镉对大鼠附睾体部的损伤及锌的保护作用
作者：徐晨 李维信
单位：
关键词：镉；锌；硫胺素焦磷酸酶；超微结构；附睾；大鼠
解剖学报990318
【摘要】 目的 探讨镉对大鼠附睾体部的超微结构影响及其作用机理。 方法 单纯小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)及加锌腹腔内注射后，用透射电镜及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学定量分析。 结果 镉注射后4h，主细胞出现轻度超微结构损伤；24h至3d进一步加重；7～15d退变最严重；30～60d基本恢复。TPPase反应产物4h后明显减少，3d后暂时回复，但7～15d再次下降，60d恢复正常。锌保护各组主细胞形态正常，TPPase反应产物较单纯镉组量多，至15d达正常水平。 结论 镉对大鼠附睾体部的损伤较轻；镉对主细胞TPPase活性的影响比对结构的损伤敏感些；早期损伤系镉的直接毒理作用，后期则由于雄激素水平下降加重损伤。
, 百拇医药
THE INJURIOUS EFFECTS OF CADMIUM ON EPIDIDYMAL
CORPUS AND THE PROTECTIVE EFFECTS
OF ZINC IN RATS
Xu ChenΔ Li Weixin
(Laboratory of Electron Microscopy,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing)
【Abstract】 Objective Investigating the effects of cadmium(Cd) on the ultrastructural changes of epididymal corpus and the protective effects of zinc. Methods The animals were injected with small dose of CdCl\-2(2mg/kg body weight) and Cd+Zn.The specimens were studied with transmission electron microscope and quantitative analysis of thiamine pyrophosphatase(TPPase) cytochemistry. Results The injures of principal cells could be detected after 4 hours of Cd treatment and became more serious within 24 hours to 3 days.The degeneration was most prominent within 7～15days, but tended to alleviate after 30～60 days.The TPPase reactive product was reduced markedly on the day 4 after Cd treated.There was a temporary recovery of the TPPase reactive product on day 3 but decreased again within 7～15 days.After 60 days of Cd treatment,the TPPase reactive product returned to normal.The morphology of principal cells of Zn protected groups was almost normal,and the quantity of TPPase reactive product was more than that of Cd treated groups at the same time.On day 15,it returned to normal. Conclusions The injurious effects of cadmium on epididymal corpus were milder;The effects of cadmium on the TPPase activity were more sensitive than the morphological alterations;The earlier damage of epididymal corpus was related to the direct action of cadmium;The decrease of androgen at the later stages might accelerate the degeneration.
, 百拇医药
【Key words】 Cadmium; Zinc; TPPase; Ultrastructure; Epididymis; Rat
附睾在超微结构及功能上存在区域性差异。文献报道镉对附睾损伤的研究集中于附睾头部，多为光镜及生化功能分析方面。有关对血管影响超微结构研究也有报道，有学者认为镉对睾丸及附睾头部的血管亲和性强，而对体、尾部血管不敏感[1]。我室曾报道镉能迅速导致大鼠附睾头部超微结构损伤，锌则有明显的保护作用[2]。有关镉对附睾体部上皮及其管周组织损伤和锌保护作用的超微结构研究尚未见有报道。大鼠附睾体部是以分泌功能为主，其主细胞的高尔基复合体很发达，硫胺素焦磷酸酶(TPPase)是高尔基复合体的标志酶。近年来生化研究表明，附睾体部的分泌物与精子运动有密切的关系[3]。我们用超微结构观察、TPPase电镜细胞化学定量分析等方法，探讨镉对大鼠附睾体部的超微结构损伤和锌的保护作用机制。
