实验性隐睾诱导小鼠生精细胞凋亡的研究*
作者：徐健 许增禄 姜英涛 钱晓菁 黄玉苓
单位：徐健 许增禄 姜英涛 钱晓菁 黄玉苓(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)
关键词：生精细胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白
解剖学报990121
【摘要】 目的 研究手术隐睾所致成年小鼠生殖细胞凋亡及相关调节因子bcl-2、bax蛋白在曲细精管中的定位、变化。 方法 以末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling method,TUNEL)检测凋亡的生殖细胞，生物素-抗生物素蛋白DCS(biotin-avidin D cell sorter)体系间接免疫荧光法检测Bcl-2、Bax蛋白在曲细精管中的定位、分布。 结果 隐睾术后3d，手术侧睾丸重量及细胞凋亡数量与对侧无明显区别。而6～15d，睾丸重量明显减轻，凋亡细胞明显增多，以精母细胞、精子细胞为主。在正常小鼠曲细精管中，bcl-2大量表达，呈散在的颗粒状存在于各级生精细胞中，以精子细胞胞质为主。Bax蛋白表达量较少，一部分也以散在的颗粒存在于各级生精细胞质中，另一部分则较致密地分布于曲细精管基底部。隐睾术后3d，Bcl-2、Bax的表达与对侧无明显区别；6～15d，Bcl-2明显下降，Bax明显增加。 结论 隐睾明显诱导生殖细胞凋亡，Bcl-2、Bax蛋白对生殖细胞的凋亡有重要调节作用，提示温度、Bcl-2、Bax蛋白在精子发生过程中对生精细胞的主动退化可能有重要作用。
, 百拇医药
CRYPTORCHIDISM INDUCES TESTICULAR GERM CELL APOPTOSIS
IN MICE TESTES AND CHANGES OF Bcl-2,Bax PROTEIN EXPRESSION
Xu Jian, Xu Zenglu△, Jiang Yingtao, Qian Xiaojing, Huang Yuling
(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of experimentally induced cryptorchidism on apoptosis in testes of adult mice and the distribution changes of Bcl-2, Bax protein. Methods Total DNA was isolated from testes and was electrophoretically separated in 1.5% agarose gel, TUNEL method, biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence techniques were used. Results DNA fragmentation, increasing apoptotic germ cells, in coordination with the loss of testicular weight, were observed on 6-15d in the cryptorchid testes. By TUNEL staining it was noted that postive cells were most frequently among primary spermatocytes and round spermatids. Bcl-2, Bax protein mainly distributed in cytoplasm of germ cells. With the increase of apoptosis, Bcl-2 was down and Bax was up regulated. Conclusion Temperature, Bcl-2, and Bax protein play an important role in male germ cell apoptosis.
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【Key words】 Apoptotic germ cells; Bcl-2 protein; Bax protein
正常的生精过程中，存在着生殖细胞的主动退化现象，长期以来受到研究者的重视，其机制仍不清楚。近几年来，国外一些研究者开始将这种主动退化与细胞凋亡联系在一起，很多实验也表明凋亡可能是生殖细胞主动退化的一种机制[1，2]。由于下丘脑-垂体-性腺轴对生殖的明显控制作用，大多数实验集中于有关内分泌对生殖细胞凋亡调节方面的研究，而睾丸还必须在低于体温4～5℃的阴囊中才能正常发育，温度也是重要的调节因素之一。因此，我们以单侧手术隐睾改变精子发生所需要的正常温度的方法来建立生殖细胞凋亡的模型。
许多研究表明bcl-2基因家族是调节细胞凋亡的一个重要基因家族，但家族成员对凋亡的作用却有明显不同。一类促进细胞凋亡如bax、bcl-xs等，另一类则抑制凋亡如bcl-2、bcl-x等[3]。bcl-2基因家族对肿瘤细胞、淋巴细胞凋亡作用的研究很多，对生殖细胞凋亡的作用，最近也有个别报道[4]。我们则研究了Bcl-2、Bax蛋白在正常小鼠睾丸曲细精管中的定位及分布，及其在生精细胞凋亡时，表达的改变。
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材料和方法
