面口部炎症刺激增强CGRPmRNA、PPTAmRNA及NOS在大鼠三叉神经节中的表达*
作者：武胜昔 王亚云 李云庆 施际武
单位：第四军医大学解剖学教研室、梁琚脑研究中心，西安 710032
关键词：CGRPmRNA；；PPTAmRNA；一氧化氮合酶；三叉神经节；伤害性刺激；组织化学；原位杂交组织化学
解剖学报/980406 摘 要 为了研究CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS在伤害性刺激后大鼠TG中合成和表达的变化，将4%鹿角菜胶(CAR)溶液注射到大鼠一侧口周皮下作为伤害性刺激模型，用NADPH-d组织化学法结合CGRP、PPTA mRNAs原位杂交组织化学法对此进行了观察。结果显示：对照组大鼠TG中约有32.2%、16.2%和10%的神经元分别呈CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性。CAR刺激后，在刺激侧TG、CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性神经元的数量均增多，其阳性率分别达到了38.6%、22.8%和14.2%。TG中约有6.8%和7.3%的神经元同时呈NOS和CGRP mRNA或NOS 和PPTA mRNA 阳性，CAR 刺激使得两种双标神经元的数量也明显增多，双标细胞占TG细胞总数的百分比分别达到了11.0%和10.9%，而且刺激后增加的NOS阳性神经元主要为双标神经元。上述结果提示CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性神经元，尤其是共存神经元可能在面口部伤害性信息的传递和调节中起重要作用，伤害性刺激所诱导的NOS合成的增加与CGRPmRNA和PPTAmRNA表达的增强可能有密切的关系。
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P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)是与伤害性信息传递有关的神经递质，在三叉神经节(TG)中存在着大量的SP和CGRP免疫阳性神经元[1]。编码SP的前原速激肽A(PPTA)mRNA和CGRP mRNA 在TG中也有高水平的表达[2，3]。外周给予伤害性刺激，如皮下注射福尔马林，鹿角菜胶和完全福氏佐剂等可以增强SP和CGRP及其前体mRNA在背根节(DRG)或TG初级传入神经元中的表达[4，5]。一氧化氮(NO)是一种新型的内源性的神经信息物质，在中枢神经系统的信号转导中起着重要的作用[6]。利用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学方法，可以显示一氧化氮合酶(NOS)在神经系统的分布状况，从而确定NO的生成部位[7]。在TG中存在着NOS阳性神经元，而且NOS和SP或CGRP可共存于TG神经元[8，9]。以往的研究表明，伤害性刺激反应的产生有赖于NMDA受体的激活和NO的产生，外周伤害性刺激条件下，脊髓背角NOS的含量明显增多[6]，说明NO在伤害性信息的中枢处理和调控中起着非常重要的作用。但是在面口部伤害性刺激条件下，NOS在TG中的变化以及与PPTA和CGRP mRNA 表达的关系，还是一个需要探讨的问题。本研究利用NADPH-d组织化学技术结合 PPTA mRNA、CGRP mRNA原位杂交技术，对上述问题进行了研究。
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材料和方法
1.动物准备
SD大鼠12只，体重250～300g，分成2组。第1组(8只)为实验组，在乙醚麻醉下将150μl含4%鹿角菜胶(carrageenan,CAR;Sigma)的生理盐水注射到左侧口周皮下；第2组(4只)为对照组，在乙醚麻醉下，将150μl生理盐水注射到左侧口周皮下。各组大鼠均存活3d后处死。
2.探针标记
实验所用CGRP和PPTA探针均为寡核苷酸探针，分别含35和30个碱基。其序列分别与大鼠脑内各自相应的mRNA的一部分(自第664号碱基到第698号碱基和第175号碱基到第204号碱基)相互补。用3′末端标记法及[α-35S]dATP(Amersham)进行标记。标记探针的特异性比放射性为(1.6～2.0)×109dpm/μg。
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3.NADPH-d组织化学反应和原位杂交组织化学反应程序
戊巴比妥钠深麻下，经左心室插管至升主动脉，先用100ml生理盐水冲净血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)500ml灌注固定。取双侧TG，置同样固定液中后固定30min(4℃)，再移入含30%蔗糖的0.1mol/L PB中(4℃)过夜。恒冷箱切片机水平冻切，片厚20μm，切片分成2组收集。第1组行Nissl染色；第2组行NADPH-d组织化学法结合CGRP mRNA和PPTA mRNA原位杂交法处理反应。具体过程如下：切片入含0.5g/L β-NADPH(Sigma,Type Ⅳ)，0.6g/L硝基四氮唑蓝(NBT)和0.3% Triton X-100的0.1mol/L PB(pH8.0)中，37℃孵育约60min。经0.01 mol/L PBS冲洗后，切片裱于经明胶-铬明矾处理的载玻片上，置室温干燥，然后行原位杂交反应。
