神经细胞凋亡的分子调控和死亡信号的传导途径
作者：周明华 陈思颖 吴玺印
单位：周明华 陈思颖 吴玺印 香港大学医学院解剖学系，香港
关键词：
解剖学报990226 MOLECULAR REGULATION OF NEURONAL APOPTOSIS AND
TRANSDUCTIONAL PATHWAY FOR DEATH SIGNAL
在生物机体的正常发生发育和生长分化过程中，其细胞分裂、生长分化和细胞死亡的精密配合起着重要的作用。脊椎动物神经系统在个体发生中即使没有遇到外在损害，其神经细胞在竞争靶源有限的神经营养因子(神经细胞诱向因子neuronotrophic factors, NTFs)过程中，在特定部位和时间也会按自身的程序主动死亡，即Lockshin和Williams称之为编程性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。哺乳动物从囊胚开始终生都有广泛、持续的细胞PCD。例如，成年人每小时有亿万个细胞发生PCD(Raff，1996)，这说明PCD在调节细胞增殖的数量中起着重要作用。这类细胞死亡有着独特的形态和生物化学特点：如染色质浓缩、核酸内切酶将核小体DNA裂解为160～180bp片段，其电泳图像呈梯阶形式；细胞的泡状外突形成包膜的凋亡小体(apoptotic bodies)；死亡细胞或其残片迅速被巨噬细胞膜的糖蛋白CD14所识别、吞噬而清除(Devitt等，1998)，没有漏出内容物，无炎症反应等，Kerr等(1972)将这些表现特称为细胞凋亡(apoptosis)。所以，细胞凋亡完全不同于细胞坏死，后者出现细胞膨胀瓦解并引起炎症反应。但是，在神经系统的PCD中也有非凋亡式的细胞死亡(Oo等，1996)。
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近十几年来的研究表明，NTFs及其受体在保障特定神经细胞的存活，促进生长、分化，特别是在防止凋亡方面有显著的生物学效应；实验性NTFs或其受体基因突变，可导致动物相关神经细胞出现明显的缺陷。同时，细胞死亡基因(cell death gene,ced)或其调控基因突变，会导致本该死亡的细胞不死亡，或该存活的细胞不存活，传导死亡信号分子的定点定向突变的实验获得了同样的效果。这些研究结果为探索神经细胞因正向或负向凋亡失调所导致的退行变性或增生亢进机制和应用开辟了广阔的前景[1～3]。
1.神经细胞凋亡是正常神经系统发育及病变中的必然过程
脊椎动物神经系统内不同部分的神经细胞凋亡的时间和程度是有差别的。如脊髓运动神经细胞凋亡的时间在鸡出现于E6.5～9.5d，大鼠为E15d；鼠的黑质多巴胺(DA)能神经细胞出现于E21d，出生后有2次凋亡高峰期，即6d及14d，而后一次高峰期恰是其靶结构(纹状体)内依赖NTFs的突触形成期(Oo和Bruke, 1996)；大鼠视网膜节细胞在出生后前5d凋亡达70%；小脑皮质颗粒细胞在出生后小鼠和人发育的前3个月均有凋亡(Lossi等，1996)。从神经细胞凋亡的程度来看，三叉神经中脑根核有75%(或85%)、听觉中继核有15%的神经元有凋亡；脑桥核、蓝斑、红核和海马主体结构则无明显的神经细胞凋亡。在成年期虽然一些神经核、皮质和神经节均保留约50%的长寿神经元，但到老化时仍会有明显的凋亡。最近通过用BRDU标记鸡胚胎脊髓运动神经细胞核的实验，发现运动神经元从出现到PCD之间有固定的间隙期(interval period)，最早出现的运动神经元最先开始PCD[4]。另外，截肢后的运动神经元、视神经损伤后的视网膜节细胞(Bien等，1996)，或失去大量传入纤维的嗅皮质锥体细胞(Capurso等，1996)或神经退变病的神经元均发现有细胞凋亡现象[5]。
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2.神经细胞凋亡和细胞死亡基因
从线虫(C.elegans)到哺乳动物(包括人)均发现有细胞死亡基因。线虫的主要死亡基因为ced-3和ced-4，ced-3编码的CED-3蛋白酶序列与哺乳动物的白细胞介素-1β转化酶(interleukin-1β converting enzyme, ICE)同源，是半胱氨酸蛋白酶。实验显示ced-3产物杀死细胞不需要内源的ced-4；而ced-4过度表达诱导的细胞死亡需要ced-3的活化。ced-4基因变异剪接(alternative splicing)的产物CED-4L或点突变，无论在线虫或哺乳动物均可丧失触发细胞死亡效应，这表明ced-4可能在ced-3的上游起作用，或与ced-3相平行起作用。ced-9为存活基因(survival gene)，其编码的蛋白质与原癌基因产物Bcl-2族的Bcl-XL同源，有抑制CED-4的作用，以致转染bcl-2基因或Bcl-2的线虫不会因ced-9突变而出现PCD，即能保护神经细胞和其他细胞的存活。这些基因在个体发生中都能自动地调控细胞死亡[6，7]。果蝇的死亡基因rpr(reaper)编码的RPR蛋白酶有ICE样效应，其死亡结构域(death domain)与死亡受体(death receptors) TNFR1和Fas(见后)同源(Golstein等，1995)。rpr在细胞死亡前1～2h才表达RPR，基因的部分缺失将阻止细胞正常凋亡；基因的过度表达则导致眼视网膜脱落，但能够被杆状病毒的抑制凋亡蛋白质(P35IAP)所抑制，这表明RPR激活了CED-3/ICE介导的细胞死亡程序[8]。最近，在哺乳动物发现的蛋白酶Apopain特异地酶解死亡底物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，当细胞内Apopain活性增高即启动细胞死亡(Nicholson等，1995)。在脊髓肌萎缩(SMA)病相关基因第5号染色体q13的邻近q13.1为新发现的基因，编码一种与IAP同源的神经元凋亡抑制蛋白质(neuronal apoptosis inhibitory protein, NAIP)[9]；用PCR法从λZapⅡ人胎儿脑cDNA文库和λUniZap人肝cDNA文库分离的与IAP同源的xiap、hiap-1和hiap-2基因，其表达产物均能抑制细胞凋亡(Liston等，1996)；在SMA病人运动神经元第5号染色体端粒区鉴定到20kb的运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)，此基因在229例SMA病人中有226例发现存在缺少或断裂，其余3例则在6、7内含子处有点突变(Y272C)，这导致了病人运动神经元的退变凋亡，他们认为SMN基因是决定SMA病的基因[10]。用原位杂交法证实SMNmRNA位于大鼠、猴中枢神经系神经元细胞质，RT-PCR法分离大鼠的SMN有90%与人的同源(Princivalle等，1996)。此外，尚有一些原癌基因通过特定途径可诱发细胞凋亡(如bad、bak、bax、bik、c-myc、p53)，或促进细胞存活(如bcl-2、mcl-1、v-abl、brc-abl)(Gajewski和Thompson，1996)。
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3.死亡受体和死亡配体