1.动物来源及动物模型的建立
中国医学科学院动物所提供的8～10周(26～30g)健康雄性昆明小鼠。戊巴比妥腹腔注射麻醉(30mg/kg)，缝合单侧腹股沟管，使小鼠睾丸不能从腹腔下降至阴囊，未手术侧及正常小鼠的睾丸作对照，术后3、6、8、10、12、15d取材，每组动物6～8只。
2.试剂
细胞凋亡试剂盒(Clontech公司)，兔抗小鼠Bcl-2、Bax多抗(Santa Cruz Biotechnology公司，购于北京中山生物技术有限公司)，生物素化的山羊抗兔IgG，荧光素-抗生物素蛋白DCS、山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame),ppd(phenylenediamine)、agarose、RNase A、protein kinase (Sigma公司)。
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3.睾丸称重及HE染色
小鼠颈椎脱臼法处死，取双侧睾丸，称重。10%中性福尔马林固定24h，常规包埋、切片、HE染色。
4.组织DNA提取及琼脂糖凝胶电泳
从处死的小鼠中取出睾丸(可-70℃保存)，去白膜，研碎，加入10倍体积的buffer(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 0.1mol/L EDTA,pH8.0;0.5%SDS; 100mmol/L NaCl,4℃过夜)，加RNase A至终浓度40mg/L,37℃，1h；加protein kinase至终浓度100mg/L,50℃，3h;10 000g离心30min，上清用酚/氯仿抽提2次，无水乙醇-20℃过夜，12 000g离心30min。真空抽干，TE buffer (10mmol/L Tris HCl pH8.0; 1mmol/L EDTA, pH8.0)溶解。1.5%琼脂糖凝胶电泳。
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5.凋亡细胞的检测及定量数据处理
按照试剂盒说明，以TUNEL法检测凋亡细胞，显绿色荧光的细胞为阳性细胞。按Yin[5]法作数据处理：显微镜下任选5～10个视野，计数50个曲细精管横切面，含凋亡细胞者为阳性曲细精管，再计数15～20个阳性曲细精管中的总细胞数和阳性细胞数，计算凋亡细胞的百分比。每个时间点计算3只小鼠的睾丸，每个睾丸数3张切片。
6.生物素-抗生物素蛋白DCS间接免疫荧光染色
取新鲜睾丸组织，OCT包埋，液氮中冷冻，恒冷箱切片，厚10μm，0.1mol/L PBS配制的10%山羊血清4℃孵育20min，滤纸吸去多余血清，加上用10%山羊血清稀释的(1∶100)兔抗小鼠Bcl-2、Bax多抗，4℃过夜，阴性对照省去此步骤，冷PBS 4℃洗3次，每次5min，加上10%山羊血清稀释的(1∶200)生物素化山羊抗兔IgG，4℃孵育1h，冷PBS于4℃洗3次，每次5min。以荧光素-抗生物素蛋白DCS (1∶200碳酸氢钠缓冲液稀释)4℃孵育1h，冷PBS 4℃洗4次，每次5min，用含10%PBS和1% ppd的甘油封片[6]。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察，并用400 ASA Kodak胶卷摄片。
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结 果
1.睾丸重量的改变
正常鼠及对照侧睾丸的重量在整个实验过程中无明显变化。隐睾重量在术后3d与对照侧无明显变化。术后6d减轻20%，8d减轻29%，10d减轻32%，12d减轻46%，15d减轻31%。隐睾侧与对照侧重量的差别在6～15d每个时间点均有显著差异(P<0.01)，而组间无显著差异(图1)。
图1 隐睾及对照侧睾丸重量的变化
Fig.1 Both cryptorchid and control testesweights (
) are plotted against days of experimental cryptorchidism from 3 to 15.
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2.HE染色
对照侧睾丸生精上皮完整，各级生精细胞及精子排列有序。隐睾术后3d无明显变化。术后6～15d曲细精管管腔增大，生精上皮变薄，不完整，精子明显减少，并可见一些细胞的染色质明显边集化，呈环状。一些曲细精管中出现“多核巨细胞”(multinucleated giant cells)，即多个细胞核聚集形成一个大的细胞团块，其中一些细胞核染色质明显边集化，呈环状。间质细胞和支持细胞无变化。
3.凝胶电泳
隐睾术后6、8、10d可见“DNA ladder”图像，显示有核小体间DNA断裂的小片段存在，而相应的对照侧、隐睾术后3d及正常小鼠睾丸没有观察到小片段DNA(图2)。
图2 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
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Fig.2 Agarose gel fractionation of DNA.Low molecular-weight
DNA from both cryptorchid and control testes were fractionated
on 1.5% agarose gel containing 0.5mg/L ethidium bromide.
