 冯 洁 王永潮
单位：北京师范大学生物系细胞增殖与调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：V79细胞；V79-8细胞；细胞周期调控；周期蛋白；周期蛋白依赖激酶
解剖学报/980412 摘 要 为了解V79和V79-8两种细胞周期及调控因子的差异，用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法检测两种细胞，发现V79细胞无可检测到的G2期；V79-8细胞则同时缺乏可检测到的G1和G2期。流式细胞光度术显示，V79G1期细胞明显多于V79-8，表明两者在G1期调控上存在差异。比较两者G1期周期调控因子的mRNA表达水平发现，V79-8cyclin D1,cyclin D3和Id表达水平明显高于V79，这可能直接导致了两者G1的差异。
, 百拇医药
V79和V79-8为两种增殖速度非常快的中国仓鼠肺成纤维细胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它们的倍增时间分别为12.5h和9.5h。V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系，而V79-8是由Elkind和Sutton于1960年从母细胞系V79转化而来。70～80年代，用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法证实，V79细胞无可检测到的G2期；V79-8细胞则同时缺乏可检测到的G1和G2期[1，2]，但并没有对其细胞周期调控(cell cycle regulation)的分子机制做更为深入的研究。
我们利用现有的在细胞周期G1期中起关键作用的CDK、cyclin、Id等基因为探针，对它们在V79、V79-8细胞的mRNA表达水平进行比较，以期对其周期调控有更为深入的了解。我们的结果表明：V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的RNA表达水平明显高于V79细胞，这可能直接导致了这两种细胞在G1期调控的差异。
, 百拇医药
材料和方法
1.细胞培养
V79细胞由上海细胞所细胞库提供，V79-8细胞由M D Anderson肿瘤中心Rao PN博士赠送，均培养于DMEM(GIBCO BRL)培养基(10%小牛血清，105IU/L青霉素，100mg/L链霉素)，37℃，5%CO2的孵育箱中。
2.流式细胞光度术(FCM)
细胞经胰酶消化后，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20℃固定，12h后，样品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L无DNase的RNase，37℃保温30min，之后加入1g/L的溴化丙啶(propidium iodide,PI Sigma公司)，37℃保温30min，样品4℃避光保存，并在24h内测量[3]。
, 百拇医药
3.Northern杂交(Northern bolotting)
细胞总RNA用异硫氰酸胍一步法提取[4]，上样量为15μg，甲醛变性凝胶电泳后，真空转移至尼龙膜上[5]，杂交所用探针为自制的体外转录[α-32P]rUTP 标记单链反义RNA(Promega,Technical Manual)，其载体、RNA聚合酶及转录本长度如下：pGEM3z-β-actin-sp6-0.56kb;pSK-CDK4-T3-1.3kb;pGEM4z-CycD1-sp6-1.14kb;pXJ41-CycD3(antisense)-T7-1.96kb;pSK-Id-T7-0.93kb。
结果
细胞流式光度术的结果表明V79比V79-8的G1期细胞多了17%，这说明两者在G1期的调控上存在明显差别(图1)。
, 百拇医药
从Northern杂交的结果可以看出，V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的mRNA表达水平明显高于V79细胞，而CDK4的表达无明显差别。这些基因高水平的表达可能造成V79-8细胞中DNA合成在M期结束后马上开始，从而使细胞增殖速度加快，细胞始终处于快速增殖的状态，在周期时相上表现为G1期缩短以至难以检测(图2)。
图1 V79和V79-8细胞的流式细胞光度术曲线
Fig.1 FCM curves of V79 and V79-8cells
A:V79； B：V79-8
, 百拇医药
图2 V79和V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4、Id基因的Northern
杂交分析
RNA探针：1.cyclin D1 2.cyclin D3 3.CDK4 4.Id a.V79 b.V79-8
Fig.2 Northern blotting analysis of cyclinD1,cyclinD3,CDK4,Id genes expression in V79 and V79-8 cells
Riboprobes:1.cyclin D1; 2.cyclinD3; 3.CDK4; 4.Id
, 百拇医药
a.V79； b.V79-8
讨论
由于[3H]胸腺嘧啶核苷参入法和流式细胞光度术方法上的差异，使得两者在细胞周期分析时可以得到不同的结果。前者以是否标记上[H3]胸腺嘧啶核苷来划分是否属于S期，而后者是以DNA的含量来给细胞分期的，如果细胞只有极少量的DNA合成，那么用前一方法应归为S期，用后一方法则归为G1期。但用流式光度术测得V79-8细胞有G1期，而同时也测量V79细胞的G1期，这样就可以比较两者G1期的差异，结果是V79G1期的细胞多于V79-8，结合以往[3H]胸腺嘧啶核苷参入的结果[1，2]，说明M期结束后V79-8较V79更快进入S期开始DNA的合成。另外，PCC(premature chromasome condensation)的结果也表明V79-8细胞存在G1期[6，7]。这两种细胞G1期的差异为研究G1期的调控提供了很好的模型。同时，V79-8细胞周期的特殊性也使其成为细胞周期调控研究的极好模型，我们用反义的G1期调控因子CDK4、cyclin D3以及正义的p21Cip1转染V79-8细胞，都使其出现了明显的G1期，而用反义的cyclin B1转染V79-8细胞则出现了明显的G2期(将陆续发表)。