, http://www.100md.com 材料和方法
1. 动物分组
成年健康雄性Wistar大鼠48只，体重250～325g，分为实验组和对照组。实验组共36只动物，分为单纯镉组及镉加锌组，每组3只。单纯镉组按2 mg/kg体重剂量，腹腔内一次性注射0.1%氯化镉(生理盐水配制)，分别于注射后1、4、24h及3、7、15、30、60d取材；镉加锌组分3次注射：先注射1%醋酸锌15 mg/kg体重，2h后注射氯化镉(剂量同上)和醋酸锌50 mg/kg体重，再间隔2h注射醋酸锌15 mg/kg，醋酸锌总剂量为80 mg/kg体重，上述处理后1、3、7、15d取材。对照组大鼠每时间段1只，共计12只，腹腔内注射等量生理盐水。上述氯化镉及醋酸锌的注射剂量和方法参照Saksena等[4]报道。以上各组均作常规电镜超微结构及有关电镜细胞化学观察。
2. 常规电镜样品制备
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根据Hermo的大鼠附睾分段法[5]，取右侧附睾体部小块组织，用磷酸缓冲液配制的4%戊二醛作预固定2h，1%四氧化锇作后固定2h(pH7.2～7.4)，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂618浸透包埋。先制作1 μm半薄切片，经1%次甲基蓝-天青Ⅱ染色后定位，再制备超薄切片，经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察。
3. 硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学样品制备
切取左侧附睾体部小块组织，2%戊二醛浸泡固定，制备100 μm切片，置入孵育液[6](主要含硫胺素焦磷酸，氯化锰，硝酸铅等)，37℃孵育1h。对照组孵育液中无硫胺素焦磷酸。经上述处理后，再按常规电镜样品制备，超薄切片，不经铅染色。
4. 附睾体部上皮主细胞TPPase反应产物图像分析
电镜下放大20 000倍，随机拍摄各组动物附睾上皮主细胞核上区高尔基复合体内TPPase反应产物，每组拍摄10张，共计130张照片。运用TECBIAS-6803真彩色医学图像分析系统对所得照片上的TPPase反应产物总目标面积与背景(胞质)面积比值(TA/BA)进行测量。
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所有实验数据均以平均值±标准差(
±s)表示，统计方法采用方差分析，并作多组比较，微机自动处理。
结果
1. 超微结构变化
1.1 对照组：大鼠附睾体部上皮为假复层柱状上皮，由主细胞、基细胞、晕轮细胞、狭窄细胞、顶细胞及亮细胞组成，其中主细胞数量最多，我们主要探讨该细胞的超微结构改变。主细胞具有分泌及吸收功能细胞的超微结构特征。附睾体部主细胞较头部的矮些，细胞顶端有密集排列的细长微绒毛，其间可见一些大小不一的膜性囊泡。细胞间见有连接复合体；核位于细胞的下1/3，其外形多不规则，常染色质丰富，核仁明显；核上区胞质内有多量高尔基复合体，其扁平囊池有8～13层。常见多个高尔基复合体围绕成环形的高尔基区，其内可见丰富的清亮小泡及部分有衣小泡，顶部胞质内还含有少量内体、多泡小体及溶酶体；线粒体散在分布于胞质内；核下区有丰富的粗面内质网及少量脂滴(图1)。上皮外由薄层小管周组织环绕，包括基膜、平滑肌细胞、结缔组织纤维成分及毛细血管。
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1.2 单纯镉注射组：镉注射后1h，上皮细胞及小管周组织结构基本正常。镉注射后4h，主细胞多量线粒体出现髓样结构(图2)：顶部胞质内清亮小泡明显增多；核下区粗面内质网出现轻度脱颗粒现象(图3)；高尔基复合体形态无明显改变。基细胞线粒体内室肿胀；上皮基底部细胞间出现一些大空泡，管周间质水分积聚。平滑肌细胞部分线粒体内室肿胀；毛细血管内皮形态正常，连接完整。附睾管腔内有坏死脱落的上皮细胞。镉注射后24h，上皮细胞间大空泡明显增多(图4)，主细胞部分高尔基复合囊池扩张，出现髓样结构，粗面内质网脱颗粒现象加重，个别主细胞肿胀坏死。间质毛细血管内皮形态正常。镉注射后3d，部分主细胞线粒体肿胀(图5)，胞质内脂滴增多，高尔基复合体形态基本正常。细胞间水肿现象明显减轻。部分狭窄细胞粗面内质网明显扩张。附睾管腔内仍可见多量坏死细胞碎片。镉注射后7d，主细胞顶部微绒毛明显稀少、短小，胞质顶部清亮小泡明显减少，胞质内溶酶体增多。管周基底膜不规则内陷增多。间质毛细血管仍未查见形态改变。管腔内基本无精子，可见大量坏死细胞碎片(图6)。镉注射后15d，主细胞变窄，胞质量减小，胞质内细胞器稀少、高尔基复合体扁平囊池减少，溶酶体增多。基底膜不规则内陷更加明显，管周平滑肌细胞之间可见中性粒细胞浸润(图7)，间质纤维增生。毛细血管形态正常。镉注射后30～60d，上皮主细胞结构基本恢复正常，但胞质内脂滴仍较多；基底膜变平整(图8)，平滑肌细胞内仍见少量髓样结构。
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1.3 镉加锌注射组：注射后24h，主细胞细胞器基本正常，细胞间未见大空泡形成：平滑肌细胞线粒体正常。3d组附睾管腔内未见坏死脱落细胞；7d组见部分主细胞线粒体内室肿胀，顶部微绒毛较正常主细胞稀少；管腔内未见细胞碎片，基底膜平整，毛细血管内皮正常。15d组主细胞结构基本正常(图9)。结果表明锌对附睾体部结构保护良好，与单纯镉组24h及3、7、15d组有明显差异。