4.TUNEL染色
正常及对照侧睾丸有少数曲细精管中可观察到个别凋亡细胞，主要为初级精母细胞(图3A)。隐睾术后3d无明显变化，术后6～15d阳性曲细精管及阳性细胞均明显增加。凋亡细胞主要包括精母细胞和精子细胞，部分“多核巨细胞”也呈阳性。未见间质细胞及支持细胞凋亡(图3B)。正常及对照侧睾丸阳性曲细精管(含凋亡细胞的曲细精管)为10.7%，阳性细胞(凋亡细胞)占1.6%。隐睾术后3d阳性曲细精管12%，阳性细胞2.1%。术后6d阳性曲细精管68.6%，阳性细胞5.6%，术后8d阳性曲细精管72%，阳性细胞5.8%，术后10d阳性曲细精管64.6%，阳性细胞4.8%，术后12d阳性曲细精管58.9%，阳性细胞4.1%，术后15d阳性曲细精管67.2%，阳性细胞3.9%(图4A，B)。术后3d与对照侧无明显差异(P>0.05)。术后6～15d与对照侧及3d均有显著差异(P<0.05)，6～15d各组之间无显著差异(P>0.05)。
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5.Bcl-2、Bax蛋白在曲细精管中的分布及变化
在正常及对照侧睾丸的曲细精管中，Bcl-2蛋白以散在的颗粒状大量分布于各级生精细胞中，以精子细胞质为最多(图3C)，术后3d无明显变化，术后6～15d则见荧光颗粒明显减少(图3D)。而Bax蛋白在正常及对照侧睾丸的曲细精管中明显比Bcl-2蛋白的表达量少，一部分以散在的颗粒状存在于生精细胞质中，另一部分则较致密地分布于曲细精管的基底部位(图3E)。术后3d无明显变化，术后6～15d，荧光颗粒明显增多，荧光明显增强，以8d尤为明显(图3F)，阴性对照未见荧光(图3F左下角)。
图4 睾丸凋亡细胞数据统计(A)凋亡细胞百分比(B)凋亡曲细精管百分比
Fig.4 Quantitation of testicular apotosis.(A)Percentage of apoptotic cells.(B)Percentage of apoptotic seminiferous tubules.
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讨 论
长期以来，人们一直在研究生精细胞主动退化的机制，至今仍不十分清楚。细胞凋亡这一新概念的出现，为研究者提供了新思路和新途径。已有证据表明生精细胞的退化在形态学上具有明显的凋亡特征。Allan等[1]报道精原细胞的凋亡有3个形态学阶段：1.早期：细胞核染色质凝集、边集化。2.中期：凋亡小体形成并开始降解。3.晚期：可见凋亡小体降解的碎片。但凋亡的起始及终止时间难以确定。由于内分泌对生殖细胞的调控作用，许多实验探讨了内分泌对生殖细胞凋亡的调节作用。Tapanainen等[7]报道，去垂体未成熟大鼠睾丸生精细胞DNA降解及细胞凋亡明显增加，GnRH拮抗剂亦有相同作用，而FSH、hCG及睾酮则抑制这种作用，因此认为促性腺激素是调节睾丸生精细胞生存和凋亡的重要因素。Shetty等[8]的实验也有类似结果。
除去内分泌因素外，温度、年龄、生长因子、射线、微波等多种因素均对生精细胞的退化有调节作用。本实验即考虑到睾丸必须在低于体温4～5℃的阴囊中才能正常发育这一点，采用手术隐睾的方法，改变睾丸发育环境的温度，从而建立生精细胞凋亡的模型。正常成年小鼠的睾丸中存在一定数量的凋亡细胞，以初级精母细胞和精原细胞为主，但电泳无梯带出现。隐睾术后6～15d，术侧睾丸重量下降，生精细胞减少，凋亡细胞增多，以精母细胞和精子细胞为主，并可见凋亡小体，电泳有明显“DNA ladder”出现。术后3d则与对照侧无明显变化。这一结果与Shikone等[9]的报道有所不同。他们的实验中，青春前期大鼠的睾丸在术后2d即有明显重量下降，生精细胞减少，凋亡细胞增多及DNA降解。我们认为这可能与不同年龄段对温度敏感性不同及动物种属不同有关。而Heiskanen等[10]在研究人的隐睾时却发现，凋亡生精细胞比正常睾丸少。这不可能完全是因为种属的差别。人的隐睾是先天的，睾丸一直位于腹腔37℃的环境中，是慢性的长期过程，而实验隐睾则是把在阴囊中正常发育的睾丸再推回腹腔，是急速的环境改变，是一个短期过程，所以即便都是处于不正常的温度环境中，情况的不同会导致结果的完全不同。我们认为，实验隐睾是对睾丸发育温度环境的突然改变，温度的调节作用比先天隐睾更重要更明显。还有报道发现隐睾会导致睾酮浓度的下降[11]，那么温度是直接导致凋亡的因素，还是通过激素调节凋亡，或两者皆有，有待于进一步研究。
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bcl-2基因是在人B淋巴细胞瘤中被发现的一种原癌基因，Bcl-2蛋白是一种膜蛋白，位于线粒体膜、滑面内质网膜及核膜上[12]。Bax蛋白是Bcl-2家族的成员之一，是能与Bcl-2蛋白结合的同源分子，两者在细胞中的比例决定了细胞是否凋亡。当Bcl-2蛋白在细胞中过量表达时，与所有Bax结合，细胞成活，凋亡抑制；当Bax过量存在，与Bcl-2形成异源二聚体，则细胞凋亡[13]。它们与细胞凋亡的关系在肿瘤、淋巴细胞方面已有大量研究，但与生殖细胞凋亡的关系却很少报道。Suzuki等[4]以切除性腺的雄性小鼠生殖管道(前列腺、附睾)为凋亡模型，发现随着凋亡的产生出现Bcl-2下调，并预示着fas基因的表达。而我们的研究则发现，在正常小鼠睾丸生精细胞的胞质中有大量Bcl-2蛋白、少量Bax蛋白表达，隐睾术后凋亡细胞的增加，伴随着Bcl-2蛋白的明显减少，Bax蛋白的明显增多。结果提示在睾丸生精细胞的凋亡中，Bcl-2和Bax基因有重要调节作用。
睾丸生殖细胞凋亡及相关基因调节作用的研究，为男性生殖机理的探讨提供了一条新途径、对节育、不育等的研究均有重要意义。
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图3 A，B TUNEL染色×300 A.正常睾丸切片 B.隐睾术后8d的睾丸切片 箭头所示为阳性多核巨细胞。(C、D、E、F)生物素-抗生物素蛋白DCS间接免疫荧光染色 ×300
C.Bcl-2蛋白在正常睾丸中的分布 D.Bcl-2蛋白在隐睾术后8d的睾丸中的分布 E.Bax蛋白在正常睾丸中的分布 F.Bax蛋白在隐睾术后8d的睾丸中的分布 左下角为阴性对照