, 百拇医药
cyclin D1、D3为G1期cyclin，它们可以与CDK2、4、5结合，形成激酶复合物[8]，促进G1/S的转换。两者高水平的表达，使上述激酶活性提高，磷酸化下游底物，例如Rb蛋白磷酸化后可释放结合的转录因子E2F-1，促进DNA复制起始物的合成，加快向S期的转换。Id基因为分化抑制基因，具有抑制分化、促进增殖的作用，也是G1期的调控因子。在肌肉细胞中，Id基因的表达可以拮抗肌源性b-HLH调节因子(如MyoD)的作用，以达到抑制肌肉细胞分化的作用，说明Id基因在成纤维细胞的分化与增殖中起一定的作用，V79-8细胞中Id的高表达促进细胞G1/S的转换，加快细胞周期的运转[9]。另外，我们以往的研究发现反义Id基因可以抑制肿瘤细胞的生长，这从反面证实了Id的生长促进作用[10]。
Rao等[6]发现V79-8细胞中，DNA合成诱导物质水平在整个周期中保持不变，M期也保持较高水平，这样在进入下一轮周期时为起始DNA合成的准备期G1期就大大地缩短，甚至检测不出。从以上结果可以推测这些诱导物质就是推动G1/S转换的调控因子，其中就包括cyclin D1、cyclin D3和Id。
, 百拇医药
收稿1997-03 修回1997-05
参考文献
[1]Liskay B M.Absence of a measurable G2 phase in two Chinese hamster cell lines.Proc Natl Aca Sci USA,1977,74(4):1622
[2]Liskay B M.Most of the G1 period in hamster cells is eliminated by lengthening the S period.Proc Natl Aca Sci USA,1981,78(10):6295
[3]Tounekti O,Belehradek J Jr,Mir L M.Relationship between DNA fragment,chromasome condensation,and changes in folw cytometry profiles detected during apoptosis,Experimental Cell Research,1995,217(2):506
, 百拇医药
[4]Chomezynski P,Sacchi N.Singlestep RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochemistry,1987,167(2):156
[5]Sambrook J,Fritsch E F, Maniatis T.Molecular Cloning-A Laboratory Manual.2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:7.43-7.45
[6]Rao P N,Wilson B A,Sunkara P S.Inducers of DNA synthesis present during mitosis mammalian cells lacking G1 and G2 phases.Proc Natl Aca Sci USA,1978,75(10):5043
, 百拇医药
[7]王永潮，梁弗佑，王端顺，等.taxol对V79-8系细胞微核化机理的探讨.北京师范大学学报(自然科学版)，1990，27(2)：237
[8]Xiong Y,Zhang H,Beach D.D Type cyclins associate with multiple protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA.Cell,1992,71(4):505
[9]冯 洁，王永潮.分化抑制因子(Id)的研究进展.生理科学进展，1997，28(2)：139
[10]王永潮，朱兆文，陈德高等.反义Id基因转染细胞后TGF-α,βmRNA表达的研究.解剖学报，1996，27(4)：345
DIFFERENTIAL CELL CYCLE REGULATION BETWEEN
, http://www.100md.com
V79 AND V79-8 CELLS
V79 AND V79-8 CELLS
Jiang Hong,Feng Jie,WangYongchaoΔ
(The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing)
V79 and V79-8 are two Chinese hamster lung fibroblast cell lines which proliferate very rapidly.It is verified through [3H] thymidine incorporation assay that V79 cells have non-detectable G2 phase and V79-8 cells have neither G1 nor G2 phase.With flow cytometry,we found that V79 had obviously more G1 phase cells than V79-8 ,which indicates that they are different in G1 phase regulation.Comparing the mRNA expression levels of several regulators in G1 phase,we also found that the expression levels of cyclin D1,D3 and Id in V79-8 cells was obviously higher than that in V79 cells.This might cause the G1 difference between V79 and V79-8 cells directly.