触发细胞凋亡的死亡受体主要是肿瘤坏死因子(TNF)/NGF受体超家族成员，如TNFR1、Fas/Apo-1、p75(NTR)[11]、DR-3/WSL-1/Apo-3、DR-4、DR-5(Chinnaiyan等，1996；Marsters等，1996；Pan等，1997；Sheridan等，1997)、 LTβR(淋巴细胞毒素β受体)、TRAMP(Bodmer等，1997)，它们通过其胞外结构域与相应的死亡配体或因子(death ligands or factors)相结合，触发死亡受体胞内结构域产生死亡信号，传给胞溶质中的信号媒体分子；也可通过细胞表面另一类介导病毒进入细胞的受体，如疱疹病毒进入细胞的介体(HVEM)(Motogomery等，1996)、禽类细胞病白血病-肉瘤病毒介导凋亡的受体(CAR1)(Brojalsch等，1996)导致细胞凋亡。TNF/NGF受体超家族成员分子结构的特点是跨膜的I型膜蛋白，其胞外结构域大约每40个氨基酸中含6个半胱氨酸的不完全重复片段，可与配体结合；其胞内结构域均含有死亡结构域(约含80个氨基酸)，是死亡信号产生及死亡信号分子相互结合的部位，也是决定蛋白-蛋白相互作用顺序和活化转录因子NF-κB的部位。TNFR死亡结构域突变往往发生在α-螺旋结构的保守氨基酸处，因此可以干扰受体死亡信号的传导。
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3.1 Fas/Apo-1：80年代末，Yonehara S和Krammer P两个研究组分别在成纤维细胞和免疫细胞中发现了表面抗原。人的Fas有325个氨基酸，其基因定位于第10号染色体长臂(q)，小鼠则定位于第19号染色体，有9个外显子。人的Fas抗体与小鼠表达Fas的转化细胞交联后5h内细胞凋亡，表明Fas为细胞表面传导死亡信号的受体(死亡受体)。对Apo-1进行与Fas相同方式的实验，结果完全一样，并证明两者的分子序列完全一致。这表明Fas/Apo-1是相同性质的受体，同属Ⅰ型膜蛋白，为TNF/NGF受体超家族成员，目前常用CD95(分化抗原簇抗体)来表示Fas(Oehm等，1992)。这类受体的胞外结构域富集半胱氨酸亚结构域，胞内结构域则含有死亡结构域。CD95在不同组织和细胞株表达量差别很大，物种间的差别明显。如小鼠胸腺高水平地表达Fas，在人却很弱。在常染色体隐性突变的Lpr小鼠，其Fas238位缬氨酸被天冬酰胺取代，其细胞便具有了抗凋亡性能。
Fas配体(CD95L)分子量约40kD，克隆小鼠和人的CD95L属Ⅱ型膜蛋白，C-终端在胞外，中间部为疏水区的跨膜部，N-终端则无信号序列。CD95L胞外部150个氨基酸序列与TNF族成员的TNF、CD27L、CD40L、CD30L同源。在表达CD95的COS细胞与rCD95L结合之后5h内细胞凋亡，表明CD95L为CD95的死亡配体或因子(Suda等，1993；Nagata和Suda，1995)。小鼠CD95L序列有76.9%与人的完全一致。一般说，CD95介导的凋亡信号传导在细胞表面需要有足够密度的CD95、CD95L与CD95结合成为寡聚体和凋亡敏感的细胞等3个因素。CD95发出的死亡指令直接传导给有死亡结构域的胞内信号媒体分子FADD/MORT1，再传递到蛋白酶(后述)。
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3.2 TNF和TNFRs：肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,NTF)是70年代中期在免疫细胞最早发现的细胞死亡因子，其受体迟至90年代中才分离鉴定为TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)，两者在广泛的组织均有表达。它们象CD95、p75(NTR)、CD40一样同属Ⅰ型膜蛋白，为TNF/NGF受体超家族的成员。TNF对多种类型细胞有引起凋亡、抗病毒活性、激活转录因子(NF-κB)和保护宿主抗拒微生物及病原菌等生物学效应(Pfeffer等，1993；Rotte等，1993)。CD120a既能触发细胞凋亡又能激活NF-κB，少量通过CD120b起作用的也限于免疫系统。CD120a和b的胞外部分～30%氨基酸序列完全一致，富集半胱氨酸，两者性能差别主要取决于其胞内部分的初级氨基酸序列无相似性。CD120a的胞内部分象CD95一样含有～80个氨基酸的死亡结构域，为诱导细胞凋亡和激活NF-κB的分子基础；而CD120b的胞内部分为TRAF(TNFR相关因子TNFR-associated factor，TRAF)结构域，参与活化NF-κB。因此TNF和两者结合构成寡聚体活化后，分别与各自相关信号媒体分子相互作用，构成各不相同的信号传导途径，使细胞产生不同的生物学效应。基因敲除(Erickson等，1994)和受体特异激动抗体的实验(Wong等，1995)进一步证明两个受体产生互不重叠的信号(Hsu等，1995)，再通过胞内信号媒体分子TRADD、RIP(见后)传导到酶解细胞结构分子的Caspase族蛋白酶。
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3.3 p75(NTR)：p75(NTR)为神经营养素(neurotrophins,NTs)的协助受体，最初只了解它是NGF的低亲和力受体(LNGF)，现在知道它以几乎相等的亲和力及不同的动力学与各个NT相结合，所以现在常用p75(NTR)来表示。其分子结构和介导细胞凋亡的性能与CD120a、CD95有明显相似性，亦为TNF/NGF受体超家族成员[11]。p75(NTR)胞外部含3或4个不完全重叠的富集半光氨酸的亚结构域，胞内部分无催化结构域，但有与CD120a、CD95死亡结构域的同源部分。RT-PCR法证明，在不表达TrkA(酪氨酸激酶A，NGF受体)的少突胶质细胞，NGF与其p75(NTR)结合可导致该细胞凋亡[12]；在NIH3T3细胞与p75(NTR)结合不激活其c-jun激酶或PCD；在Schwann细胞，与p75(NTR)的结合可活化转录因子NF-κB与DNA结合(Anton等，1994)；BDNT或NT-3则无此效应(Carter等，1996)。鸡胚发生早期的视网膜节细胞能表达p75(NTR)而不表达TrkA，内源性NGF与p75(NTR)结合可诱发细胞凋亡，但用NGF抗体预先处理之后便可阻止细胞凋亡，BDNF或NT-3则无这种效应[13]。这说明神经系统在内源NGF与死亡受体结合后能导致细胞凋亡。换言之，NGF对细胞的正向或负向效应取决于神经细胞表达的受体类型。体外培养的实验显示，交感神经元在去除NGF1h内，可激活原来在细胞周期中促进细胞分裂的周期素D1和A，上调c-jun、c-fos基因活性，结果导致神经元凋亡(Kanenburg等，1996)。
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3.4 DR：死亡受体(death receptor)已经鉴定的有DR3、DR4和DR5，前者也称为WSL-1Apo-3受体或TRAMP(TNFR介导的细胞凋亡蛋白质TNF-receptor apoptosis-mediating protein，TRAMP)，是近年主要在人的多淋巴细胞组织中鉴定的。它们同属TNF/NGF受体超家族成员，在脑内没有发现其mRNA。DR5序列有55%与DR4完全一致，与DR3为29%，CD120a为19%，CD95为17%。DR4和DR5的胞外结构域含有两个富集半胱氨酸的亚结构域，与CD120a、CD95的胞外结构域同源；其胞内结构域含有与CD120a、CD95相似的死亡结构域。实验表明，DR5介导受试靶细胞凋亡和激活转录因子NF-κB，但是CrmA(细胞因子应答修饰物A，cytokine response modifierA)或z-VAD-fmk能够抑制其生物学效应。因此，它们可能在调控体内淋巴细胞数量方面有重要作用。HVEM也是TNF/NGF受体超家族成员，克隆的HVEM有增强仓鼠、猪细胞抵抗疱疹病毒(HSV)入侵的敏感性，而HVEM抗体和含有其外结构域(ectodomain)的可溶性杂种蛋白质能抑制依赖HVEM的感染，HSV突变则可明显地减少HVEM介导的病毒入侵。