Fig.3 A,B TUNEL staining of the formalin-fixed, paraffin-embedded testicular tissue sections. Postive staining appears green fluorescence. ×300 A.normal testes. B. cryptorchid testes on day 8. Arrow indicates positive Multinucleated giant cell.
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(C,D,E,F)Biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence staining. Postive staining appears green fluorescence. ×300 C: Distribution of Bcl-2 protein in normal testes.D: Distribution of Bcl-2 protein in cryptorchid testes on day 8. E: Distribution of Bax protein in normal testes. F: Distribution of Bax protein in cryptorchid testes on day 8. Insert indicates negative control.
* 国家自然科学基金资助课题(No.39270380)和卫生部科研基金资助课题(No.94-2-004)
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△ Department of Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 10005, China
参考文献
[1]Allan DJ, Harmon BV, Roberts SA. Spermatogonial apoptosis has three morphologically recognizable phases and shows no circadian rhythm during normal spermatogenesis in the rat. Cell Prolif, 1992,25(3):241
[2]Rodriguez JB, Garcia CM. Spontaneous germ cell death in the testis of the adult rat takes the form of apoptosis: re-evaluation of cell types that exhibit the ability to die during spermatogenesis. Cell Prolif, 1996,29(1):13
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[3]林汝仙综述，孙志贤审校.bcl-2基因家族与细胞程序性死亡.国外医学遗传学分册，1997，20(5)：242
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[5]Yin YZ, Hawkins KL, Dewolf WC, et al. Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice. J Andro, 1997,18(2),159
[6]Xu ZL, Parker SB, Minkoff R. Distribution of type IV collagen, laminin, and fibronection during maxillary process formation in the chick embryo. Am J Anat, 1990,187(3):232
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[7]Tapanainen JS, Tilly JL, Vihko KK, et al. Hormonal control of apoptotic cell death in the testis: Gonadotropins and androgens as testicular cell survival factors. Mol Endocrinol, 1993,7(5):643
[8]Shetty J,Marathe GK, Dighe RR, et al. Specific immunoneutralization of FSH leads to apoptotic cell death of the pachytene spermatocytes and spermatogonial cells in the rat. Endocrinol, 1996,137(5):2179
[9]Shikone T, Billig H, Hsueh AJW, et al. Experimentally induced cryptorchidism increases apoptosis in rat testis. Biolo Reproduc, 1994,51(5):865
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[10]Heiskanen P, Billig H, Toppari J, et al. Apoptotic cell death in the normal and cryptorchid human testis: The effect of human chorionic gonadotropin on testicular cell survival. Pediatric Res, 1996,40(2):351