2. TPPase变化及反应产物图像分析
电镜下正常大鼠附睾体部上皮主细胞TPPase反应产物满布于高尔基复合体1～3层分泌面扁囊内(图10)。此外，在顶部质膜微绒毛、上皮细胞质膜相邻面以及小管周组织平滑肌细胞周围也可见该酶反应产物沉着。
镉注射后1h，高尔基复合体膜囊内的TPPase反应产物较对照组分布松散，数量减少；4h后，酶反应产物明显减少，甚至消失(图11)。24h后有所增加，至3d后明显恢复，但在注射后7～15d酶反应产物量再次下降。镉注射后30d，酶反应产物量再次回升(图12)，60d后达正常水平。锌保护各组TPPase反应产物分布及含量与对照组无明显差异。
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有关对附睾体部上皮主细胞核上区胞质内TPPase反应产物目标面积/背景面积(TA/BA)的超微酶学图像分析结果见附表。
从TA/BA的比值变化看，镉注射后1h，TPPase反应产物变化不明显(与对照组比较P>0.05)；4h后明显减少，24h稍有回升，但仍较低(与对照组比较P<0.05)；3d后明显增多至正常水平(与对照组比较P>0.05)；7～15d，酶反应产物再次减少(与对照组比较P<0.05)；30～60d恢复正常。
附表 硫胺素焦磷酸酶(TPPase)超微酶学图像分析(±s)
Table Image analysis of TPPase reaction product TA/BA(±s) 给药后时间
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time after
treatment
镉注射组
groups treated
with Cd
锌保护组
groups protected
by Zn
1h
0.071±0.023
-
4h
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0.018±0.007a
-
24h
0.031±0.017a
0.068±0.038
3d
0.080±0.037
0.076±0.032
7d
0.051±0.022a
0.041±0.013
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15d
0.036±0.013a
0.088±0.030c
30d
0.053±0.028
-
60d
0.125±0.062b
-
对照组
control
0.098±0.027
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a.与对照组比较，P<0.05；b.与其他各组比较，P<0.05；c.与对应时间镉注射组比较，P<0.05
a,Compared with control group,P<0.05；b,compared with other groups,P<0.05；c,compared with Cd groups of the same time,P<0.05
讨论
李维信等[7]曾报道小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)腹腔内注射能迅速导致大鼠睾丸超微结构的损伤及锌有明显的保护作用。有关镉对附睾上皮及小管周组织的超微结构影响报道很少。廖晓岗等用此剂量研究镉对大鼠附睾头部的超微结构影响。结果表明，镉注射后30min，头部主细胞已有轻度超微结构改变：3～7d主细胞和管周组织及毛细血管退变加重；15～30d退变有所减轻；60d后主细胞有恢复趋势而管周组织增厚。提出镉对附睾头部早期有直接损伤作用，3～7d后的超微结构退变与雄激素减少及血管损害有关[2]。大鼠附睾头部与体、尾部的血供来源于不同的动、静脉。Sacerdote[1]的研究指出，镉对附睾血供的影响，只导致附睾头部毛细血管通透性增加，而体、尾部毛细血管则无明显改变。鉴于附睾头部与体部的血供以及生化功能上皆有明显的差异，本研究亦采用小剂量镉注射法，观察分析镉对大鼠附睾体部的超微结构影响。结果表明，镉对附睾体部主细胞超微结构有损伤，但较附睾头部的轻。从损伤出现时间看，镉注射后30min，附睾头部主细胞已出现超微结构改变[2]，而附睾体部主细胞在镉注射4h才出现轻度超微结构改变，损伤明显延后于附睾头部；从早期损伤的超微结构表现来看，附睾头部主细胞表现为线粒体明显肿胀，粗面内质网及高尔基复合体囊泡均显著扩张[2]，而在此时间段体部的主细胞损伤除线粒体及粗面内质网呈现超微结构改变外，高尔基复合体则无明显改变，说明后者的损伤明显轻于前者。镉注射后3～7d，附睾头部毛细血管内皮细胞核异染色质凝集，线粒体肿胀，部分内皮断裂[2]。本研究在附睾体部各时间段均未查见毛细血管的超微结构改变。提示镉对附睾不同部位毛细血管损伤的差异，可能是导致附睾头、体部主细胞损伤程度明显不同的原因之一。有关阉割实验的研究表明，大鼠阉割后30min血清睾丸酮含量就已经降至最低点，但2～3d后附睾头部上皮主细胞才出现超微结构改变，主要表现为粗面内质网减少、高尔基复合体退变等[8]。徐晨等[9]在镉对大鼠精囊腺的超微结构损伤研究中表明，镉注射后7～15d，血清睾丸酮的含量才降至基线水平，而镉对附睾体部主细胞的损伤在注射后4h已出现，明显早于雄激素效应。另外，实验证明镉能够导致附睾LPO含量升高，造成膜结构的损伤[2]，此与附睾体部主细胞膜性成分出现的损伤表现相同。由此提示，我们所见附睾体部主细胞的早期的超微结构损伤系镉的直接毒性作用所致，而7～15d后超微结构退变加重与雄激素水平的下降有关。