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DR4和DR5配体为TNF相关的诱导调亡配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL，也称Apo2L)，属TNF族成员，是一种细胞毒蛋白，能快速诱导许多转化细胞株的细胞凋亡，在正常组织不表达(Pan等，1997)。
4.细胞内传导死亡指令的信号分子
近年来已在细胞内发现了多个传导死亡指令的信号媒体分子，如FADD/MORT1、TRADD、RIP、FLICE。它们共同的特点是分子的C-终端含有死亡结构域，与相关受体胞质内的死亡结构域相互作用；其N-终端含有死亡效应子结构域(death effector domain)。这类分子将相应受体产生的死亡指令传递给瓦解细胞结构分子的Caspase族蛋白酶，并在其传递途径中也发现有干扰和抑制传导死亡信号的病毒蛋白和相应效应的原癌基因bcl-2族产物和抑制剂。
4.1 FADD：FADD是与Fas(CD95)相关的含死亡结构域蛋白质(Fas-associating protein with death domain, FADD)[14]，分子量为26kD，为CD95下游的信号传导分子，其C-终端含死亡结构域，N-终端含死亡效应子结构域。后来又发现一个结合CD95与FADD相同的分子，即MORT1(Kischkel等，1995)。由人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)文库筛选的FADD有208个氨基酸，其111～170位氨基酸与CD95 233～292位氨基酸是相匹配的，其中有21%完全一致。这个区域相当rCD95胞质部死亡结构域，与天然的CD95、CD120a产生死亡信号的结构域同源，其中25%～30%完全一致。N-终端缺少40个氨基酸的突变FADD，其C-终端死亡结构域仍然能够与CD95的死亡结构域相互作用，但诱发细胞凋亡的能力减小；N-终端117个氨基酸结合其下游死亡信号分子，具有触发细胞凋亡的能力，为死亡效应子结构域(Hsu等，1995)。FADD的121位缬氨酸被天冬酰胺取代(点突变)后，不能与CD95死亡结构域结合，便不能诱发细胞凋亡。这表明胞质死亡信号媒体分子是传导死亡信号的分子，而FADD直接接受CD95的死亡指令，再传递给Caspase族蛋白酶，这是一条快速导致细胞凋亡的途径(Fracer等，1996)。用Northern印迹法显示，胎儿和成人的多种组织能表达FADD。
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4.2 TRADD：TRADD是TNFR1(CD120a)相关的含死亡结构域蛋白质(TNFR1-associated death domain protein, TRADD)[15]，有312个氨基酸，分子量为34kD，其C-终端195～305氨基酸的死亡结构域中有23%和13%序列分别与CD120a和CD95一致，但CD120b胞内部为TRAF结构域而无死亡结构域。因此，在死亡信号传导途径的近侧，TRADD特异地与CD120a结合而不结合CD120b。转染TRADD的人胚胎肾293细胞2h后和对照比较，转染细胞出现凋亡形态特点和核小体DNA断裂；如共同转染crmA则阻止293细胞凋亡；与HeLa细胞一起培养36h后用X-Gal染色，蓝色阳性细胞减少100倍(Hsu等，1995)。这证实TRADD能够诱发细胞凋亡，而CrmA对其有抑制效应，对转录因子NF-κB的激活效应则未受影响。这种一条信号传导途径的两类生物效应现象，可能与信号途径中不同效应的分子水平有关。如果TRADD或FADD水平低而TRAF水平高，信号将不沿死亡途径传导，而朝激活NF-κB的途径传导，或出现病毒抑制蛋白、广谱抑制剂阻断TRADD或FADD的效应。这说明TRADD诱导细胞凋亡的途径要比FADD曲折、时程慢(需要1d或以上)。
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4.3 RIP：RIP是受体相互作用蛋白质(receptor interacting protein, RIP)分子量为75kD，C-终端含死亡结构域，与CD95、CD120a死亡结构域相互作用；N-终端含有与丝/苏氨酸同源的序列，因此，它可能有应激效应。它在组织的含量比CD95mRNA的少，但能快速集聚。转染RIP的BHK细胞过度表达RIP可导致细胞凋亡；RIP突变缺失了C-终端，可丧失诱发凋亡的能力；而N-终端缺失突变只降减这种能力(Stanger等，1995)。
4.4 FLICE：FLICE是FADD同源的ICE/CED-3样蛋白酶(FADD-homologus ICE/CED-3-like protease, FLICE)[16]，为内源性胞质信号媒体分子，是目前所知胞内信号分子中唯一连接死亡受体并将死亡信号直接传递到ICE/CED-3蛋白酶的分子。它的N-终端含有两个(7～75、101～169)各约60个氨基酸的区域，与FADD(4～76)氨基酸的死亡效应子结构域同源，相似性达55%；分子的其余部分与ICE/CED-3族特别是与其中的Yama/CPP32,Mch-2,ICE-LAP3,ICE-LAP6相似；其活性五肽QACRG代替了QACQG。在胎儿(脑除外)和成年的多种组织中均有表达。
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在CD95活化之后，至少有4个内源性胞毒依赖Apo-1相关蛋白(cytotoxicity-dependent Apo-1-associated proteins, CAPs)与其相结合而成诱发死亡信号复合物(death-inducing signaling complex, DISC)。CAP1和CAP2为FADD丝氨酸磷酸化的变型；CAP4是ICE/CED-3族的新成员，编码55kD分子即FLICE，它结合于FADD死亡效应子结构域，过度表达时诱发细胞凋亡。FLICE水解活化时结合受体的原结构域(prodomain)生成CAP3[16]。
另外，在死亡受体触发死亡信号传导途径中，发现存在有干扰或抑制细胞凋亡的病毒蛋白质。如牛痘病毒表达的CrmA、杆状病毒表达的IAP、马科疱疹病毒2型E8蛋白和软体动物传染病毒MC159蛋白，即FLICE抑制蛋白质(FLICE-inhibitory proteins, v-FLIPs)[17]。E8和MC159含有与Caspase-8和FADD死亡效应子结构相似的序列，能够分别与Caspase-8和FADD相结合，阻断其效应，保护细胞免受死亡受体触发的凋亡(Thome等，1997；Irmler等，1997)。此外，还有原癌基因bcl-2族产物和广谱抑制剂。
