大鼠消化道促性腺激素释放激素受体的免疫组织化学研究*
作者：姚 兵 黄威权 孙 岚
单位：第四军医大学组织学胚胎学教研室，西安 710032
关键词：GnRH受体；定位；消化道；免疫组织化学；大鼠
解剖学报990214 【摘要】 目的 探讨大鼠消化道是否存在GnRH受体及其定位。 方法 采用兔抗GnRH抗独特型抗体的免疫组织化学ABC法。 结果 胃底腺壁细胞、胃小凹上皮细胞及肌间神经丛的副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性。三段小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、十二指肠腺上皮细胞以及小肠肌间神经丛副交感神经节细胞，均呈较强的GnRH受体免疫反应性。在盲肠、结肠和直肠，粘膜上皮细胞、肠腺上皮细胞及肌间神经丛呈GnRH受体免疫反应性。阳性物质均分布在胞质内，胞核呈阴性。 结论 大鼠消化道广泛分布有GnRH受体，其分布模式与先前GnRH及GnRH-mRNA的相类似。说明胃肠道的一些细胞分泌的GnRH可能以自分泌或旁分泌的方式参与消化功能的调节。
, 百拇医药
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF GONADOTROPIN RELE-
ASING HORMONE RECEPTOR IN RAT DIGESTIVE TRACT
Yao Bing,Huang Weiquan△,Sun Lan
(Department of Histology and Embryology of Fourth Militay Medical University Xi'an)
【Abstract】 Objective To study whether gonadotropin releasing hormone receptor(GnRHR) can exist in rat digestive tract and its localization.Method Immunohistochemical ABC method was used to study the localization of GnRHR in rat digestive tract.Results Parietal cells of gastric gland,epithelium of gastric pit and parasympathetic ganglion cells of myenteric plexus show GnRHR immunoreactivity.In small intestine,the villous epithelial cells,Paneth cells and parasympathetic ganglion cells in myenteric plexus show GnRHR immunoreactivity.In caecum,colon,rectum,the surface epithelium,glandular epithelium and parasympatheitc ganglion cells also show GnRHR immunoreactivity.The reactive substance distributes in cytoplasm of all positive cells with negative nuclei.Conclusion The GnRHR is widely distributed in rat digestive tract with distributive pattern similar to those of GnRH and GnRH-mRNA.It suggests that the GnRH may response for modulating the digestive function via autocrine or paracrine mechanism.
, 百拇医药
【Key words】 Gonadotropin releasing hormone receptor(GnRHR); Localization; Digestive tract;Immunohistochemistry;Rat
我们先前的研究已经证实，大鼠消化系统广泛分布有GnRH免疫反应性上皮细胞和神经细胞，而且证实这些细胞同样存在GnRH-mRNA的杂交信号，说明胃、肠、胰能自身合成GnRH[1，2]。随后我们又证实大鼠颌下腺和胰含有GnRH的受体[3，4]。说明它们又是GnRH的靶器官。但是大鼠消化道是否存在GnRH的靶细胞尚未得到证实。本实验采用免疫组织化学ABC法研究了GnRH受体在大鼠胃肠系统的定位，为GnRH对胃肠道可能的功能意义提供形态学依据。
材料和方法
1.试剂
, 百拇医药
GnRH抗独特型抗体由本室自制[5]。链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品。
2.组织材料
雄性SD大鼠5只，在戊巴比妥钠腹腔麻醉下，打开胸腔，经主动脉灌注Bouin液固定20min后，分别取出胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠再置Bouin液中室温固定过夜，按石蜡包埋程序将上述组织包埋于同一蜡块内，切成6μm厚的切片，贴于涂有铬矾明胶的载玻片上。
3.免疫组织化学反应程序
切片经脱蜡水化后，按免疫组织化学ABC法程序进行染色。第1抗体为兔抗GnRH抗独特型抗体(1∶100稀释)，4℃冰箱孵育过夜，第2抗体为生物素标记的羊抗兔IgG抗体(1∶200稀释)，在室温孵育1h。SABC复合物(1∶200稀释)，在室温孵育30min。阴性对照作如下设置：用预先经兔抗GnRH抗体吸收后的第1抗体进行孵育；用正常兔血清取代第1抗体进行孵育。
, 百拇医药
结 果
GnRH受体免疫反应性细胞呈棕色，背底不着色，反差明显，阳性细胞易于识别。两种阴性对照试验均呈阴性反应。
大鼠胃底腺的壁细胞(图1)、胃小凹的上皮细胞(图2)呈GnRH受体强免疫反应性，阳性产物分布于胞质，核呈阴性。三段小肠绒毛上皮细胞均呈GnRH受体免疫反应性，反应强度从绒毛顶端到绒毛基底部呈逐渐减弱的趋势(图3)。潘氏细胞也呈GnRH受体免疫反应性，阳性物质分布在胞质(图4)。十二指肠腺的所有细胞均呈GnRH受体免疫反应性，反应产物分布在胞质，细胞的周边着色较强(图4)。盲肠、结肠和直肠的粘膜上皮及肠腺上皮细胞也都呈GnRH受体免疫反应性，但是反应强度从肠腺的顶端到基底部呈逐渐减弱的趋势，阳性物质也分布在胞质内(图5)。胃、3段小肠及3段大肠的肌间神经丛副交感神经节细胞均呈GnRH受体强免疫反应性，反应产物分布胞质内，胞核为阴性反应(图6)。
, 百拇医药
图1 胃底腺壁细胞呈GnRH受体免疫反应性，阳性物质分布在胞质内，胞核阴性×400
Fig.1 Parietal cells in gastric gland were shown GnRHR immunoreactivity in cytoplasm with negative nuclei.×400Fig.