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附睾体部上皮主细胞的功能主要是分泌功能。Naz等[3]的研究也表明，一些与精子成熟及精子运动有关的因子如：肝细胞生长因子、分散因子、精浆聚集素等主要由附睾体部上皮主细胞合成、分泌。TPPase与高尔基复合体内糖基化过程中的糖基转移酶活性有密切关系。本研究采用超微酶学定量分析结果表明，镉处理后1h，TPPase反应产物就开始减少，4h后减少至最低点，此改变比超微结构变化明显，提示镉对附睾上皮主细胞TPPase活性的影响早于对结构的损伤。Tam等[10]的研究表明，豚鼠阉割后6周，精囊腺及前列腺上皮主细胞高尔基复合体内的TPPase反应产物减少，提示雄激素下降可影响该酶的活性，但此效应出现较缓慢。由此也可提示本研究早期所见TPPase的变化可归因于镉的直接毒性作用，后期的变化趋势则与睾丸酮的变化同步，其中镉注射后3d TPPase反应产物出现暂时回复，此现象与我们在精囊腺的研究中看到的镉处理后3d睾丸酮水平出现暂时回升相平行[9]，说明此回复与雄激素的影响有关，其具体细节有待进一步研究。
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锌是维持哺乳动物生殖器官功能不可缺少的微量元素。锌可以通过同型置换方式将机体内与蛋白质结合的镉置换出来，从而起到对镉损伤的拮抗作用[7]。本研究结果表明，锌对体部附睾上皮结构有明显的保护作用；对于TPPase活性的保护远期效果好于近期效应，这可能是因为TPPase在早期对镉较敏感，结合较多而受抑制较大有关。
图版说明
图1 对照组大鼠附睾管体部假复层柱状上皮。P.主细胞；A.顶细胞；Go.高尔基复合体；Mi.线粒体； Mb.多泡小体；Lu.管腔 ×4 500
图2 镉注射后4h，主细胞内髓样结构(↑)增多，N.主细胞核 ×2 625
图3 镉注射后4h，主细胞粗面内质网(RER)脱颗粒。RER表面附着稀少的核蛋白体(↑) ×2 500
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图4 镉注射后24h，上皮基底部细胞间水分积聚(Δ)。N.主细胞核；B.基细胞 ×3 000
图5 镉注射后3d，主细胞部分线粒体肿胀(Mi)。 ×6 000
图6 镉注射后7d，附睾管腔内可见大量坏死细胞碎片(↑)。P.主细胞 ×2 625
图7 镉注射后15d，附睾管上皮基底膜不规则内凸(↑)，小管周组织内见多量中性粒细胞浸润(↑)。N.主细胞核 ×2 625
图8 镉注射后60d，附睾管上皮基底膜基本恢复平整(BM)。N.主细胞核 ×2 625
图9 镉锌联合注射后15d，主细胞结构基本正常。Lu.管腔；N.主细胞核 ×3 725
图10 TPPase细胞化学，对照组大鼠附睾上皮TPPase反应产物(↑)丰富 ×20 000
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图11 TPPase细胞化学，镉注射后4h，TPPase反应产物明显稀少(↑) ×20 000
图12 TPPase细胞化学，镉注射后30d，主细胞高尔基复合体内TPPase反应产物接近正常(↑) ×20 000
Explanation of figures
Fig.1 The pseudostratified epithelium from ductus epididymal corpus of the control group rats.P,principal cell;A,apical cell;Go,Golgi complex;Mi,mitochondria; Mv,multivesicular body; Lu,lumen of ductus epididymis. ×4 500
Fig.2 Myelin figures(↑)in principal cells increased after 4h of cadmium treament.N,nuclei of principal cell. ×2 625
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Fig.3 Degranulation of rough endoplasmic reticulum(RER).Sparse distribution of ribosome attached the RER membrane(↑). ×2 500
Fig.4 Water accumulated in basal parts of the epididymal epithelium(Δ) and intercellular space after 24h of cadmium treatment.N,nuclei; B,basal cell. ×3 000
Fig.5 Parts of mitochondria swelled after 3 days of cadmium treatment(Mi). ×6 000
Fig.6 A lot of fragments of degenarated cells in the lumen of ductus epididymis 7 days after cadmium treated(↑).P,principal cell. ×2 625