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5.细胞结构分子的杀手Caspase族蛋白酶
分子遗传学和分子生物学的综合研究表明，在哺乳动物胞质中裂解细胞结构分子的蛋白酶有ICE、神经磷脂酶、粒性蛋白酶B、组织蛋白酶、细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)(线粒体释放的)和Calpain(胞内Ca2+浓度高时活化)，但细胞凋亡机构的中心成分是ICE族蛋白酶(附表)。Alnemri等(1996)根据ICE/CED-3族蛋白酶的两个催化特性分别用“C”(表示半胱氨酸蛋白酶的机制)和“apase”(表示在天冬氨酸之后裂解的性质)组成新词Caspase代替ICE/CED-3，其后缀的数字示其亚族的成员。
人的Caspase族蛋白酶(附表)是Asp特异性半胱氨酸蛋白酶(ASCPs)，它们是无活性的酶原，或通过自动催化或被其他蛋白酶裂解成为有活性的蛋白酶。实验表明，ICE族各个成员的过度表达均能诱发细胞凋亡[3]。这些蛋白酶在种系发生上反映出各成员之间的同源性和保守性。人和鼠的ICE与线虫ced-3基因编码的CED-3蛋白酶序列相似，大部分同源，其中29%完全一致，活性区域中的111个残基是最保守的；ICE酶原在Asp103、119、297、316位被裂解成为p20和p10两个亚单位，组成(p20)2/(p10)2的活性ICE四聚体(Wilson等，1994；Walker等，1994)。ice基因在人定位于第11号染色体q23，在人鼠杂交细胞定位于第11号染色体q13-q23，Rat-1成纤维细胞转染ice后其表达产物能够诱发细胞凋亡；ice基因打靶缺陷小鼠无成熟的IL-1β(Li等，1995；Kuida等，1995)。一般在CD95或CD120a被激活之后不久，胞内便能检测到被ICE裂解的蛋白质(Tewari等，1995)。Caspase族成员的活性部位主要在QACQG或QACRG五肽。最近在被Caspase-3激活的HeLa胞质中发现一种诱发DNA断裂的蛋白质，称为DNA断裂因子(DNA fragmentation factor, DFF)[18]。Caspase-3或Caspase-6裂解死亡底物核蛋白，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，产生85kD片段且抑制DNA的修复；核酸内切酶的激活将核小体DNA裂解成为约24kD的片段，电泳图像呈阶梯型(Lazebnik等，1995)；Lamins被Caspase-6蛋白酶裂解，使染色质失去附着点而浓缩；胞质肌动蛋白和其相关蛋白α-fodrin被裂解，影响质膜和细胞骨架蛋白的结构和性能，使凋亡的细胞形成包膜的凋亡小体(Martin和Green，1995)。实验显示CPP32缺陷小鼠比同窝的个体小，出生后1～3周龄死亡，其胸腺细胞凋亡反应无变化，但脑细胞凋亡减少，影响脑的发生(Kuida等，1996)。由于细胞凋亡信号的传导呈交联和串联方式，因此，非凋亡细胞有多处蛋白酶被激活，可导致该细胞的突然死亡。上述结果说明，不同组织和动物之间的细胞凋亡会有共同的形态变化特点。
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附表 人的ICE蛋白酶超家族
Table Human ICE protease superfamily 蛋白酶protease
同义词
synonyms
识别序列
recognition sequence
底物
substrates
caspase-1
ICE
Tyr-Val-Ala-Asp
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pro-IL-1β,pro-caspase-3 and 4
caspase-2
ICH-1
PARP
caspase-3
CPP32，Yama,apopain
Asp-Glu-Val-Asp
PARP，DNA-PK,SRE-BP,rho-GDI
caspase-4
ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2
, http://www.100md.com caspase-5
ICE rel-Ⅲ,TY
caspase-6
Mch2
Val-Glu-Ile-Asp
Lamin A
caspase-7
Mch3,ICE-LAP3,CMH-1
PARP，pro-caspase-6
caspase-8
FLICE，MACH，Mch5
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caspase-9
ICE-LAP6,Mch6
PARP
caspase-10
Mch4/FLICE2
caspase-11
ICH-3
6.神经细胞营养(诱向)因子阻止神经细胞凋亡
脊椎动物神经板移植块实验证明，特定基因能启动原始细胞向特定类型神经元分化(Tanabe等，1995)，同时神经细胞存活依赖于靶源和非靶源神经营养因子的协调供应，其中靶源性NTFs起主导作用，其他相关的NTFs也可起保护神经元免受伤害的作用。实验显示CNTF、BDNF能够挽救或阻止鸡胚、鼠胚及新生动物的运动神经元凋亡(Oppenheim等，1991、1992；Henderson等，1993)。在鸡胚6～9d运动神经元凋亡期内，GDNF能挽救其1/4的凋亡细胞[19]。靶源性骨骼肌营养因子效果更突出，可以阻止培养中已进入死亡的运动神经细胞不再凋亡。但是，心肌、平滑肌或肝、肾、肺的提取液均无此种效应(Comella等，1994)。不仅如此，NT-3也能调整特定神经细胞凋亡的阈值[20]。应该强调的是，在神经细胞发生的不同时期需要不同的NTFs。如小鼠E11d的三叉神经节需要NT-3，到E13d则转为需要NGF(Bucham和Davis，1993)。在NT-3-/-突变小鼠，腰部背根节神经元缺少50%～70%，NGF/TrkA突变小鼠的腰背根节神经细胞则缺少70%～80%，这表明其对维持背根节神经细胞的重要性(White等，1996)。NT-3和NGF因成熟交感神经细胞能表达TrkC受体，所以需要NT-3；成熟的交感神经元表达的是TrkA受体，因此需要的是NGF(Birren等，1993)。我们在以前的研究发现，大鼠视网膜节细胞的RGNTF及其受体含量的减少，与细胞死亡增多呈平行关系(Chan等，1992)。最近报道[11]指出，NGF与TrkA的结合可保障神经元的存活，缺失TrkA的细胞则会产生凋亡。但是，BDNF、NF-3在不同条件下也可以增加神经元死亡的负向效应(Koh等，1995)，说明其作用机制的复杂性。
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7.结束语
细胞凋亡的基本原则在进化中是保守的，在多细胞机体中遗传途径相同，在个体发生中是固有的生理过程。这一过程的障碍可产生细胞增殖失控(肿瘤形成)，也可由于细胞凋亡亢进造成神经退变性疾病。近年来的研究证明，NTFs在保障神经细胞健康存活、执行生理功能、抵抗细胞毒、阻止凋亡和促进再生方面有重要的生物学效应；同时，也发现有多种病毒蛋白可以阻止或干扰凋亡信号的传导，这些研究成果对丰富基础理论和拓展新药品开辟了广阔的前景，也为临床治疗许多疾病带来了新的希望。
本文由Growth Factor公司资助
收稿1998-04 修回1998-09