图2 胃小凹粘膜上皮细胞呈GnRH受体免疫反应性，阳性物质分布在胞质内，胞核阴性 ×400
2 Epithelial cells in gastric pit were shown GnRHR immunoreactivity in cytoplasm with negative nuclei.×400
, 百拇医药
图3 a小肠绒毛上皮细胞和小肠腺潘氏细胞呈GnRH受体免疫反应性，小肠腺其余上皮细胞为GnRH受体阴性反应 ×100Fig.
b.小肠绒毛上皮细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
3 a.Epithelial cells in Villi and paneth cells in small intestinal gland were shown GnRHR immunorecactivity,the other epithelial cells in small intestinal gland were shown negative reactivity.×100
b.Epithelial cells in villi were shown GnRHR immunoreactivity. ×400
图4 a.小肠腺潘氏细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
, 百拇医药
b.十二指肠腺上皮呈GnRH受体免疫反应性 ×400
Fig.4 aPaneth cells in small intestinal gland were shown GnRHR immunoreactivity. ×400
bEpithelium of duodenal gland were shown GnRHR immunoreactivity. ×400
图5 结肠粘膜上皮和腺上皮细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400Fig.
5 Mucosa epithelial cells and glandular epithelial cells in colon were shown GnRHR immunoreactivity.×400
, 百拇医药
图6 a.胃壁肌间神经丛副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
b.大肠肌间神经丛副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
Fig.6 a.Parasympathetic ganglion cells in myenteric plexus in stomach were shown GnRHR immunoreactivity.×400
b.Parasympathetic ganglion cells in myenteric plexus in large intestine were shown GnRHR immunoreactivity.×400
讨 论
GnRH是通过受体的介导而发挥其生理功能的，所以要了解GnRH对某组织细胞是否有功能意义，首先要了解某组织细胞是否含有GnRH的受体。生殖轴的各个器官都含有GnRH受体，GnRH在其受体介导下对生殖器官发挥重要调节作用已被人们所公认[6，7]。但是，消化系统是否含有GnRH受体，GnRH对消化系统是否有功能意义，报道很少。一些学者观察到，仓鼠和人的胰腺癌细胞有GnRH受体[8]，人肝癌细胞系细胞有GnRH特异结合位点[9]，结肠癌细胞[10]含有GnRH受体，提示GnRH参与消化系统肿瘤发生过程的调节。有的学者发现GnRH的类似物对肝癌等多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用[10，11]。我们先前的研究首次观察到，正常大鼠颌下腺和胰含有GnRH受体免疫反应性物质，说明GnRH可能以自分泌或旁分泌的方式对这两个器官的功能进行局部调节[3，4]。本实验发现大鼠消化道从胃到直肠的一些粘膜上皮、腺上皮及肌间神经丛的副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性，这些阳性细胞在消化道的分布与先前研究发现的GnRH免疫反应性细胞及GnRH-mRNA杂交信号细胞的分布相类似，提示大鼠消化道的上述细胞也能自分泌GnRH。胃小凹上皮的主要功能是分泌粘液，胃底腺壁细胞主要功能是产生胃酸，小肠绒毛上皮细胞的主要功能是参与食物消化及营养物质吸收，大肠各段的粘膜上皮及腺上皮主要功能是分泌粘液，肌间神经丛主要参与胃肠蠕动的调节，本实验发现以上细胞都含有GnRH受体，提示GnRH可能对胃肠系统的功能有广泛的调节作用，但是具体对哪些功能起调节作用和起怎样的调节作用，有待功能性实验加以证实。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.39770388)
参考文献
[1]黄威权，张崇理.GnRH免疫活性细胞和神经在大鼠胃肠胰分布的初步研究.解剖学报，1990，21(3)：229
[2]黄威权，向正华，孟琳.促性腺激素释放激素mRNA阳性细胞在大鼠胃肠胰系统的分布.解剖学报，1996，27(2)：189
[3]金花淑，黄威权，张金山，等.大鼠下颌下腺GnRH及GmRH-mRNA的免疫组织化学与原位杂交研究.解剖科学进展，1997，3(3)：234
[4]姬秋和，黄威权，孙岚，等.豚鼠胰腺的胰高血糖素、促性腺释放激素和促性腺释放激素受体的免疫组织化学双标记研究.第四军医大学学报，1998，19(1)：34
, http://www.100md.com
[5]黄威权，孙岚，张崇理.GnRH抗独特型抗体的制备和鉴定.解剖学杂志，1994：17(增刊)：353