切片经0.1mol/L PB冲洗后，入杂交前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)，然后经系列酒清和氯仿脱水、脱脂。杂交时将200μl杂交液(含4×SSC，50%甲酰胺，0.025% tRNA，10%硫酸葡聚糖和10×Denhart液)，15μl DTT和标记探针[(6～9)×106dpm/载玻片]滴加到切片表面，40℃孵育48h。杂交后用1×SSC冲洗切片(55℃，3×20min)。经梯度酒精脱水后于室温中干燥，然后将Amersham LM-1 型乳胶(用蒸馏水1∶1稀释)涂在切片表面，置暗盒中4℃曝光。4周后，用D-19显影液和F-5坚膜定影液处理。水洗后进行脱水、透明、封片，光镜下明暗视野观察。
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另用部分切片在行 NADPH-d组织化学反应时，反应液中不加β-NADPH或在行原位杂交反应时，将既含标记探针又含过量的未标记探针的杂交液孵育切片，结果为阴性。
4.观察、计数和数据处理
于各时间点对每只大鼠的切片用显微镜在明视野下计数阳性神经元的数量。阳性神经元胞浆表面银颗粒密度应高于背底5倍以上(即信/噪比>5)。用Leica Q 500Mc图像分析仪对阳性结构的密度进行测定。对上述各组数据进行方差分析。
结 果
在对照组大鼠TG中，约有32.2%和16.2%的神经元被CGRP和PPTA探针标记(胞浆表面银颗粒密度大于背底5倍以上的神经元视为阳性神经元)。阳性神经元中大(直径≥40μm)、中(20～39μm)、小(直径≤19μm)神经元均有，但以中、小型神经元为主。CAR注射后，注射侧TG中CCRP mRNA 和PPTA mRNA 阳性神经元的数量分别达到了38.6%和22.8%，与未注射侧和对照组相比有明显差异，两侧的差异主要出现于刺激后6～24h。(图1～4，表1～3)。
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图1，2 CGRP mRNA 在CAR 注射3d后的注射侧(5)和对照侧(6)TG中的表达
图3，4 PPTA mRNA 在CAR 注射3d后的注射侧(3)和对照侧(4)TG中的表达
Fig.1,2 Expression of CGRP mRNA in the TG on the contralateral side(1) and ipsilateral side(2) 3d after CAR injection.
Fig.3,4 Expression of PPTA mRNA in the TG on the contralateral side(3) and ipsilateral side(4)3d after CAR injection.
TG中NOS阳性神经元呈蓝黑色，NOS阳性产物充满于胞浆内。NOS阳性神经元约占TG神经元总数的10%，主要为中、小型神经元。给予CAR刺激后，刺激侧TG中NOS阳性神经元的数量较未刺激侧略有增多，达到14.2%，也主要表现于刺激后6～24h(图5，6；表1～3)。
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图5，6 NOS阳性神经元在CAR 注射3d后的注射侧(5)和对照侧(6)TG中的分布。图6中的标尺代表图1～4，为100μm
Fig.5,6 NOS positive neurons in the TG on the contralateral side(5) and ipsilateral side(6)3d after CAR injection.Bar in Fig.6 for Fig.s 1～6 is 100μm.
在对照组大鼠TG中，分别有68.8%和71.8%的NOS阳性神经元同时呈CGRP mRNA和PPTA mRNA阳性，这些双标神经元分别占TG神经元总数的6.8%和7.3%，且均为中、小型神经元(图7，8)。注射CAR后，双标神经元的数量也明显增加。NOS和CGRP mRNA 以及NOS和PPTA mRNA双标神经元的数量较对照组分别增加了4.2%和3.6%。
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图7 NOS和CGRP mRNA在TG神经元中的共存。(↑)示NOS/CGRP mRNA共存神经元 (△)和(▲)分别示NOS和CGRP mRNA单标神经元
图8 NOS和PPTA mRNA 在TG神经元中的共存。(↑)示NOS/PPTA mRNA 共存神经元 (△)和(▲)分别示NOS和PPTA mRNA 单标神经元。图8中的标尺代表图7～8，为30μm
Fig.7 Co-localization of NOS and CGRP mRNA in the neurons of TG.(↑)indicate double-labeled neurons;(△)and(▲)indicate NOS and CGRP mRNA single-labeled neurons,respectively.