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单位：周明华 陈思颖 吴玺印 香港大学医学院解剖学系，香港
关键词：
解剖学报990226 MOLECULAR REGULATION OF NEURONAL APOPTOSIS AND
TRANSDUCTIONAL PATHWAY FOR DEATH SIGNAL
在生物机体的正常发生发育和生长分化过程中，其细胞分裂、生长分化和细胞死亡的精密配合起着重要的作用。脊椎动物神经系统在个体发生中即使没有遇到外在损害，其神经细胞在竞争靶源有限的神经营养因子(神经细胞诱向因子neuronotrophic factors, NTFs)过程中，在特定部位和时间也会按自身的程序主动死亡，即Lockshin和Williams称之为编程性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。哺乳动物从囊胚开始终生都有广泛、持续的细胞PCD。例如，成年人每小时有亿万个细胞发生PCD(Raff，1996)，这说明PCD在调节细胞增殖的数量中起着重要作用。这类细胞死亡有着独特的形态和生物化学特点：如染色质浓缩、核酸内切酶将核小体DNA裂解为160～180bp片段，其电泳图像呈梯阶形式；细胞的泡状外突形成包膜的凋亡小体(apoptotic bodies)；死亡细胞或其残片迅速被巨噬细胞膜的糖蛋白CD14所识别、吞噬而清除(Devitt等，1998)，没有漏出内容物，无炎症反应等，Kerr等(1972)将这些表现特称为细胞凋亡(apoptosis)。所以，细胞凋亡完全不同于细胞坏死，后者出现细胞膨胀瓦解并引起炎症反应。但是，在神经系统的PCD中也有非凋亡式的细胞死亡(Oo等，1996)。
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近十几年来的研究表明，NTFs及其受体在保障特定神经细胞的存活，促进生长、分化，特别是在防止凋亡方面有显著的生物学效应；实验性NTFs或其受体基因突变，可导致动物相关神经细胞出现明显的缺陷。同时，细胞死亡基因(cell death gene,ced)或其调控基因突变，会导致本该死亡的细胞不死亡，或该存活的细胞不存活，传导死亡信号分子的定点定向突变的实验获得了同样的效果。这些研究结果为探索神经细胞因正向或负向凋亡失调所导致的退行变性或增生亢进机制和应用开辟了广阔的前景[1～3]。
1.神经细胞凋亡是正常神经系统发育及病变中的必然过程
脊椎动物神经系统内不同部分的神经细胞凋亡的时间和程度是有差别的。如脊髓运动神经细胞凋亡的时间在鸡出现于E6.5～9.5d，大鼠为E15d；鼠的黑质多巴胺(DA)能神经细胞出现于E21d，出生后有2次凋亡高峰期，即6d及14d，而后一次高峰期恰是其靶结构(纹状体)内依赖NTFs的突触形成期(Oo和Bruke, 1996)；大鼠视网膜节细胞在出生后前5d凋亡达70%；小脑皮质颗粒细胞在出生后小鼠和人发育的前3个月均有凋亡(Lossi等，1996)。从神经细胞凋亡的程度来看，三叉神经中脑根核有75%(或85%)、听觉中继核有15%的神经元有凋亡；脑桥核、蓝斑、红核和海马主体结构则无明显的神经细胞凋亡。在成年期虽然一些神经核、皮质和神经节均保留约50%的长寿神经元，但到老化时仍会有明显的凋亡。最近通过用BRDU标记鸡胚胎脊髓运动神经细胞核的实验，发现运动神经元从出现到PCD之间有固定的间隙期(interval period)，最早出现的运动神经元最先开始PCD[4]。另外，截肢后的运动神经元、视神经损伤后的视网膜节细胞(Bien等，1996)，或失去大量传入纤维的嗅皮质锥体细胞(Capurso等，1996)或神经退变病的神经元均发现有细胞凋亡现象[5]。
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2.神经细胞凋亡和细胞死亡基因
从线虫(C.elegans)到哺乳动物(包括人)均发现有细胞死亡基因。线虫的主要死亡基因为ced-3和ced-4，ced-3编码的CED-3蛋白酶序列与哺乳动物的白细胞介素-1β转化酶(interleukin-1β converting enzyme, ICE)同源，是半胱氨酸蛋白酶。实验显示ced-3产物杀死细胞不需要内源的ced-4；而ced-4过度表达诱导的细胞死亡需要ced-3的活化。ced-4基因变异剪接(alternative splicing)的产物CED-4L或点突变，无论在线虫或哺乳动物均可丧失触发细胞死亡效应，这表明ced-4可能在ced-3的上游起作用，或与ced-3相平行起作用。ced-9为存活基因(survival gene)，其编码的蛋白质与原癌基因产物Bcl-2族的Bcl-XL同源，有抑制CED-4的作用，以致转染bcl-2基因或Bcl-2的线虫不会因ced-9突变而出现PCD，即能保护神经细胞和其他细胞的存活。这些基因在个体发生中都能自动地调控细胞死亡[6，7]。果蝇的死亡基因rpr(reaper)编码的RPR蛋白酶有ICE样效应，其死亡结构域(death domain)与死亡受体(death receptors) TNFR1和Fas(见后)同源(Golstein等，1995)。rpr在细胞死亡前1～2h才表达RPR，基因的部分缺失将阻止细胞正常凋亡；基因的过度表达则导致眼视网膜脱落，但能够被杆状病毒的抑制凋亡蛋白质(P35IAP)所抑制，这表明RPR激活了CED-3/ICE介导的细胞死亡程序[8]。最近，在哺乳动物发现的蛋白酶Apopain特异地酶解死亡底物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，当细胞内Apopain活性增高即启动细胞死亡(Nicholson等，1995)。在脊髓肌萎缩(SMA)病相关基因第5号染色体q13的邻近q13.1为新发现的基因，编码一种与IAP同源的神经元凋亡抑制蛋白质(neuronal apoptosis inhibitory protein, NAIP)[9]；用PCR法从λZapⅡ人胎儿脑cDNA文库和λUniZap人肝cDNA文库分离的与IAP同源的xiap、hiap-1和hiap-2基因，其表达产物均能抑制细胞凋亡(Liston等，1996)；在SMA病人运动神经元第5号染色体端粒区鉴定到20kb的运动神经元存活基因(survival motor neuron gene,SMN)，此基因在229例SMA病人中有226例发现存在缺少或断裂，其余3例则在6、7内含子处有点突变(Y272C)，这导致了病人运动神经元的退变凋亡，他们认为SMN基因是决定SMA病的基因[10]。用原位杂交法证实SMNmRNA位于大鼠、猴中枢神经系神经元细胞质，RT-PCR法分离大鼠的SMN有90%与人的同源(Princivalle等，1996)。此外，尚有一些原癌基因通过特定途径可诱发细胞凋亡(如bad、bak、bax、bik、c-myc、p53)，或促进细胞存活(如bcl-2、mcl-1、v-abl、brc-abl)(Gajewski和Thompson，1996)。
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3.死亡受体和死亡配体