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Fig.7 The basement membrane of principal cells irregular invagination after 15 days of cadmium treatment(↑).Many neutrophilic granulocytes under the basement membrane (↑).N,nuclei of principal cell. ×2 625
Fig.8 The basement membrane tended to normal after 60 days of cadmium treated (BM).N,nuclei of principal cell. ×2 625
Fig.9 The appearance of principal cells was nearly normal after 15 days of cadmium add zinc treatment.Lu,lumen;N,nuclei of principal cells. ×3 750
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Fig.10 TPPase cytochemistry.TPPase reactive product was rich in Golgi complexes of principal cells in control group rats(↑). ×20 000
Fig.11 TPPase cytochemistry.TPPase reactive product in Golgi complexes of principal cells reduced prominently after 4h of cadmium treated(↑). ×20 000
Fig.12 TPPase cytochemistry.TPPase reactive product in Golgi complexes of principal cells increased markedly after 30 days of cadmium treated(↑). ×20 000
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△ Laboratory of Electron Microscopy,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016,China
作者单位:徐晨 李维信(重庆医科大学电子显微镜室，生殖医学超微结构实验室，重庆 400016)
参考文献
[1]Sacerdote FL,Cavicchia JC.Ultrastructural effects of cadmium on the rat epididymis.Int J Androl,1983,6(6):533
[2]廖晓岗，李维信.镉对大鼠附睾的损伤及锌和维生素E的保护作用.解剖学报，1997，28(3)：319
[3]Naz RK,Joseph A,Lee Y,et al.Expression of scatter factor/hepatocyte growth factor is regionally correlated with the initiation of sperm motility in murine male genital:is scatter factor/hepatocyte growth factor involved in initiation of sperm motility?Mol Reprod Dev,1994,38(4):431
, 百拇医药
[4]Saksena S,White MJ,Mertzluff J,et al.Prevention of cadmium-induced sterility by zine in the male rat.Contraception,1983,27(5):521
[5]Hermo L,Oko R,Robaire B.Epithelial cells of the epididymis show regional variation with respect to the secretion of endocytosis of immobilin as revealed by light and electron microscope immunocytochemistry.Anat Rec,1992,232(2):202
[6]Novikoff AB,Goldfischer S.Nucleoside-diphosphatase activity on the Golgi apparatus and its usefulness for cytological studied.Proc Natl Acad Sci USA,1961,47(6):802
, http://www.100md.com
[7]李维信，廖晓岗，唐宜，等.镉对大鼠睾丸的损伤及锌保护作用的超微结构研究.解剖学报，1988，19(1)：72
[8]Moore HDM,Bedford JM.Short-term effects of androgen withdrawl on the structure of different epithelial cells in the rat epididymis.Anat Rec,1979,193(2):293