Fig.8 Co-localization of NOS and PPTA mRNA in the neurons of TG.(↑)indicate double-labeled neurons;(△)and(▲)indicate NOS and PPTA mRNA single-labeled neurons,respectively.Bar in Fig.8 for Figs.7-8 is 30μm.
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表1 福尔马林刺激后不同时间点TG内CGRP mRNA、PPTA mRNA
和NOS 阳性神经元的数量(
±s)
Table 1 Total number of CGRP mRNA、PPTA mRNA and NOS positive neurons
in the TG(±s)
CGRP mRNA
PPTA mRNA
NOS
, 百拇医药 刺激侧
ipsi
对照侧
contra
刺激侧
ipsi
对照侧
contra
刺激侧
ipsi
对照侧
contra
对照组
, 百拇医药
(control group)
35.2±0.9
35.4±1.1
17.6±0.4
17.7±0.4
11.0±0.9
11.1±0.7
实验组
(stimulated group)
0.5h
30.6±1.1
30.4±1.7
, 百拇医药
17.9±0.6
17.8±0.5
10.9±0.8
10.9±0.9
2h
31.1±1.3
30.6±0.9
18.2±0.9
17.9±0.7
11.2±1.5
10.9±1.3
6h
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36.1±0.8**
31.2±0.7
21.1±0.9**
18.8±0.9
13.9±0.8**
11.0±0.5
12h
34.9±2.0*
30.6±1.8
20.4±0.8*
17.9±0.8
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12.5±1.1*
10.9±1.0
24h
38.1±1.9**
32.3±1.7
23.3±1.1**
18.9±0.6
14.3±0.6*
11.1±0.5
48h
33.2±1.1
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31.6±0.9
19.4±0.6
18.5±0.5
11.9±0.5
11.4±0.4
*P<0.05 **P<0.001 刺激侧vs对照侧；配对t检验 stimulated side vs control side;paired t test.表2 CGRP mRNA和NOS 阳性神经元在TG中的数量(±s%)
Table 2 CGRP mRNA and NOS positive neurons in the TG(±s%)
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NOS/TG
CGRP mRNA/TG
NOS+CGRP mRNA/TG
NOS+CGRP mRNA/NOS
对照组(control group)
9.7±0.9
32.2±1.4
6.8±0.9
68.8±2.1
刺激组(stimulated group)
14.0±0.8*
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38.6±1.1*
10.6±0.7*
78.6±1.9*
与对照组相比 P<0.05 P<0.05,compared with control group.表3 PPTA mRNA和NOS 阳性神经元在TG中的数量(±s%)
Table 3 PPTA mRNA and NOS positive neurons in the TG(±s%)
NOS/TG
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PPTA mRNA/TG
NOS+PPTA mRNA/TG
NOS+PPTA mRNA/NOS
对照组(control group)
10.2±0.4
16.2±1.2
7.3±0.6
71.8±2.2
刺激组(stimulated group)
14.4±0.6*
22.8±1.2*
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10.9±0.9*
75.7±2.1
与对照组相比 P<0.05 P<0.05,compared with control group. 在对照组大鼠，注射生理盐水侧和未注射侧的TG中，NOS、CGRP mRNA 和PPTA mRNA阳性神经元的数量没有明显变化。
讨 论
NO作为一种新型的神经信息分子，在周围和中枢神经系统的突触传递过程中有着重要作用[6]。许多证据表明，NO还参与中枢神经系统痛信息的传递及处理[10]。椎管内给予NO抑制剂L-NAME 可阻断机械性伤害性刺激诱导的FOS 在脊髓后角的表达[11]。系统性或椎管内给予L-NAME，可大大减弱由NMDA 诱导的痛觉过敏，而L-精氨酸(内源性的NOS底物)可部分反转这种作用[12]。因此，NO在参与机体痛觉过敏的形成中起着重要作用。本研究发现，TG中NOS阳性神经元均为中、小型神经元，大多数NOS阳性神经元同时呈CGRP mRNA 或PPTA mRNA 阳性。给予CRA 刺激后，刺激侧TG中NOS阳性神经元的数量明显增多，说明伤害性刺激可以增加NOS在TG神经元中的含量，使正常时含NOS较少，一般不易检出的NOS阳性TG神经元变得易于检出，提示NO在面口部伤害性信息的传递中有重要作用。
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多种类型的伤害性刺激均可增强CGRP 和PPTA mRNAs在初级感觉神经元中的表达。本研究结果发现CAR 产生的炎性刺激也使得CGRP 和PPTA mRNAs 阳性神经元在TG神经元中的数量增多，这与我们以往用福尔马林作为伤害性刺激剂所得到的结果一致[2]。还有证据表明，初级感觉神经元合成的CGRP 和SP，在外周炎性刺激条件下从中枢或周围末梢释放增加[13，14]。上述结果表明：CGRP 和SP在参与伤害性信息的中枢传递以及在外周炎症的产生和维持中，均起着重要的作用。