[11]Sharpe RM, Kerr JB, Fraser HM, et al. Intratesticular factors and testosterone secretion: effect of treatments that alter the level of testosterone within the testis. J Androl, 1986, 7(3):180
[12]Nguyen M, Branton PE, Walton PA, et al. Role of membrane anchor domain of bcl-2 in suppression of apoptosis caused by E1B-defective adenovirus. J Biol Chem, 1994,269(24):16521
[13]Oltrai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ, et al. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74(4):609
收稿1998-01 修回1998-05, 百拇医药
单位：徐健 许增禄 姜英涛 钱晓菁 黄玉苓(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)
关键词：生精细胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白
解剖学报990121
【摘要】 目的 研究手术隐睾所致成年小鼠生殖细胞凋亡及相关调节因子bcl-2、bax蛋白在曲细精管中的定位、变化。 方法 以末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling method,TUNEL)检测凋亡的生殖细胞，生物素-抗生物素蛋白DCS(biotin-avidin D cell sorter)体系间接免疫荧光法检测Bcl-2、Bax蛋白在曲细精管中的定位、分布。 结果 隐睾术后3d，手术侧睾丸重量及细胞凋亡数量与对侧无明显区别。而6～15d，睾丸重量明显减轻，凋亡细胞明显增多，以精母细胞、精子细胞为主。在正常小鼠曲细精管中，bcl-2大量表达，呈散在的颗粒状存在于各级生精细胞中，以精子细胞胞质为主。Bax蛋白表达量较少，一部分也以散在的颗粒存在于各级生精细胞质中，另一部分则较致密地分布于曲细精管基底部。隐睾术后3d，Bcl-2、Bax的表达与对侧无明显区别；6～15d，Bcl-2明显下降，Bax明显增加。 结论 隐睾明显诱导生殖细胞凋亡，Bcl-2、Bax蛋白对生殖细胞的凋亡有重要调节作用，提示温度、Bcl-2、Bax蛋白在精子发生过程中对生精细胞的主动退化可能有重要作用。
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CRYPTORCHIDISM INDUCES TESTICULAR GERM CELL APOPTOSIS
IN MICE TESTES AND CHANGES OF Bcl-2,Bax PROTEIN EXPRESSION
Xu Jian, Xu Zenglu△, Jiang Yingtao, Qian Xiaojing, Huang Yuling
(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of experimentally induced cryptorchidism on apoptosis in testes of adult mice and the distribution changes of Bcl-2, Bax protein. Methods Total DNA was isolated from testes and was electrophoretically separated in 1.5% agarose gel, TUNEL method, biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence techniques were used. Results DNA fragmentation, increasing apoptotic germ cells, in coordination with the loss of testicular weight, were observed on 6-15d in the cryptorchid testes. By TUNEL staining it was noted that postive cells were most frequently among primary spermatocytes and round spermatids. Bcl-2, Bax protein mainly distributed in cytoplasm of germ cells. With the increase of apoptosis, Bcl-2 was down and Bax was up regulated. Conclusion Temperature, Bcl-2, and Bax protein play an important role in male germ cell apoptosis.
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【Key words】 Apoptotic germ cells; Bcl-2 protein; Bax protein
正常的生精过程中，存在着生殖细胞的主动退化现象，长期以来受到研究者的重视，其机制仍不清楚。近几年来，国外一些研究者开始将这种主动退化与细胞凋亡联系在一起，很多实验也表明凋亡可能是生殖细胞主动退化的一种机制[1，2]。由于下丘脑-垂体-性腺轴对生殖的明显控制作用，大多数实验集中于有关内分泌对生殖细胞凋亡调节方面的研究，而睾丸还必须在低于体温4～5℃的阴囊中才能正常发育，温度也是重要的调节因素之一。因此，我们以单侧手术隐睾改变精子发生所需要的正常温度的方法来建立生殖细胞凋亡的模型。