[9]徐晨，李维信.镉对大鼠精囊腺超微结构及硫胺素焦磷酸酶细胞化学和血清睾酮含量的影响.解剖学报，1997，28(3)：312
[10]Tam CC,Wong YC.Thiamine pyrophosphatase activity in secretory cells of the lateral prostate and seminal vesicle of normal and castrated guinea pigs and castrates treated with oestradiol.Histochem J,1993,25(1):77
收稿1998-08 修回1999-02, 百拇医药
单位：
关键词：镉；锌；硫胺素焦磷酸酶；超微结构；附睾；大鼠
解剖学报990318
【摘要】 目的 探讨镉对大鼠附睾体部的超微结构影响及其作用机理。 方法 单纯小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)及加锌腹腔内注射后，用透射电镜及硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学定量分析。 结果 镉注射后4h，主细胞出现轻度超微结构损伤；24h至3d进一步加重；7～15d退变最严重；30～60d基本恢复。TPPase反应产物4h后明显减少，3d后暂时回复，但7～15d再次下降，60d恢复正常。锌保护各组主细胞形态正常，TPPase反应产物较单纯镉组量多，至15d达正常水平。 结论 镉对大鼠附睾体部的损伤较轻；镉对主细胞TPPase活性的影响比对结构的损伤敏感些；早期损伤系镉的直接毒理作用，后期则由于雄激素水平下降加重损伤。
, 百拇医药
THE INJURIOUS EFFECTS OF CADMIUM ON EPIDIDYMAL
CORPUS AND THE PROTECTIVE EFFECTS
OF ZINC IN RATS
Xu ChenΔ Li Weixin
(Laboratory of Electron Microscopy,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing)
【Abstract】 Objective Investigating the effects of cadmium(Cd) on the ultrastructural changes of epididymal corpus and the protective effects of zinc. Methods The animals were injected with small dose of CdCl\-2(2mg/kg body weight) and Cd+Zn.The specimens were studied with transmission electron microscope and quantitative analysis of thiamine pyrophosphatase(TPPase) cytochemistry. Results The injures of principal cells could be detected after 4 hours of Cd treatment and became more serious within 24 hours to 3 days.The degeneration was most prominent within 7～15days, but tended to alleviate after 30～60 days.The TPPase reactive product was reduced markedly on the day 4 after Cd treated.There was a temporary recovery of the TPPase reactive product on day 3 but decreased again within 7～15 days.After 60 days of Cd treatment,the TPPase reactive product returned to normal.The morphology of principal cells of Zn protected groups was almost normal,and the quantity of TPPase reactive product was more than that of Cd treated groups at the same time.On day 15,it returned to normal. Conclusions The injurious effects of cadmium on epididymal corpus were milder;The effects of cadmium on the TPPase activity were more sensitive than the morphological alterations;The earlier damage of epididymal corpus was related to the direct action of cadmium;The decrease of androgen at the later stages might accelerate the degeneration.