TG中有6.8%和7.3%的神经元分别为NOS和CGRP mRNA 或NOS 和PPTA mRNA 共存神经元，这些共存神经元分别占NOS阳性神经元的68.8%和71.8%。这与Aimi[8]和赵经纬[9]等的结果有一定的差异。他们的研究发现TG中约85%和90%的NOS阳性神经元同时为CGRP或SP免疫组织化学染色阳性。结果的差异可能是由于实验方法、操作条件以及阳性结果的判定标准等的不同所致。给予CAR 刺激后，刺激侧TG中共存神经元的数量也明显增多。NOS与CGRP mRNA 或PPTA mRNA 双标神经元的百分比分别达到了10.6%和10.9%。以往研究表明：TG中分别与CGRP 和SP共存的NOS阳性神经元多数发出纤维投射至三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)的浅层[9]，而Vc浅层是传导面口部伤害性信息纤维的主要终止区，因此，NOS与CGRP mRNA 或PPTA mRNA共存的神经元在面口部伤害性信息的传递中可能起重要作用。
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本研究还发现CAR 刺激后，NOS阳性神经元的数量较刺激前分别增加了4.3%和4.2%，而NOS与CGRP mRNA 以及NOS与PPTA mRNA 共存神经元的数量则分别增加了3.8%和3.6%。由此可以看出，CAR刺激后NOS阳性神经元的增多主要为共存神经元的增多，进一步说明NOS与CGRP 或SP共存神经元在面口部伤害性信息传递中的重要作用，同时还提示伤害性刺激所诱导的NOS合成的增加与CGRP mRNA和PPTA mRNA表达的增强有密切关系。
关于NO与CGRP 和SP的关系，目前尚未完全明了。Garry等[15]利用脊髓片灌流技术发现NO的供体硝普钠可以增强SP和CGRP 从脊髓后角释放。辣椒素处理明显减弱硝普钠的作用，提示NO可引起CGRP 和SP从初级传入末梢释放。而神经激肽1受体(NK1)受体的激活在NO的合成过程中也起着重要的作用[12]。结合本研究的结果可以看出，NO和CGRP、SP存在着较为复杂，相互协调的作用关系，但其相互作用的机制尚需深入的研究。
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参考文献
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[13]Garry MG,Hargreaves KM.Enhanced release of immunoreactive CGRP and substance P from spinal dorsal slices occurs during carrageenan inflammation.Brain Res,1992,582(1):139
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INCREASED EXPRESSION OF CGRP mRNA,PPTA mRNA
AND NITRIC OXIDE SYNTHASE IN RAT TRIGEMINAL
GANGLION AFTER CARRAGEENAN-INDUCED
INFLAMMATION
Wu Shengxi,Wang Yayun,Li Yunqing△,Shi Jiwu
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
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The changes of CGRP mRNA,PPTA mRNA and nitric oxide synthase(NOS) expression were examined using NADPH-d histochemistry combined with in situ hybridization histochemistry after carrageenan (CAR) induced inflammation.The results showed that about 32.2%，16.2% and 10% trigeminal ganglion(TG) neurons were CGRP mRNA,PPTA mRNA and NOS positive neurons.The numbers of these positive neurons increased significantly after CAR injection.The percentage of these positive neurons reached to 38.6%,22.8% and 14.2%,respectively.About 6.8% and 7.3% of TG neurons were NOS and CGRP mRNA or NOS and PPTA mRNA colocalization neurons.These neurons were small to medium in size.CAR stimulation also resulted in the increase in the number of these colocalization neurons.Collectively,these data suggest that NOS,CGRP mRNA and PPTA mRNA positive neurons,especially their colocalization neurons,might play important roles in oro-facial nociceptive processing.