许多研究表明bcl-2基因家族是调节细胞凋亡的一个重要基因家族，但家族成员对凋亡的作用却有明显不同。一类促进细胞凋亡如bax、bcl-xs等，另一类则抑制凋亡如bcl-2、bcl-x等[3]。bcl-2基因家族对肿瘤细胞、淋巴细胞凋亡作用的研究很多，对生殖细胞凋亡的作用，最近也有个别报道[4]。我们则研究了Bcl-2、Bax蛋白在正常小鼠睾丸曲细精管中的定位及分布，及其在生精细胞凋亡时，表达的改变。
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材料和方法
1.动物来源及动物模型的建立
中国医学科学院动物所提供的8～10周(26～30g)健康雄性昆明小鼠。戊巴比妥腹腔注射麻醉(30mg/kg)，缝合单侧腹股沟管，使小鼠睾丸不能从腹腔下降至阴囊，未手术侧及正常小鼠的睾丸作对照，术后3、6、8、10、12、15d取材，每组动物6～8只。
2.试剂
细胞凋亡试剂盒(Clontech公司)，兔抗小鼠Bcl-2、Bax多抗(Santa Cruz Biotechnology公司，购于北京中山生物技术有限公司)，生物素化的山羊抗兔IgG，荧光素-抗生物素蛋白DCS、山羊血清(Vector Laboratories, Burlingame),ppd(phenylenediamine)、agarose、RNase A、protein kinase (Sigma公司)。
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3.睾丸称重及HE染色
小鼠颈椎脱臼法处死，取双侧睾丸，称重。10%中性福尔马林固定24h，常规包埋、切片、HE染色。
4.组织DNA提取及琼脂糖凝胶电泳
从处死的小鼠中取出睾丸(可-70℃保存)，去白膜，研碎，加入10倍体积的buffer(10mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 0.1mol/L EDTA,pH8.0;0.5%SDS; 100mmol/L NaCl,4℃过夜)，加RNase A至终浓度40mg/L,37℃，1h；加protein kinase至终浓度100mg/L,50℃，3h;10 000g离心30min，上清用酚/氯仿抽提2次，无水乙醇-20℃过夜，12 000g离心30min。真空抽干，TE buffer (10mmol/L Tris HCl pH8.0; 1mmol/L EDTA, pH8.0)溶解。1.5%琼脂糖凝胶电泳。
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5.凋亡细胞的检测及定量数据处理
按照试剂盒说明，以TUNEL法检测凋亡细胞，显绿色荧光的细胞为阳性细胞。按Yin[5]法作数据处理：显微镜下任选5～10个视野，计数50个曲细精管横切面，含凋亡细胞者为阳性曲细精管，再计数15～20个阳性曲细精管中的总细胞数和阳性细胞数，计算凋亡细胞的百分比。每个时间点计算3只小鼠的睾丸，每个睾丸数3张切片。
6.生物素-抗生物素蛋白DCS间接免疫荧光染色
取新鲜睾丸组织，OCT包埋，液氮中冷冻，恒冷箱切片，厚10μm，0.1mol/L PBS配制的10%山羊血清4℃孵育20min，滤纸吸去多余血清，加上用10%山羊血清稀释的(1∶100)兔抗小鼠Bcl-2、Bax多抗，4℃过夜，阴性对照省去此步骤，冷PBS 4℃洗3次，每次5min，加上10%山羊血清稀释的(1∶200)生物素化山羊抗兔IgG，4℃孵育1h，冷PBS于4℃洗3次，每次5min。以荧光素-抗生物素蛋白DCS (1∶200碳酸氢钠缓冲液稀释)4℃孵育1h，冷PBS 4℃洗4次，每次5min，用含10%PBS和1% ppd的甘油封片[6]。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察，并用400 ASA Kodak胶卷摄片。
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结 果
1.睾丸重量的改变
正常鼠及对照侧睾丸的重量在整个实验过程中无明显变化。隐睾重量在术后3d与对照侧无明显变化。术后6d减轻20%，8d减轻29%，10d减轻32%，12d减轻46%，15d减轻31%。隐睾侧与对照侧重量的差别在6～15d每个时间点均有显著差异(P<0.01)，而组间无显著差异(图1)。
图1 隐睾及对照侧睾丸重量的变化
Fig.1 Both cryptorchid and control testesweights (
) are plotted against days of experimental cryptorchidism from 3 to 15., http://www.100md.com
2.HE染色
对照侧睾丸生精上皮完整，各级生精细胞及精子排列有序。隐睾术后3d无明显变化。术后6～15d曲细精管管腔增大，生精上皮变薄，不完整，精子明显减少，并可见一些细胞的染色质明显边集化，呈环状。一些曲细精管中出现“多核巨细胞”(multinucleated giant cells)，即多个细胞核聚集形成一个大的细胞团块，其中一些细胞核染色质明显边集化，呈环状。间质细胞和支持细胞无变化。
3.凝胶电泳
隐睾术后6、8、10d可见“DNA ladder”图像，显示有核小体间DNA断裂的小片段存在，而相应的对照侧、隐睾术后3d及正常小鼠睾丸没有观察到小片段DNA(图2)。
图2 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
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Fig.2 Agarose gel fractionation of DNA.Low molecular-weight
DNA from both cryptorchid and control testes were fractionated
on 1.5% agarose gel containing 0.5mg/L ethidium bromide.