KEY WORDS V79 cells; V79-8 cells; Cell cycle regulation; Cyclin; CDK
△The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080), http://www.100md.com
单位：北京师范大学生物系细胞增殖与调控生物学开放实验室，北京 100875
关键词：V79细胞；V79-8细胞；细胞周期调控；周期蛋白；周期蛋白依赖激酶
解剖学报/980412 摘 要 为了解V79和V79-8两种细胞周期及调控因子的差异，用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法检测两种细胞，发现V79细胞无可检测到的G2期；V79-8细胞则同时缺乏可检测到的G1和G2期。流式细胞光度术显示，V79G1期细胞明显多于V79-8，表明两者在G1期调控上存在差异。比较两者G1期周期调控因子的mRNA表达水平发现，V79-8cyclin D1,cyclin D3和Id表达水平明显高于V79，这可能直接导致了两者G1的差异。
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V79和V79-8为两种增殖速度非常快的中国仓鼠肺成纤维细胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它们的倍增时间分别为12.5h和9.5h。V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系，而V79-8是由Elkind和Sutton于1960年从母细胞系V79转化而来。70～80年代，用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法证实，V79细胞无可检测到的G2期；V79-8细胞则同时缺乏可检测到的G1和G2期[1，2]，但并没有对其细胞周期调控(cell cycle regulation)的分子机制做更为深入的研究。
我们利用现有的在细胞周期G1期中起关键作用的CDK、cyclin、Id等基因为探针，对它们在V79、V79-8细胞的mRNA表达水平进行比较，以期对其周期调控有更为深入的了解。我们的结果表明：V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的RNA表达水平明显高于V79细胞，这可能直接导致了这两种细胞在G1期调控的差异。
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材料和方法
1.细胞培养
V79细胞由上海细胞所细胞库提供，V79-8细胞由M D Anderson肿瘤中心Rao PN博士赠送，均培养于DMEM(GIBCO BRL)培养基(10%小牛血清，105IU/L青霉素，100mg/L链霉素)，37℃，5%CO2的孵育箱中。
2.流式细胞光度术(FCM)
细胞经胰酶消化后，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20℃固定，12h后，样品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L无DNase的RNase，37℃保温30min，之后加入1g/L的溴化丙啶(propidium iodide,PI Sigma公司)，37℃保温30min，样品4℃避光保存，并在24h内测量[3]。
, 百拇医药
3.Northern杂交(Northern bolotting)
细胞总RNA用异硫氰酸胍一步法提取[4]，上样量为15μg，甲醛变性凝胶电泳后，真空转移至尼龙膜上[5]，杂交所用探针为自制的体外转录[α-32P]rUTP 标记单链反义RNA(Promega,Technical Manual)，其载体、RNA聚合酶及转录本长度如下：pGEM3z-β-actin-sp6-0.56kb;pSK-CDK4-T3-1.3kb;pGEM4z-CycD1-sp6-1.14kb;pXJ41-CycD3(antisense)-T7-1.96kb;pSK-Id-T7-0.93kb。
结果
细胞流式光度术的结果表明V79比V79-8的G1期细胞多了17%，这说明两者在G1期的调控上存在明显差别(图1)。
, 百拇医药
从Northern杂交的结果可以看出，V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的mRNA表达水平明显高于V79细胞，而CDK4的表达无明显差别。这些基因高水平的表达可能造成V79-8细胞中DNA合成在M期结束后马上开始，从而使细胞增殖速度加快，细胞始终处于快速增殖的状态，在周期时相上表现为G1期缩短以至难以检测(图2)。
图1 V79和V79-8细胞的流式细胞光度术曲线
Fig.1 FCM curves of V79 and V79-8cells
A:V79； B：V79-8
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图2 V79和V79-8细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4、Id基因的Northern
杂交分析
RNA探针：1.cyclin D1 2.cyclin D3 3.CDK4 4.Id a.V79 b.V79-8
Fig.2 Northern blotting analysis of cyclinD1,cyclinD3,CDK4,Id genes expression in V79 and V79-8 cells
Riboprobes:1.cyclin D1; 2.cyclinD3; 3.CDK4; 4.Id
, 百拇医药
a.V79； b.V79-8
讨论
由于[3H]胸腺嘧啶核苷参入法和流式细胞光度术方法上的差异，使得两者在细胞周期分析时可以得到不同的结果。前者以是否标记上[H3]胸腺嘧啶核苷来划分是否属于S期，而后者是以DNA的含量来给细胞分期的，如果细胞只有极少量的DNA合成，那么用前一方法应归为S期，用后一方法则归为G1期。但用流式光度术测得V79-8细胞有G1期，而同时也测量V79细胞的G1期，这样就可以比较两者G1期的差异，结果是V79G1期的细胞多于V79-8，结合以往[3H]胸腺嘧啶核苷参入的结果[1，2]，说明M期结束后V79-8较V79更快进入S期开始DNA的合成。另外，PCC(premature chromasome condensation)的结果也表明V79-8细胞存在G1期[6，7]。这两种细胞G1期的差异为研究G1期的调控提供了很好的模型。同时，V79-8细胞周期的特殊性也使其成为细胞周期调控研究的极好模型，我们用反义的G1期调控因子CDK4、cyclin D3以及正义的p21Cip1转染V79-8细胞，都使其出现了明显的G1期，而用反义的cyclin B1转染V79-8细胞则出现了明显的G2期(将陆续发表)。