触发细胞凋亡的死亡受体主要是肿瘤坏死因子(TNF)/NGF受体超家族成员，如TNFR1、Fas/Apo-1、p75(NTR)[11]、DR-3/WSL-1/Apo-3、DR-4、DR-5(Chinnaiyan等，1996；Marsters等，1996；Pan等，1997；Sheridan等，1997)、 LTβR(淋巴细胞毒素β受体)、TRAMP(Bodmer等，1997)，它们通过其胞外结构域与相应的死亡配体或因子(death ligands or factors)相结合，触发死亡受体胞内结构域产生死亡信号，传给胞溶质中的信号媒体分子；也可通过细胞表面另一类介导病毒进入细胞的受体，如疱疹病毒进入细胞的介体(HVEM)(Motogomery等，1996)、禽类细胞病白血病-肉瘤病毒介导凋亡的受体(CAR1)(Brojalsch等，1996)导致细胞凋亡。TNF/NGF受体超家族成员分子结构的特点是跨膜的I型膜蛋白，其胞外结构域大约每40个氨基酸中含6个半胱氨酸的不完全重复片段，可与配体结合；其胞内结构域均含有死亡结构域(约含80个氨基酸)，是死亡信号产生及死亡信号分子相互结合的部位，也是决定蛋白-蛋白相互作用顺序和活化转录因子NF-κB的部位。TNFR死亡结构域突变往往发生在α-螺旋结构的保守氨基酸处，因此可以干扰受体死亡信号的传导。
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3.1 Fas/Apo-1：80年代末，Yonehara S和Krammer P两个研究组分别在成纤维细胞和免疫细胞中发现了表面抗原。人的Fas有325个氨基酸，其基因定位于第10号染色体长臂(q)，小鼠则定位于第19号染色体，有9个外显子。人的Fas抗体与小鼠表达Fas的转化细胞交联后5h内细胞凋亡，表明Fas为细胞表面传导死亡信号的受体(死亡受体)。对Apo-1进行与Fas相同方式的实验，结果完全一样，并证明两者的分子序列完全一致。这表明Fas/Apo-1是相同性质的受体，同属Ⅰ型膜蛋白，为TNF/NGF受体超家族成员，目前常用CD95(分化抗原簇抗体)来表示Fas(Oehm等，1992)。这类受体的胞外结构域富集半胱氨酸亚结构域，胞内结构域则含有死亡结构域。CD95在不同组织和细胞株表达量差别很大，物种间的差别明显。如小鼠胸腺高水平地表达Fas，在人却很弱。在常染色体隐性突变的Lpr小鼠，其Fas238位缬氨酸被天冬酰胺取代，其细胞便具有了抗凋亡性能。
Fas配体(CD95L)分子量约40kD，克隆小鼠和人的CD95L属Ⅱ型膜蛋白，C-终端在胞外，中间部为疏水区的跨膜部，N-终端则无信号序列。CD95L胞外部150个氨基酸序列与TNF族成员的TNF、CD27L、CD40L、CD30L同源。在表达CD95的COS细胞与rCD95L结合之后5h内细胞凋亡，表明CD95L为CD95的死亡配体或因子(Suda等，1993；Nagata和Suda，1995)。小鼠CD95L序列有76.9%与人的完全一致。一般说，CD95介导的凋亡信号传导在细胞表面需要有足够密度的CD95、CD95L与CD95结合成为寡聚体和凋亡敏感的细胞等3个因素。CD95发出的死亡指令直接传导给有死亡结构域的胞内信号媒体分子FADD/MORT1，再传递到蛋白酶(后述)。
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3.2 TNF和TNFRs：肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,NTF)是70年代中期在免疫细胞最早发现的细胞死亡因子，其受体迟至90年代中才分离鉴定为TNFR1(CD120a)和TNFR2(CD120b)，两者在广泛的组织均有表达。它们象CD95、p75(NTR)、CD40一样同属Ⅰ型膜蛋白，为TNF/NGF受体超家族的成员。TNF对多种类型细胞有引起凋亡、抗病毒活性、激活转录因子(NF-κB)和保护宿主抗拒微生物及病原菌等生物学效应(Pfeffer等，1993；Rotte等，1993)。CD120a既能触发细胞凋亡又能激活NF-κB，少量通过CD120b起作用的也限于免疫系统。CD120a和b的胞外部分～30%氨基酸序列完全一致，富集半胱氨酸，两者性能差别主要取决于其胞内部分的初级氨基酸序列无相似性。CD120a的胞内部分象CD95一样含有～80个氨基酸的死亡结构域，为诱导细胞凋亡和激活NF-κB的分子基础；而CD120b的胞内部分为TRAF(TNFR相关因子TNFR-associated factor，TRAF)结构域，参与活化NF-κB。因此TNF和两者结合构成寡聚体活化后，分别与各自相关信号媒体分子相互作用，构成各不相同的信号传导途径，使细胞产生不同的生物学效应。基因敲除(Erickson等，1994)和受体特异激动抗体的实验(Wong等，1995)进一步证明两个受体产生互不重叠的信号(Hsu等，1995)，再通过胞内信号媒体分子TRADD、RIP(见后)传导到酶解细胞结构分子的Caspase族蛋白酶。
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3.3 p75(NTR)：p75(NTR)为神经营养素(neurotrophins,NTs)的协助受体，最初只了解它是NGF的低亲和力受体(LNGF)，现在知道它以几乎相等的亲和力及不同的动力学与各个NT相结合，所以现在常用p75(NTR)来表示。其分子结构和介导细胞凋亡的性能与CD120a、CD95有明显相似性，亦为TNF/NGF受体超家族成员[11]。p75(NTR)胞外部含3或4个不完全重叠的富集半光氨酸的亚结构域，胞内部分无催化结构域，但有与CD120a、CD95死亡结构域的同源部分。RT-PCR法证明，在不表达TrkA(酪氨酸激酶A，NGF受体)的少突胶质细胞，NGF与其p75(NTR)结合可导致该细胞凋亡[12]；在NIH3T3细胞与p75(NTR)结合不激活其c-jun激酶或PCD；在Schwann细胞，与p75(NTR)的结合可活化转录因子NF-κB与DNA结合(Anton等，1994)；BDNT或NT-3则无此效应(Carter等，1996)。鸡胚发生早期的视网膜节细胞能表达p75(NTR)而不表达TrkA，内源性NGF与p75(NTR)结合可诱发细胞凋亡，但用NGF抗体预先处理之后便可阻止细胞凋亡，BDNF或NT-3则无这种效应[13]。这说明神经系统在内源NGF与死亡受体结合后能导致细胞凋亡。换言之，NGF对细胞的正向或负向效应取决于神经细胞表达的受体类型。体外培养的实验显示，交感神经元在去除NGF1h内，可激活原来在细胞周期中促进细胞分裂的周期素D1和A，上调c-jun、c-fos基因活性，结果导致神经元凋亡(Kanenburg等，1996)。
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3.4 DR：死亡受体(death receptor)已经鉴定的有DR3、DR4和DR5，前者也称为WSL-1Apo-3受体或TRAMP(TNFR介导的细胞凋亡蛋白质TNF-receptor apoptosis-mediating protein，TRAMP)，是近年主要在人的多淋巴细胞组织中鉴定的。它们同属TNF/NGF受体超家族成员，在脑内没有发现其mRNA。DR5序列有55%与DR4完全一致，与DR3为29%，CD120a为19%，CD95为17%。DR4和DR5的胞外结构域含有两个富集半胱氨酸的亚结构域，与CD120a、CD95的胞外结构域同源；其胞内结构域含有与CD120a、CD95相似的死亡结构域。实验表明，DR5介导受试靶细胞凋亡和激活转录因子NF-κB，但是CrmA(细胞因子应答修饰物A，cytokine response modifierA)或z-VAD-fmk能够抑制其生物学效应。因此，它们可能在调控体内淋巴细胞数量方面有重要作用。HVEM也是TNF/NGF受体超家族成员，克隆的HVEM有增强仓鼠、猪细胞抵抗疱疹病毒(HSV)入侵的敏感性，而HVEM抗体和含有其外结构域(ectodomain)的可溶性杂种蛋白质能抑制依赖HVEM的感染，HSV突变则可明显地减少HVEM介导的病毒入侵。