4.TUNEL染色
正常及对照侧睾丸有少数曲细精管中可观察到个别凋亡细胞，主要为初级精母细胞(图3A)。隐睾术后3d无明显变化，术后6～15d阳性曲细精管及阳性细胞均明显增加。凋亡细胞主要包括精母细胞和精子细胞，部分“多核巨细胞”也呈阳性。未见间质细胞及支持细胞凋亡(图3B)。正常及对照侧睾丸阳性曲细精管(含凋亡细胞的曲细精管)为10.7%，阳性细胞(凋亡细胞)占1.6%。隐睾术后3d阳性曲细精管12%，阳性细胞2.1%。术后6d阳性曲细精管68.6%，阳性细胞5.6%，术后8d阳性曲细精管72%，阳性细胞5.8%，术后10d阳性曲细精管64.6%，阳性细胞4.8%，术后12d阳性曲细精管58.9%，阳性细胞4.1%，术后15d阳性曲细精管67.2%，阳性细胞3.9%(图4A，B)。术后3d与对照侧无明显差异(P>0.05)。术后6～15d与对照侧及3d均有显著差异(P<0.05)，6～15d各组之间无显著差异(P>0.05)。
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5.Bcl-2、Bax蛋白在曲细精管中的分布及变化
在正常及对照侧睾丸的曲细精管中，Bcl-2蛋白以散在的颗粒状大量分布于各级生精细胞中，以精子细胞质为最多(图3C)，术后3d无明显变化，术后6～15d则见荧光颗粒明显减少(图3D)。而Bax蛋白在正常及对照侧睾丸的曲细精管中明显比Bcl-2蛋白的表达量少，一部分以散在的颗粒状存在于生精细胞质中，另一部分则较致密地分布于曲细精管的基底部位(图3E)。术后3d无明显变化，术后6～15d，荧光颗粒明显增多，荧光明显增强，以8d尤为明显(图3F)，阴性对照未见荧光(图3F左下角)。
图4 睾丸凋亡细胞数据统计(A)凋亡细胞百分比(B)凋亡曲细精管百分比
Fig.4 Quantitation of testicular apotosis.(A)Percentage of apoptotic cells.(B)Percentage of apoptotic seminiferous tubules.
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讨 论
长期以来，人们一直在研究生精细胞主动退化的机制，至今仍不十分清楚。细胞凋亡这一新概念的出现，为研究者提供了新思路和新途径。已有证据表明生精细胞的退化在形态学上具有明显的凋亡特征。Allan等[1]报道精原细胞的凋亡有3个形态学阶段：1.早期：细胞核染色质凝集、边集化。2.中期：凋亡小体形成并开始降解。3.晚期：可见凋亡小体降解的碎片。但凋亡的起始及终止时间难以确定。由于内分泌对生殖细胞的调控作用，许多实验探讨了内分泌对生殖细胞凋亡的调节作用。Tapanainen等[7]报道，去垂体未成熟大鼠睾丸生精细胞DNA降解及细胞凋亡明显增加，GnRH拮抗剂亦有相同作用，而FSH、hCG及睾酮则抑制这种作用，因此认为促性腺激素是调节睾丸生精细胞生存和凋亡的重要因素。Shetty等[8]的实验也有类似结果。
除去内分泌因素外，温度、年龄、生长因子、射线、微波等多种因素均对生精细胞的退化有调节作用。本实验即考虑到睾丸必须在低于体温4～5℃的阴囊中才能正常发育这一点，采用手术隐睾的方法，改变睾丸发育环境的温度，从而建立生精细胞凋亡的模型。正常成年小鼠的睾丸中存在一定数量的凋亡细胞，以初级精母细胞和精原细胞为主，但电泳无梯带出现。隐睾术后6～15d，术侧睾丸重量下降，生精细胞减少，凋亡细胞增多，以精母细胞和精子细胞为主，并可见凋亡小体，电泳有明显“DNA ladder”出现。术后3d则与对照侧无明显变化。这一结果与Shikone等[9]的报道有所不同。他们的实验中，青春前期大鼠的睾丸在术后2d即有明显重量下降，生精细胞减少，凋亡细胞增多及DNA降解。我们认为这可能与不同年龄段对温度敏感性不同及动物种属不同有关。而Heiskanen等[10]在研究人的隐睾时却发现，凋亡生精细胞比正常睾丸少。这不可能完全是因为种属的差别。人的隐睾是先天的，睾丸一直位于腹腔37℃的环境中，是慢性的长期过程，而实验隐睾则是把在阴囊中正常发育的睾丸再推回腹腔，是急速的环境改变，是一个短期过程，所以即便都是处于不正常的温度环境中，情况的不同会导致结果的完全不同。我们认为，实验隐睾是对睾丸发育温度环境的突然改变，温度的调节作用比先天隐睾更重要更明显。还有报道发现隐睾会导致睾酮浓度的下降[11]，那么温度是直接导致凋亡的因素，还是通过激素调节凋亡，或两者皆有，有待于进一步研究。
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bcl-2基因是在人B淋巴细胞瘤中被发现的一种原癌基因，Bcl-2蛋白是一种膜蛋白，位于线粒体膜、滑面内质网膜及核膜上[12]。Bax蛋白是Bcl-2家族的成员之一，是能与Bcl-2蛋白结合的同源分子，两者在细胞中的比例决定了细胞是否凋亡。当Bcl-2蛋白在细胞中过量表达时，与所有Bax结合，细胞成活，凋亡抑制；当Bax过量存在，与Bcl-2形成异源二聚体，则细胞凋亡[13]。它们与细胞凋亡的关系在肿瘤、淋巴细胞方面已有大量研究，但与生殖细胞凋亡的关系却很少报道。Suzuki等[4]以切除性腺的雄性小鼠生殖管道(前列腺、附睾)为凋亡模型，发现随着凋亡的产生出现Bcl-2下调，并预示着fas基因的表达。而我们的研究则发现，在正常小鼠睾丸生精细胞的胞质中有大量Bcl-2蛋白、少量Bax蛋白表达，隐睾术后凋亡细胞的增加，伴随着Bcl-2蛋白的明显减少，Bax蛋白的明显增多。结果提示在睾丸生精细胞的凋亡中，Bcl-2和Bax基因有重要调节作用。
睾丸生殖细胞凋亡及相关基因调节作用的研究，为男性生殖机理的探讨提供了一条新途径、对节育、不育等的研究均有重要意义。
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图3 A，B TUNEL染色×300 A.正常睾丸切片 B.隐睾术后8d的睾丸切片 箭头所示为阳性多核巨细胞。(C、D、E、F)生物素-抗生物素蛋白DCS间接免疫荧光染色 ×300
C.Bcl-2蛋白在正常睾丸中的分布 D.Bcl-2蛋白在隐睾术后8d的睾丸中的分布 E.Bax蛋白在正常睾丸中的分布 F.Bax蛋白在隐睾术后8d的睾丸中的分布 左下角为阴性对照