, 百拇医药
cyclin D1、D3为G1期cyclin，它们可以与CDK2、4、5结合，形成激酶复合物[8]，促进G1/S的转换。两者高水平的表达，使上述激酶活性提高，磷酸化下游底物，例如Rb蛋白磷酸化后可释放结合的转录因子E2F-1，促进DNA复制起始物的合成，加快向S期的转换。Id基因为分化抑制基因，具有抑制分化、促进增殖的作用，也是G1期的调控因子。在肌肉细胞中，Id基因的表达可以拮抗肌源性b-HLH调节因子(如MyoD)的作用，以达到抑制肌肉细胞分化的作用，说明Id基因在成纤维细胞的分化与增殖中起一定的作用，V79-8细胞中Id的高表达促进细胞G1/S的转换，加快细胞周期的运转[9]。另外，我们以往的研究发现反义Id基因可以抑制肿瘤细胞的生长，这从反面证实了Id的生长促进作用[10]。
Rao等[6]发现V79-8细胞中，DNA合成诱导物质水平在整个周期中保持不变，M期也保持较高水平，这样在进入下一轮周期时为起始DNA合成的准备期G1期就大大地缩短，甚至检测不出。从以上结果可以推测这些诱导物质就是推动G1/S转换的调控因子，其中就包括cyclin D1、cyclin D3和Id。
, 百拇医药
收稿1997-03 修回1997-05
参考文献
[1]Liskay B M.Absence of a measurable G2 phase in two Chinese hamster cell lines.Proc Natl Aca Sci USA,1977,74(4):1622
[2]Liskay B M.Most of the G1 period in hamster cells is eliminated by lengthening the S period.Proc Natl Aca Sci USA,1981,78(10):6295
[3]Tounekti O,Belehradek J Jr,Mir L M.Relationship between DNA fragment,chromasome condensation,and changes in folw cytometry profiles detected during apoptosis,Experimental Cell Research,1995,217(2):506
, 百拇医药
[4]Chomezynski P,Sacchi N.Singlestep RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochemistry,1987,167(2):156
[5]Sambrook J,Fritsch E F, Maniatis T.Molecular Cloning-A Laboratory Manual.2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:7.43-7.45
[6]Rao P N,Wilson B A,Sunkara P S.Inducers of DNA synthesis present during mitosis mammalian cells lacking G1 and G2 phases.Proc Natl Aca Sci USA,1978,75(10):5043
, 百拇医药
[7]王永潮，梁弗佑，王端顺，等.taxol对V79-8系细胞微核化机理的探讨.北京师范大学学报(自然科学版)，1990，27(2)：237
[8]Xiong Y,Zhang H,Beach D.D Type cyclins associate with multiple protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA.Cell,1992,71(4):505
[9]冯 洁，王永潮.分化抑制因子(Id)的研究进展.生理科学进展，1997，28(2)：139
[10]王永潮，朱兆文，陈德高等.反义Id基因转染细胞后TGF-α,βmRNA表达的研究.解剖学报，1996，27(4)：345
DIFFERENTIAL CELL CYCLE REGULATION BETWEEN
, http://www.100md.com
V79 AND V79-8 CELLS
V79 AND V79-8 CELLS
Jiang Hong,Feng Jie,WangYongchaoΔ
(The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing)
V79 and V79-8 are two Chinese hamster lung fibroblast cell lines which proliferate very rapidly.It is verified through [3H] thymidine incorporation assay that V79 cells have non-detectable G2 phase and V79-8 cells have neither G1 nor G2 phase.With flow cytometry,we found that V79 had obviously more G1 phase cells than V79-8 ,which indicates that they are different in G1 phase regulation.Comparing the mRNA expression levels of several regulators in G1 phase,we also found that the expression levels of cyclin D1,D3 and Id in V79-8 cells was obviously higher than that in V79 cells.This might cause the G1 difference between V79 and V79-8 cells directly.
KEY WORDS V79 cells; V79-8 cells; Cell cycle regulation; Cyclin; CDK
△The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing 100875,China
* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080), http://www.100md.com