KEY WORDS CGRP mRNA;PPTA mRNA;Nitric oxide synthase;Noxious stimulation;Trigeminal ganglion;Histochemistry;In situ hybridization histochemistry
△ Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
* 国家杰出青年科学基金资助课题(No.39625011), 百拇医药
单位：第四军医大学解剖学教研室、梁琚脑研究中心，西安 710032
关键词：CGRPmRNA；；PPTAmRNA；一氧化氮合酶；三叉神经节；伤害性刺激；组织化学；原位杂交组织化学
解剖学报/980406 摘 要 为了研究CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS在伤害性刺激后大鼠TG中合成和表达的变化，将4%鹿角菜胶(CAR)溶液注射到大鼠一侧口周皮下作为伤害性刺激模型，用NADPH-d组织化学法结合CGRP、PPTA mRNAs原位杂交组织化学法对此进行了观察。结果显示：对照组大鼠TG中约有32.2%、16.2%和10%的神经元分别呈CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性。CAR刺激后，在刺激侧TG、CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性神经元的数量均增多，其阳性率分别达到了38.6%、22.8%和14.2%。TG中约有6.8%和7.3%的神经元同时呈NOS和CGRP mRNA或NOS 和PPTA mRNA 阳性，CAR 刺激使得两种双标神经元的数量也明显增多，双标细胞占TG细胞总数的百分比分别达到了11.0%和10.9%，而且刺激后增加的NOS阳性神经元主要为双标神经元。上述结果提示CGRPmRNA、PPTAmRNA和NOS阳性神经元，尤其是共存神经元可能在面口部伤害性信息的传递和调节中起重要作用，伤害性刺激所诱导的NOS合成的增加与CGRPmRNA和PPTAmRNA表达的增强可能有密切的关系。
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P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)是与伤害性信息传递有关的神经递质，在三叉神经节(TG)中存在着大量的SP和CGRP免疫阳性神经元[1]。编码SP的前原速激肽A(PPTA)mRNA和CGRP mRNA 在TG中也有高水平的表达[2，3]。外周给予伤害性刺激，如皮下注射福尔马林，鹿角菜胶和完全福氏佐剂等可以增强SP和CGRP及其前体mRNA在背根节(DRG)或TG初级传入神经元中的表达[4，5]。一氧化氮(NO)是一种新型的内源性的神经信息物质，在中枢神经系统的信号转导中起着重要的作用[6]。利用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学方法，可以显示一氧化氮合酶(NOS)在神经系统的分布状况，从而确定NO的生成部位[7]。在TG中存在着NOS阳性神经元，而且NOS和SP或CGRP可共存于TG神经元[8，9]。以往的研究表明，伤害性刺激反应的产生有赖于NMDA受体的激活和NO的产生，外周伤害性刺激条件下，脊髓背角NOS的含量明显增多[6]，说明NO在伤害性信息的中枢处理和调控中起着非常重要的作用。但是在面口部伤害性刺激条件下，NOS在TG中的变化以及与PPTA和CGRP mRNA 表达的关系，还是一个需要探讨的问题。本研究利用NADPH-d组织化学技术结合 PPTA mRNA、CGRP mRNA原位杂交技术，对上述问题进行了研究。
, 百拇医药
材料和方法
1.动物准备
SD大鼠12只，体重250～300g，分成2组。第1组(8只)为实验组，在乙醚麻醉下将150μl含4%鹿角菜胶(carrageenan,CAR;Sigma)的生理盐水注射到左侧口周皮下；第2组(4只)为对照组，在乙醚麻醉下，将150μl生理盐水注射到左侧口周皮下。各组大鼠均存活3d后处死。
2.探针标记
实验所用CGRP和PPTA探针均为寡核苷酸探针，分别含35和30个碱基。其序列分别与大鼠脑内各自相应的mRNA的一部分(自第664号碱基到第698号碱基和第175号碱基到第204号碱基)相互补。用3′末端标记法及[α-35S]dATP(Amersham)进行标记。标记探针的特异性比放射性为(1.6～2.0)×109dpm/μg。
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3.NADPH-d组织化学反应和原位杂交组织化学反应程序
戊巴比妥钠深麻下，经左心室插管至升主动脉，先用100ml生理盐水冲净血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH7.4)500ml灌注固定。取双侧TG，置同样固定液中后固定30min(4℃)，再移入含30%蔗糖的0.1mol/L PB中(4℃)过夜。恒冷箱切片机水平冻切，片厚20μm，切片分成2组收集。第1组行Nissl染色；第2组行NADPH-d组织化学法结合CGRP mRNA和PPTA mRNA原位杂交法处理反应。具体过程如下：切片入含0.5g/L β-NADPH(Sigma,Type Ⅳ)，0.6g/L硝基四氮唑蓝(NBT)和0.3% Triton X-100的0.1mol/L PB(pH8.0)中，37℃孵育约60min。经0.01 mol/L PBS冲洗后，切片裱于经明胶-铬明矾处理的载玻片上，置室温干燥，然后行原位杂交反应。