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【Key words】 Cadmium; Zinc; TPPase; Ultrastructure; Epididymis; Rat
附睾在超微结构及功能上存在区域性差异。文献报道镉对附睾损伤的研究集中于附睾头部，多为光镜及生化功能分析方面。有关对血管影响超微结构研究也有报道，有学者认为镉对睾丸及附睾头部的血管亲和性强，而对体、尾部血管不敏感[1]。我室曾报道镉能迅速导致大鼠附睾头部超微结构损伤，锌则有明显的保护作用[2]。有关镉对附睾体部上皮及其管周组织损伤和锌保护作用的超微结构研究尚未见有报道。大鼠附睾体部是以分泌功能为主，其主细胞的高尔基复合体很发达，硫胺素焦磷酸酶(TPPase)是高尔基复合体的标志酶。近年来生化研究表明，附睾体部的分泌物与精子运动有密切的关系[3]。我们用超微结构观察、TPPase电镜细胞化学定量分析等方法，探讨镉对大鼠附睾体部的超微结构损伤和锌的保护作用机制。
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1. 动物分组
成年健康雄性Wistar大鼠48只，体重250～325g，分为实验组和对照组。实验组共36只动物，分为单纯镉组及镉加锌组，每组3只。单纯镉组按2 mg/kg体重剂量，腹腔内一次性注射0.1%氯化镉(生理盐水配制)，分别于注射后1、4、24h及3、7、15、30、60d取材；镉加锌组分3次注射：先注射1%醋酸锌15 mg/kg体重，2h后注射氯化镉(剂量同上)和醋酸锌50 mg/kg体重，再间隔2h注射醋酸锌15 mg/kg，醋酸锌总剂量为80 mg/kg体重，上述处理后1、3、7、15d取材。对照组大鼠每时间段1只，共计12只，腹腔内注射等量生理盐水。上述氯化镉及醋酸锌的注射剂量和方法参照Saksena等[4]报道。以上各组均作常规电镜超微结构及有关电镜细胞化学观察。
2. 常规电镜样品制备
, 百拇医药
根据Hermo的大鼠附睾分段法[5]，取右侧附睾体部小块组织，用磷酸缓冲液配制的4%戊二醛作预固定2h，1%四氧化锇作后固定2h(pH7.2～7.4)，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂618浸透包埋。先制作1 μm半薄切片，经1%次甲基蓝-天青Ⅱ染色后定位，再制备超薄切片，经醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，H-600型透射电镜观察。
3. 硫胺素焦磷酸酶(TPPase)电镜细胞化学样品制备
切取左侧附睾体部小块组织，2%戊二醛浸泡固定，制备100 μm切片，置入孵育液[6](主要含硫胺素焦磷酸，氯化锰，硝酸铅等)，37℃孵育1h。对照组孵育液中无硫胺素焦磷酸。经上述处理后，再按常规电镜样品制备，超薄切片，不经铅染色。
4. 附睾体部上皮主细胞TPPase反应产物图像分析
电镜下放大20 000倍，随机拍摄各组动物附睾上皮主细胞核上区高尔基复合体内TPPase反应产物，每组拍摄10张，共计130张照片。运用TECBIAS-6803真彩色医学图像分析系统对所得照片上的TPPase反应产物总目标面积与背景(胞质)面积比值(TA/BA)进行测量。