[6]Mathialagan N,Rao A J.Gonadotropin-releasing hormone(GnRH)stimulation both secretion and synthesis of human chorionic gonadotropin(HCG)by first trimester human placental mince in vitro.Biochem Int,1986,13(5):757
[7]Harris N,Dutlow C,Eidne K,et al.Gonadotropin-releasing hormone gene expression in MDA-MB-231 and 2R-75-1 breast carcinoma cell lines.Cancer Res,1991,51(10):2577
, 百拇医药
[8]Fkete M,Zalatnai A,Comara-Schally AM,et al.Membrane receptors for peptides in experimental and human pancreatic cancers.Pancreas,1989,4(5):521
[9]Pati D,Habibi H.Inhibition of human hepatocarcionoma cell proliferation by mammalian and fish gonadotropin-releasing hormone.Endocrinology,1995,136(1):75
[10]Nechushtan A,Yarkoni S, Marianovsky I, et al.Adenocarcinoma cells are targeted by the new GnRH-PE66 chimeric toxin through specific gonadotropin-releasing hormone binding sites.J Biol Chem,1997,272(17):11597
[11]Conn PM,Crowley WF.Gonadotropin-releasing hormone and its analogues.N Engl J Med,1991,324(20):93, 百拇医药
单位：第四军医大学组织学胚胎学教研室，西安 710032
关键词：GnRH受体；定位；消化道；免疫组织化学；大鼠
解剖学报990214 【摘要】 目的 探讨大鼠消化道是否存在GnRH受体及其定位。 方法 采用兔抗GnRH抗独特型抗体的免疫组织化学ABC法。 结果 胃底腺壁细胞、胃小凹上皮细胞及肌间神经丛的副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性。三段小肠绒毛上皮细胞、潘氏细胞、十二指肠腺上皮细胞以及小肠肌间神经丛副交感神经节细胞，均呈较强的GnRH受体免疫反应性。在盲肠、结肠和直肠，粘膜上皮细胞、肠腺上皮细胞及肌间神经丛呈GnRH受体免疫反应性。阳性物质均分布在胞质内，胞核呈阴性。 结论 大鼠消化道广泛分布有GnRH受体，其分布模式与先前GnRH及GnRH-mRNA的相类似。说明胃肠道的一些细胞分泌的GnRH可能以自分泌或旁分泌的方式参与消化功能的调节。
, 百拇医药
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF GONADOTROPIN RELE-
ASING HORMONE RECEPTOR IN RAT DIGESTIVE TRACT
Yao Bing,Huang Weiquan△,Sun Lan
(Department of Histology and Embryology of Fourth Militay Medical University Xi'an)
【Abstract】 Objective To study whether gonadotropin releasing hormone receptor(GnRHR) can exist in rat digestive tract and its localization.Method Immunohistochemical ABC method was used to study the localization of GnRHR in rat digestive tract.Results Parietal cells of gastric gland,epithelium of gastric pit and parasympathetic ganglion cells of myenteric plexus show GnRHR immunoreactivity.In small intestine,the villous epithelial cells,Paneth cells and parasympathetic ganglion cells in myenteric plexus show GnRHR immunoreactivity.In caecum,colon,rectum,the surface epithelium,glandular epithelium and parasympatheitc ganglion cells also show GnRHR immunoreactivity.The reactive substance distributes in cytoplasm of all positive cells with negative nuclei.Conclusion The GnRHR is widely distributed in rat digestive tract with distributive pattern similar to those of GnRH and GnRH-mRNA.It suggests that the GnRH may response for modulating the digestive function via autocrine or paracrine mechanism.