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DR4和DR5配体为TNF相关的诱导调亡配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL，也称Apo2L)，属TNF族成员，是一种细胞毒蛋白，能快速诱导许多转化细胞株的细胞凋亡，在正常组织不表达(Pan等，1997)。
4.细胞内传导死亡指令的信号分子
近年来已在细胞内发现了多个传导死亡指令的信号媒体分子，如FADD/MORT1、TRADD、RIP、FLICE。它们共同的特点是分子的C-终端含有死亡结构域，与相关受体胞质内的死亡结构域相互作用；其N-终端含有死亡效应子结构域(death effector domain)。这类分子将相应受体产生的死亡指令传递给瓦解细胞结构分子的Caspase族蛋白酶，并在其传递途径中也发现有干扰和抑制传导死亡信号的病毒蛋白和相应效应的原癌基因bcl-2族产物和抑制剂。
4.1 FADD：FADD是与Fas(CD95)相关的含死亡结构域蛋白质(Fas-associating protein with death domain, FADD)[14]，分子量为26kD，为CD95下游的信号传导分子，其C-终端含死亡结构域，N-终端含死亡效应子结构域。后来又发现一个结合CD95与FADD相同的分子，即MORT1(Kischkel等，1995)。由人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)文库筛选的FADD有208个氨基酸，其111～170位氨基酸与CD95 233～292位氨基酸是相匹配的，其中有21%完全一致。这个区域相当rCD95胞质部死亡结构域，与天然的CD95、CD120a产生死亡信号的结构域同源，其中25%～30%完全一致。N-终端缺少40个氨基酸的突变FADD，其C-终端死亡结构域仍然能够与CD95的死亡结构域相互作用，但诱发细胞凋亡的能力减小；N-终端117个氨基酸结合其下游死亡信号分子，具有触发细胞凋亡的能力，为死亡效应子结构域(Hsu等，1995)。FADD的121位缬氨酸被天冬酰胺取代(点突变)后，不能与CD95死亡结构域结合，便不能诱发细胞凋亡。这表明胞质死亡信号媒体分子是传导死亡信号的分子，而FADD直接接受CD95的死亡指令，再传递给Caspase族蛋白酶，这是一条快速导致细胞凋亡的途径(Fracer等，1996)。用Northern印迹法显示，胎儿和成人的多种组织能表达FADD。
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4.2 TRADD：TRADD是TNFR1(CD120a)相关的含死亡结构域蛋白质(TNFR1-associated death domain protein, TRADD)[15]，有312个氨基酸，分子量为34kD，其C-终端195～305氨基酸的死亡结构域中有23%和13%序列分别与CD120a和CD95一致，但CD120b胞内部为TRAF结构域而无死亡结构域。因此，在死亡信号传导途径的近侧，TRADD特异地与CD120a结合而不结合CD120b。转染TRADD的人胚胎肾293细胞2h后和对照比较，转染细胞出现凋亡形态特点和核小体DNA断裂；如共同转染crmA则阻止293细胞凋亡；与HeLa细胞一起培养36h后用X-Gal染色，蓝色阳性细胞减少100倍(Hsu等，1995)。这证实TRADD能够诱发细胞凋亡，而CrmA对其有抑制效应，对转录因子NF-κB的激活效应则未受影响。这种一条信号传导途径的两类生物效应现象，可能与信号途径中不同效应的分子水平有关。如果TRADD或FADD水平低而TRAF水平高，信号将不沿死亡途径传导，而朝激活NF-κB的途径传导，或出现病毒抑制蛋白、广谱抑制剂阻断TRADD或FADD的效应。这说明TRADD诱导细胞凋亡的途径要比FADD曲折、时程慢(需要1d或以上)。
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4.3 RIP：RIP是受体相互作用蛋白质(receptor interacting protein, RIP)分子量为75kD，C-终端含死亡结构域，与CD95、CD120a死亡结构域相互作用；N-终端含有与丝/苏氨酸同源的序列，因此，它可能有应激效应。它在组织的含量比CD95mRNA的少，但能快速集聚。转染RIP的BHK细胞过度表达RIP可导致细胞凋亡；RIP突变缺失了C-终端，可丧失诱发凋亡的能力；而N-终端缺失突变只降减这种能力(Stanger等，1995)。
4.4 FLICE：FLICE是FADD同源的ICE/CED-3样蛋白酶(FADD-homologus ICE/CED-3-like protease, FLICE)[16]，为内源性胞质信号媒体分子，是目前所知胞内信号分子中唯一连接死亡受体并将死亡信号直接传递到ICE/CED-3蛋白酶的分子。它的N-终端含有两个(7～75、101～169)各约60个氨基酸的区域，与FADD(4～76)氨基酸的死亡效应子结构域同源，相似性达55%；分子的其余部分与ICE/CED-3族特别是与其中的Yama/CPP32,Mch-2,ICE-LAP3,ICE-LAP6相似；其活性五肽QACRG代替了QACQG。在胎儿(脑除外)和成年的多种组织中均有表达。
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在CD95活化之后，至少有4个内源性胞毒依赖Apo-1相关蛋白(cytotoxicity-dependent Apo-1-associated proteins, CAPs)与其相结合而成诱发死亡信号复合物(death-inducing signaling complex, DISC)。CAP1和CAP2为FADD丝氨酸磷酸化的变型；CAP4是ICE/CED-3族的新成员，编码55kD分子即FLICE，它结合于FADD死亡效应子结构域，过度表达时诱发细胞凋亡。FLICE水解活化时结合受体的原结构域(prodomain)生成CAP3[16]。
另外，在死亡受体触发死亡信号传导途径中，发现存在有干扰或抑制细胞凋亡的病毒蛋白质。如牛痘病毒表达的CrmA、杆状病毒表达的IAP、马科疱疹病毒2型E8蛋白和软体动物传染病毒MC159蛋白，即FLICE抑制蛋白质(FLICE-inhibitory proteins, v-FLIPs)[17]。E8和MC159含有与Caspase-8和FADD死亡效应子结构相似的序列，能够分别与Caspase-8和FADD相结合，阻断其效应，保护细胞免受死亡受体触发的凋亡(Thome等，1997；Irmler等，1997)。此外，还有原癌基因bcl-2族产物和广谱抑制剂。