Fig.3 A,B TUNEL staining of the formalin-fixed, paraffin-embedded testicular tissue sections. Postive staining appears green fluorescence. ×300 A.normal testes. B. cryptorchid testes on day 8. Arrow indicates positive Multinucleated giant cell.
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(C,D,E,F)Biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence staining. Postive staining appears green fluorescence. ×300 C: Distribution of Bcl-2 protein in normal testes.D: Distribution of Bcl-2 protein in cryptorchid testes on day 8. E: Distribution of Bax protein in normal testes. F: Distribution of Bax protein in cryptorchid testes on day 8. Insert indicates negative control.
* 国家自然科学基金资助课题(No.39270380)和卫生部科研基金资助课题(No.94-2-004)
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△ Department of Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 10005, China
参考文献
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[2]Rodriguez JB, Garcia CM. Spontaneous germ cell death in the testis of the adult rat takes the form of apoptosis: re-evaluation of cell types that exhibit the ability to die during spermatogenesis. Cell Prolif, 1996,29(1):13
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[5]Yin YZ, Hawkins KL, Dewolf WC, et al. Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice. J Andro, 1997,18(2),159
[6]Xu ZL, Parker SB, Minkoff R. Distribution of type IV collagen, laminin, and fibronection during maxillary process formation in the chick embryo. Am J Anat, 1990,187(3):232
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[7]Tapanainen JS, Tilly JL, Vihko KK, et al. Hormonal control of apoptotic cell death in the testis: Gonadotropins and androgens as testicular cell survival factors. Mol Endocrinol, 1993,7(5):643
[8]Shetty J,Marathe GK, Dighe RR, et al. Specific immunoneutralization of FSH leads to apoptotic cell death of the pachytene spermatocytes and spermatogonial cells in the rat. Endocrinol, 1996,137(5):2179
[9]Shikone T, Billig H, Hsueh AJW, et al. Experimentally induced cryptorchidism increases apoptosis in rat testis. Biolo Reproduc, 1994,51(5):865
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[10]Heiskanen P, Billig H, Toppari J, et al. Apoptotic cell death in the normal and cryptorchid human testis: The effect of human chorionic gonadotropin on testicular cell survival. Pediatric Res, 1996,40(2):351
[11]Sharpe RM, Kerr JB, Fraser HM, et al. Intratesticular factors and testosterone secretion: effect of treatments that alter the level of testosterone within the testis. J Androl, 1986, 7(3):180
[12]Nguyen M, Branton PE, Walton PA, et al. Role of membrane anchor domain of bcl-2 in suppression of apoptosis caused by E1B-defective adenovirus. J Biol Chem, 1994,269(24):16521
[13]Oltrai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ, et al. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74(4):609
收稿1998-01 修回1998-05, 百拇医药