, 百拇医药
【Key words】 Gonadotropin releasing hormone receptor(GnRHR); Localization; Digestive tract;Immunohistochemistry;Rat
我们先前的研究已经证实，大鼠消化系统广泛分布有GnRH免疫反应性上皮细胞和神经细胞，而且证实这些细胞同样存在GnRH-mRNA的杂交信号，说明胃、肠、胰能自身合成GnRH[1，2]。随后我们又证实大鼠颌下腺和胰含有GnRH的受体[3，4]。说明它们又是GnRH的靶器官。但是大鼠消化道是否存在GnRH的靶细胞尚未得到证实。本实验采用免疫组织化学ABC法研究了GnRH受体在大鼠胃肠系统的定位，为GnRH对胃肠道可能的功能意义提供形态学依据。
材料和方法
1.试剂
, 百拇医药
GnRH抗独特型抗体由本室自制[5]。链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品。
2.组织材料
雄性SD大鼠5只，在戊巴比妥钠腹腔麻醉下，打开胸腔，经主动脉灌注Bouin液固定20min后，分别取出胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠再置Bouin液中室温固定过夜，按石蜡包埋程序将上述组织包埋于同一蜡块内，切成6μm厚的切片，贴于涂有铬矾明胶的载玻片上。
3.免疫组织化学反应程序
切片经脱蜡水化后，按免疫组织化学ABC法程序进行染色。第1抗体为兔抗GnRH抗独特型抗体(1∶100稀释)，4℃冰箱孵育过夜，第2抗体为生物素标记的羊抗兔IgG抗体(1∶200稀释)，在室温孵育1h。SABC复合物(1∶200稀释)，在室温孵育30min。阴性对照作如下设置：用预先经兔抗GnRH抗体吸收后的第1抗体进行孵育；用正常兔血清取代第1抗体进行孵育。
, 百拇医药
结 果
GnRH受体免疫反应性细胞呈棕色，背底不着色，反差明显，阳性细胞易于识别。两种阴性对照试验均呈阴性反应。
大鼠胃底腺的壁细胞(图1)、胃小凹的上皮细胞(图2)呈GnRH受体强免疫反应性，阳性产物分布于胞质，核呈阴性。三段小肠绒毛上皮细胞均呈GnRH受体免疫反应性，反应强度从绒毛顶端到绒毛基底部呈逐渐减弱的趋势(图3)。潘氏细胞也呈GnRH受体免疫反应性，阳性物质分布在胞质(图4)。十二指肠腺的所有细胞均呈GnRH受体免疫反应性，反应产物分布在胞质，细胞的周边着色较强(图4)。盲肠、结肠和直肠的粘膜上皮及肠腺上皮细胞也都呈GnRH受体免疫反应性，但是反应强度从肠腺的顶端到基底部呈逐渐减弱的趋势，阳性物质也分布在胞质内(图5)。胃、3段小肠及3段大肠的肌间神经丛副交感神经节细胞均呈GnRH受体强免疫反应性，反应产物分布胞质内，胞核为阴性反应(图6)。
, 百拇医药
图1 胃底腺壁细胞呈GnRH受体免疫反应性，阳性物质分布在胞质内，胞核阴性×400
Fig.1 Parietal cells in gastric gland were shown GnRHR immunoreactivity in cytoplasm with negative nuclei.×400Fig.
图2 胃小凹粘膜上皮细胞呈GnRH受体免疫反应性，阳性物质分布在胞质内，胞核阴性 ×400
2 Epithelial cells in gastric pit were shown GnRHR immunoreactivity in cytoplasm with negative nuclei.×400
, 百拇医药
图3 a小肠绒毛上皮细胞和小肠腺潘氏细胞呈GnRH受体免疫反应性，小肠腺其余上皮细胞为GnRH受体阴性反应 ×100Fig.
b.小肠绒毛上皮细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
3 a.Epithelial cells in Villi and paneth cells in small intestinal gland were shown GnRHR immunorecactivity,the other epithelial cells in small intestinal gland were shown negative reactivity.×100
b.Epithelial cells in villi were shown GnRHR immunoreactivity. ×400
图4 a.小肠腺潘氏细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
, 百拇医药
b.十二指肠腺上皮呈GnRH受体免疫反应性 ×400
Fig.4 aPaneth cells in small intestinal gland were shown GnRHR immunoreactivity. ×400
bEpithelium of duodenal gland were shown GnRHR immunoreactivity. ×400
图5 结肠粘膜上皮和腺上皮细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400Fig.