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5.细胞结构分子的杀手Caspase族蛋白酶
分子遗传学和分子生物学的综合研究表明，在哺乳动物胞质中裂解细胞结构分子的蛋白酶有ICE、神经磷脂酶、粒性蛋白酶B、组织蛋白酶、细胞凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)(线粒体释放的)和Calpain(胞内Ca2+浓度高时活化)，但细胞凋亡机构的中心成分是ICE族蛋白酶(附表)。Alnemri等(1996)根据ICE/CED-3族蛋白酶的两个催化特性分别用“C”(表示半胱氨酸蛋白酶的机制)和“apase”(表示在天冬氨酸之后裂解的性质)组成新词Caspase代替ICE/CED-3，其后缀的数字示其亚族的成员。
人的Caspase族蛋白酶(附表)是Asp特异性半胱氨酸蛋白酶(ASCPs)，它们是无活性的酶原，或通过自动催化或被其他蛋白酶裂解成为有活性的蛋白酶。实验表明，ICE族各个成员的过度表达均能诱发细胞凋亡[3]。这些蛋白酶在种系发生上反映出各成员之间的同源性和保守性。人和鼠的ICE与线虫ced-3基因编码的CED-3蛋白酶序列相似，大部分同源，其中29%完全一致，活性区域中的111个残基是最保守的；ICE酶原在Asp103、119、297、316位被裂解成为p20和p10两个亚单位，组成(p20)2/(p10)2的活性ICE四聚体(Wilson等，1994；Walker等，1994)。ice基因在人定位于第11号染色体q23，在人鼠杂交细胞定位于第11号染色体q13-q23，Rat-1成纤维细胞转染ice后其表达产物能够诱发细胞凋亡；ice基因打靶缺陷小鼠无成熟的IL-1β(Li等，1995；Kuida等，1995)。一般在CD95或CD120a被激活之后不久，胞内便能检测到被ICE裂解的蛋白质(Tewari等，1995)。Caspase族成员的活性部位主要在QACQG或QACRG五肽。最近在被Caspase-3激活的HeLa胞质中发现一种诱发DNA断裂的蛋白质，称为DNA断裂因子(DNA fragmentation factor, DFF)[18]。Caspase-3或Caspase-6裂解死亡底物核蛋白，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，产生85kD片段且抑制DNA的修复；核酸内切酶的激活将核小体DNA裂解成为约24kD的片段，电泳图像呈阶梯型(Lazebnik等，1995)；Lamins被Caspase-6蛋白酶裂解，使染色质失去附着点而浓缩；胞质肌动蛋白和其相关蛋白α-fodrin被裂解，影响质膜和细胞骨架蛋白的结构和性能，使凋亡的细胞形成包膜的凋亡小体(Martin和Green，1995)。实验显示CPP32缺陷小鼠比同窝的个体小，出生后1～3周龄死亡，其胸腺细胞凋亡反应无变化，但脑细胞凋亡减少，影响脑的发生(Kuida等，1996)。由于细胞凋亡信号的传导呈交联和串联方式，因此，非凋亡细胞有多处蛋白酶被激活，可导致该细胞的突然死亡。上述结果说明，不同组织和动物之间的细胞凋亡会有共同的形态变化特点。
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附表 人的ICE蛋白酶超家族
Table Human ICE protease superfamily 蛋白酶protease
同义词
synonyms
识别序列
recognition sequence
底物
substrates
caspase-1
ICE
Tyr-Val-Ala-Asp
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pro-IL-1β,pro-caspase-3 and 4
caspase-2
ICH-1
PARP
caspase-3
CPP32，Yama,apopain
Asp-Glu-Val-Asp
PARP，DNA-PK,SRE-BP,rho-GDI
caspase-4
ICErel-Ⅱ,TX,ICH-2
, http://www.100md.com caspase-5
ICE rel-Ⅲ,TY
caspase-6
Mch2
Val-Glu-Ile-Asp
Lamin A
caspase-7
Mch3,ICE-LAP3,CMH-1
PARP，pro-caspase-6
caspase-8
FLICE，MACH，Mch5
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caspase-9
ICE-LAP6,Mch6
PARP
caspase-10
Mch4/FLICE2
caspase-11
ICH-3
6.神经细胞营养(诱向)因子阻止神经细胞凋亡
脊椎动物神经板移植块实验证明，特定基因能启动原始细胞向特定类型神经元分化(Tanabe等，1995)，同时神经细胞存活依赖于靶源和非靶源神经营养因子的协调供应，其中靶源性NTFs起主导作用，其他相关的NTFs也可起保护神经元免受伤害的作用。实验显示CNTF、BDNF能够挽救或阻止鸡胚、鼠胚及新生动物的运动神经元凋亡(Oppenheim等，1991、1992；Henderson等，1993)。在鸡胚6～9d运动神经元凋亡期内，GDNF能挽救其1/4的凋亡细胞[19]。靶源性骨骼肌营养因子效果更突出，可以阻止培养中已进入死亡的运动神经细胞不再凋亡。但是，心肌、平滑肌或肝、肾、肺的提取液均无此种效应(Comella等，1994)。不仅如此，NT-3也能调整特定神经细胞凋亡的阈值[20]。应该强调的是，在神经细胞发生的不同时期需要不同的NTFs。如小鼠E11d的三叉神经节需要NT-3，到E13d则转为需要NGF(Bucham和Davis，1993)。在NT-3-/-突变小鼠，腰部背根节神经元缺少50%～70%，NGF/TrkA突变小鼠的腰背根节神经细胞则缺少70%～80%，这表明其对维持背根节神经细胞的重要性(White等，1996)。NT-3和NGF因成熟交感神经细胞能表达TrkC受体，所以需要NT-3；成熟的交感神经元表达的是TrkA受体，因此需要的是NGF(Birren等，1993)。我们在以前的研究发现，大鼠视网膜节细胞的RGNTF及其受体含量的减少，与细胞死亡增多呈平行关系(Chan等，1992)。最近报道[11]指出，NGF与TrkA的结合可保障神经元的存活，缺失TrkA的细胞则会产生凋亡。但是，BDNF、NF-3在不同条件下也可以增加神经元死亡的负向效应(Koh等，1995)，说明其作用机制的复杂性。
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7.结束语
细胞凋亡的基本原则在进化中是保守的，在多细胞机体中遗传途径相同，在个体发生中是固有的生理过程。这一过程的障碍可产生细胞增殖失控(肿瘤形成)，也可由于细胞凋亡亢进造成神经退变性疾病。近年来的研究证明，NTFs在保障神经细胞健康存活、执行生理功能、抵抗细胞毒、阻止凋亡和促进再生方面有重要的生物学效应；同时，也发现有多种病毒蛋白可以阻止或干扰凋亡信号的传导，这些研究成果对丰富基础理论和拓展新药品开辟了广阔的前景，也为临床治疗许多疾病带来了新的希望。
本文由Growth Factor公司资助
收稿1998-04 修回1998-09
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