切片经0.1mol/L PB冲洗后，入杂交前处理液(含0.9%氯化钠、1.5%三乙醇胺和0.25%乙酸酐)，然后经系列酒清和氯仿脱水、脱脂。杂交时将200μl杂交液(含4×SSC，50%甲酰胺，0.025% tRNA，10%硫酸葡聚糖和10×Denhart液)，15μl DTT和标记探针[(6～9)×106dpm/载玻片]滴加到切片表面，40℃孵育48h。杂交后用1×SSC冲洗切片(55℃，3×20min)。经梯度酒精脱水后于室温中干燥，然后将Amersham LM-1 型乳胶(用蒸馏水1∶1稀释)涂在切片表面，置暗盒中4℃曝光。4周后，用D-19显影液和F-5坚膜定影液处理。水洗后进行脱水、透明、封片，光镜下明暗视野观察。
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另用部分切片在行 NADPH-d组织化学反应时，反应液中不加β-NADPH或在行原位杂交反应时，将既含标记探针又含过量的未标记探针的杂交液孵育切片，结果为阴性。
4.观察、计数和数据处理
于各时间点对每只大鼠的切片用显微镜在明视野下计数阳性神经元的数量。阳性神经元胞浆表面银颗粒密度应高于背底5倍以上(即信/噪比>5)。用Leica Q 500Mc图像分析仪对阳性结构的密度进行测定。对上述各组数据进行方差分析。
结 果
在对照组大鼠TG中，约有32.2%和16.2%的神经元被CGRP和PPTA探针标记(胞浆表面银颗粒密度大于背底5倍以上的神经元视为阳性神经元)。阳性神经元中大(直径≥40μm)、中(20～39μm)、小(直径≤19μm)神经元均有，但以中、小型神经元为主。CAR注射后，注射侧TG中CCRP mRNA 和PPTA mRNA 阳性神经元的数量分别达到了38.6%和22.8%，与未注射侧和对照组相比有明显差异，两侧的差异主要出现于刺激后6～24h。(图1～4，表1～3)。
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图1，2 CGRP mRNA 在CAR 注射3d后的注射侧(5)和对照侧(6)TG中的表达
图3，4 PPTA mRNA 在CAR 注射3d后的注射侧(3)和对照侧(4)TG中的表达
Fig.1,2 Expression of CGRP mRNA in the TG on the contralateral side(1) and ipsilateral side(2) 3d after CAR injection.
Fig.3,4 Expression of PPTA mRNA in the TG on the contralateral side(3) and ipsilateral side(4)3d after CAR injection.
TG中NOS阳性神经元呈蓝黑色，NOS阳性产物充满于胞浆内。NOS阳性神经元约占TG神经元总数的10%，主要为中、小型神经元。给予CAR刺激后，刺激侧TG中NOS阳性神经元的数量较未刺激侧略有增多，达到14.2%，也主要表现于刺激后6～24h(图5，6；表1～3)。
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图5，6 NOS阳性神经元在CAR 注射3d后的注射侧(5)和对照侧(6)TG中的分布。图6中的标尺代表图1～4，为100μm
Fig.5,6 NOS positive neurons in the TG on the contralateral side(5) and ipsilateral side(6)3d after CAR injection.Bar in Fig.6 for Fig.s 1～6 is 100μm.
在对照组大鼠TG中，分别有68.8%和71.8%的NOS阳性神经元同时呈CGRP mRNA和PPTA mRNA阳性，这些双标神经元分别占TG神经元总数的6.8%和7.3%，且均为中、小型神经元(图7，8)。注射CAR后，双标神经元的数量也明显增加。NOS和CGRP mRNA 以及NOS和PPTA mRNA双标神经元的数量较对照组分别增加了4.2%和3.6%。
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图7 NOS和CGRP mRNA在TG神经元中的共存。(↑)示NOS/CGRP mRNA共存神经元 (△)和(▲)分别示NOS和CGRP mRNA单标神经元
图8 NOS和PPTA mRNA 在TG神经元中的共存。(↑)示NOS/PPTA mRNA 共存神经元 (△)和(▲)分别示NOS和PPTA mRNA 单标神经元。图8中的标尺代表图7～8，为30μm
Fig.7 Co-localization of NOS and CGRP mRNA in the neurons of TG.(↑)indicate double-labeled neurons;(△)and(▲)indicate NOS and CGRP mRNA single-labeled neurons,respectively.