5 Mucosa epithelial cells and glandular epithelial cells in colon were shown GnRHR immunoreactivity.×400
, 百拇医药
图6 a.胃壁肌间神经丛副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
b.大肠肌间神经丛副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性 ×400
Fig.6 a.Parasympathetic ganglion cells in myenteric plexus in stomach were shown GnRHR immunoreactivity.×400
b.Parasympathetic ganglion cells in myenteric plexus in large intestine were shown GnRHR immunoreactivity.×400
讨 论
GnRH是通过受体的介导而发挥其生理功能的，所以要了解GnRH对某组织细胞是否有功能意义，首先要了解某组织细胞是否含有GnRH的受体。生殖轴的各个器官都含有GnRH受体，GnRH在其受体介导下对生殖器官发挥重要调节作用已被人们所公认[6，7]。但是，消化系统是否含有GnRH受体，GnRH对消化系统是否有功能意义，报道很少。一些学者观察到，仓鼠和人的胰腺癌细胞有GnRH受体[8]，人肝癌细胞系细胞有GnRH特异结合位点[9]，结肠癌细胞[10]含有GnRH受体，提示GnRH参与消化系统肿瘤发生过程的调节。有的学者发现GnRH的类似物对肝癌等多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用[10，11]。我们先前的研究首次观察到，正常大鼠颌下腺和胰含有GnRH受体免疫反应性物质，说明GnRH可能以自分泌或旁分泌的方式对这两个器官的功能进行局部调节[3，4]。本实验发现大鼠消化道从胃到直肠的一些粘膜上皮、腺上皮及肌间神经丛的副交感神经节细胞呈GnRH受体免疫反应性，这些阳性细胞在消化道的分布与先前研究发现的GnRH免疫反应性细胞及GnRH-mRNA杂交信号细胞的分布相类似，提示大鼠消化道的上述细胞也能自分泌GnRH。胃小凹上皮的主要功能是分泌粘液，胃底腺壁细胞主要功能是产生胃酸，小肠绒毛上皮细胞的主要功能是参与食物消化及营养物质吸收，大肠各段的粘膜上皮及腺上皮主要功能是分泌粘液，肌间神经丛主要参与胃肠蠕动的调节，本实验发现以上细胞都含有GnRH受体，提示GnRH可能对胃肠系统的功能有广泛的调节作用，但是具体对哪些功能起调节作用和起怎样的调节作用，有待功能性实验加以证实。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.39770388)
参考文献
[1]黄威权，张崇理.GnRH免疫活性细胞和神经在大鼠胃肠胰分布的初步研究.解剖学报，1990，21(3)：229
[2]黄威权，向正华，孟琳.促性腺激素释放激素mRNA阳性细胞在大鼠胃肠胰系统的分布.解剖学报，1996，27(2)：189
[3]金花淑，黄威权，张金山，等.大鼠下颌下腺GnRH及GmRH-mRNA的免疫组织化学与原位杂交研究.解剖科学进展，1997，3(3)：234
[4]姬秋和，黄威权，孙岚，等.豚鼠胰腺的胰高血糖素、促性腺释放激素和促性腺释放激素受体的免疫组织化学双标记研究.第四军医大学学报，1998，19(1)：34
, http://www.100md.com
[5]黄威权，孙岚，张崇理.GnRH抗独特型抗体的制备和鉴定.解剖学杂志，1994：17(增刊)：353
[6]Mathialagan N,Rao A J.Gonadotropin-releasing hormone(GnRH)stimulation both secretion and synthesis of human chorionic gonadotropin(HCG)by first trimester human placental mince in vitro.Biochem Int,1986,13(5):757
[7]Harris N,Dutlow C,Eidne K,et al.Gonadotropin-releasing hormone gene expression in MDA-MB-231 and 2R-75-1 breast carcinoma cell lines.Cancer Res,1991,51(10):2577
, 百拇医药
[8]Fkete M,Zalatnai A,Comara-Schally AM,et al.Membrane receptors for peptides in experimental and human pancreatic cancers.Pancreas,1989,4(5):521
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[10]Nechushtan A,Yarkoni S, Marianovsky I, et al.Adenocarcinoma cells are targeted by the new GnRH-PE66 chimeric toxin through specific gonadotropin-releasing hormone binding sites.J Biol Chem,1997,272(17):11597
[11]Conn PM,Crowley WF.Gonadotropin-releasing hormone and its analogues.N Engl J Med,1991,324(20):93, 百拇医药