Fig.8 Co-localization of NOS and PPTA mRNA in the neurons of TG.(↑)indicate double-labeled neurons;(△)and(▲)indicate NOS and PPTA mRNA single-labeled neurons,respectively.Bar in Fig.8 for Figs.7-8 is 30μm.
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表1 福尔马林刺激后不同时间点TG内CGRP mRNA、PPTA mRNA
和NOS 阳性神经元的数量(
±s)Table 1 Total number of CGRP mRNA、PPTA mRNA and NOS positive neurons
in the TG(
±s)CGRP mRNA
PPTA mRNA
NOS
, 百拇医药 刺激侧
ipsi
对照侧
contra
刺激侧
ipsi
对照侧
contra
刺激侧
ipsi
对照侧
contra
对照组
, 百拇医药
(control group)
35.2±0.9
35.4±1.1
17.6±0.4
17.7±0.4
11.0±0.9
11.1±0.7
实验组
(stimulated group)
0.5h
30.6±1.1
30.4±1.7
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17.9±0.6
17.8±0.5
10.9±0.8
10.9±0.9
2h
31.1±1.3
30.6±0.9
18.2±0.9
17.9±0.7
11.2±1.5
10.9±1.3
6h
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36.1±0.8**
31.2±0.7
21.1±0.9**
18.8±0.9
13.9±0.8**
11.0±0.5
12h
34.9±2.0*
30.6±1.8
20.4±0.8*
17.9±0.8
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12.5±1.1*
10.9±1.0
24h
38.1±1.9**
32.3±1.7
23.3±1.1**
18.9±0.6
14.3±0.6*
11.1±0.5
48h
33.2±1.1
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31.6±0.9
19.4±0.6
18.5±0.5
11.9±0.5
11.4±0.4
*P<0.05 **P<0.001 刺激侧vs对照侧；配对t检验 stimulated side vs control side;paired t test.表2 CGRP mRNA和NOS 阳性神经元在TG中的数量(
±s%)Table 2 CGRP mRNA and NOS positive neurons in the TG(
±s%), http://www.100md.com
NOS/TG
CGRP mRNA/TG
NOS+CGRP mRNA/TG
NOS+CGRP mRNA/NOS
对照组(control group)
9.7±0.9
32.2±1.4
6.8±0.9
68.8±2.1
刺激组(stimulated group)
14.0±0.8*
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38.6±1.1*
10.6±0.7*
78.6±1.9*
与对照组相比 P<0.05 P<0.05,compared with control group.表3 PPTA mRNA和NOS 阳性神经元在TG中的数量(
±s%)Table 3 PPTA mRNA and NOS positive neurons in the TG(
±s%)NOS/TG
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PPTA mRNA/TG
NOS+PPTA mRNA/TG
NOS+PPTA mRNA/NOS
对照组(control group)
10.2±0.4
16.2±1.2
7.3±0.6
71.8±2.2
刺激组(stimulated group)
14.4±0.6*
22.8±1.2*
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10.9±0.9*
75.7±2.1
与对照组相比 P<0.05 P<0.05,compared with control group. 在对照组大鼠，注射生理盐水侧和未注射侧的TG中，NOS、CGRP mRNA 和PPTA mRNA阳性神经元的数量没有明显变化。
讨 论
NO作为一种新型的神经信息分子，在周围和中枢神经系统的突触传递过程中有着重要作用[6]。许多证据表明，NO还参与中枢神经系统痛信息的传递及处理[10]。椎管内给予NO抑制剂L-NAME 可阻断机械性伤害性刺激诱导的FOS 在脊髓后角的表达[11]。系统性或椎管内给予L-NAME，可大大减弱由NMDA 诱导的痛觉过敏，而L-精氨酸(内源性的NOS底物)可部分反转这种作用[12]。因此，NO在参与机体痛觉过敏的形成中起着重要作用。本研究发现，TG中NOS阳性神经元均为中、小型神经元，大多数NOS阳性神经元同时呈CGRP mRNA 或PPTA mRNA 阳性。给予CRA 刺激后，刺激侧TG中NOS阳性神经元的数量明显增多，说明伤害性刺激可以增加NOS在TG神经元中的含量，使正常时含NOS较少，一般不易检出的NOS阳性TG神经元变得易于检出，提示NO在面口部伤害性信息的传递中有重要作用。
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多种类型的伤害性刺激均可增强CGRP 和PPTA mRNAs在初级感觉神经元中的表达。本研究结果发现CAR 产生的炎性刺激也使得CGRP 和PPTA mRNAs 阳性神经元在TG神经元中的数量增多，这与我们以往用福尔马林作为伤害性刺激剂所得到的结果一致[2]。还有证据表明，初级感觉神经元合成的CGRP 和SP，在外周炎性刺激条件下从中枢或周围末梢释放增加[13，14]。上述结果表明：CGRP 和SP在参与伤害性信息的中枢传递以及在外周炎症的产生和维持中，均起着重要的作用。
TG中有6.8%和7.3%的神经元分别为NOS和CGRP mRNA 或NOS 和PPTA mRNA 共存神经元，这些共存神经元分别占NOS阳性神经元的68.8%和71.8%。这与Aimi[8]和赵经纬[9]等的结果有一定的差异。他们的研究发现TG中约85%和90%的NOS阳性神经元同时为CGRP或SP免疫组织化学染色阳性。结果的差异可能是由于实验方法、操作条件以及阳性结果的判定标准等的不同所致。给予CAR 刺激后，刺激侧TG中共存神经元的数量也明显增多。NOS与CGRP mRNA 或PPTA mRNA 双标神经元的百分比分别达到了10.6%和10.9%。以往研究表明：TG中分别与CGRP 和SP共存的NOS阳性神经元多数发出纤维投射至三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)的浅层[9]，而Vc浅层是传导面口部伤害性信息纤维的主要终止区，因此，NOS与CGRP mRNA 或PPTA mRNA共存的神经元在面口部伤害性信息的传递中可能起重要作用。
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本研究还发现CAR 刺激后，NOS阳性神经元的数量较刺激前分别增加了4.3%和4.2%，而NOS与CGRP mRNA 以及NOS与PPTA mRNA 共存神经元的数量则分别增加了3.8%和3.6%。由此可以看出，CAR刺激后NOS阳性神经元的增多主要为共存神经元的增多，进一步说明NOS与CGRP 或SP共存神经元在面口部伤害性信息传递中的重要作用，同时还提示伤害性刺激所诱导的NOS合成的增加与CGRP mRNA和PPTA mRNA表达的增强有密切关系。
关于NO与CGRP 和SP的关系，目前尚未完全明了。Garry等[15]利用脊髓片灌流技术发现NO的供体硝普钠可以增强SP和CGRP 从脊髓后角释放。辣椒素处理明显减弱硝普钠的作用，提示NO可引起CGRP 和SP从初级传入末梢释放。而神经激肽1受体(NK1)受体的激活在NO的合成过程中也起着重要的作用[12]。结合本研究的结果可以看出，NO和CGRP、SP存在着较为复杂，相互协调的作用关系，但其相互作用的机制尚需深入的研究。
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参考文献
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INCREASED EXPRESSION OF CGRP mRNA,PPTA mRNA
AND NITRIC OXIDE SYNTHASE IN RAT TRIGEMINAL
GANGLION AFTER CARRAGEENAN-INDUCED
INFLAMMATION
Wu Shengxi,Wang Yayun,Li Yunqing△,Shi Jiwu
(Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an)
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The changes of CGRP mRNA,PPTA mRNA and nitric oxide synthase(NOS) expression were examined using NADPH-d histochemistry combined with in situ hybridization histochemistry after carrageenan (CAR) induced inflammation.The results showed that about 32.2%，16.2% and 10% trigeminal ganglion(TG) neurons were CGRP mRNA,PPTA mRNA and NOS positive neurons.The numbers of these positive neurons increased significantly after CAR injection.The percentage of these positive neurons reached to 38.6%,22.8% and 14.2%,respectively.About 6.8% and 7.3% of TG neurons were NOS and CGRP mRNA or NOS and PPTA mRNA colocalization neurons.These neurons were small to medium in size.CAR stimulation also resulted in the increase in the number of these colocalization neurons.Collectively,these data suggest that NOS,CGRP mRNA and PPTA mRNA positive neurons,especially their colocalization neurons,might play important roles in oro-facial nociceptive processing.
KEY WORDS CGRP mRNA;PPTA mRNA;Nitric oxide synthase;Noxious stimulation;Trigeminal ganglion;Histochemistry;In situ hybridization histochemistry
△ Department of Anatomy and K.K.Leung Brain Research Centre,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China
* 国家杰出青年科学基金资助课题(No.39625011), 百拇医药