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所有实验数据均以平均值±标准差(
±s)表示，统计方法采用方差分析，并作多组比较，微机自动处理。结果
1. 超微结构变化
1.1 对照组：大鼠附睾体部上皮为假复层柱状上皮，由主细胞、基细胞、晕轮细胞、狭窄细胞、顶细胞及亮细胞组成，其中主细胞数量最多，我们主要探讨该细胞的超微结构改变。主细胞具有分泌及吸收功能细胞的超微结构特征。附睾体部主细胞较头部的矮些，细胞顶端有密集排列的细长微绒毛，其间可见一些大小不一的膜性囊泡。细胞间见有连接复合体；核位于细胞的下1/3，其外形多不规则，常染色质丰富，核仁明显；核上区胞质内有多量高尔基复合体，其扁平囊池有8～13层。常见多个高尔基复合体围绕成环形的高尔基区，其内可见丰富的清亮小泡及部分有衣小泡，顶部胞质内还含有少量内体、多泡小体及溶酶体；线粒体散在分布于胞质内；核下区有丰富的粗面内质网及少量脂滴(图1)。上皮外由薄层小管周组织环绕，包括基膜、平滑肌细胞、结缔组织纤维成分及毛细血管。
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1.2 单纯镉注射组：镉注射后1h，上皮细胞及小管周组织结构基本正常。镉注射后4h，主细胞多量线粒体出现髓样结构(图2)：顶部胞质内清亮小泡明显增多；核下区粗面内质网出现轻度脱颗粒现象(图3)；高尔基复合体形态无明显改变。基细胞线粒体内室肿胀；上皮基底部细胞间出现一些大空泡，管周间质水分积聚。平滑肌细胞部分线粒体内室肿胀；毛细血管内皮形态正常，连接完整。附睾管腔内有坏死脱落的上皮细胞。镉注射后24h，上皮细胞间大空泡明显增多(图4)，主细胞部分高尔基复合囊池扩张，出现髓样结构，粗面内质网脱颗粒现象加重，个别主细胞肿胀坏死。间质毛细血管内皮形态正常。镉注射后3d，部分主细胞线粒体肿胀(图5)，胞质内脂滴增多，高尔基复合体形态基本正常。细胞间水肿现象明显减轻。部分狭窄细胞粗面内质网明显扩张。附睾管腔内仍可见多量坏死细胞碎片。镉注射后7d，主细胞顶部微绒毛明显稀少、短小，胞质顶部清亮小泡明显减少，胞质内溶酶体增多。管周基底膜不规则内陷增多。间质毛细血管仍未查见形态改变。管腔内基本无精子，可见大量坏死细胞碎片(图6)。镉注射后15d，主细胞变窄，胞质量减小，胞质内细胞器稀少、高尔基复合体扁平囊池减少，溶酶体增多。基底膜不规则内陷更加明显，管周平滑肌细胞之间可见中性粒细胞浸润(图7)，间质纤维增生。毛细血管形态正常。镉注射后30～60d，上皮主细胞结构基本恢复正常，但胞质内脂滴仍较多；基底膜变平整(图8)，平滑肌细胞内仍见少量髓样结构。
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1.3 镉加锌注射组：注射后24h，主细胞细胞器基本正常，细胞间未见大空泡形成：平滑肌细胞线粒体正常。3d组附睾管腔内未见坏死脱落细胞；7d组见部分主细胞线粒体内室肿胀，顶部微绒毛较正常主细胞稀少；管腔内未见细胞碎片，基底膜平整，毛细血管内皮正常。15d组主细胞结构基本正常(图9)。结果表明锌对附睾体部结构保护良好，与单纯镉组24h及3、7、15d组有明显差异。
2. TPPase变化及反应产物图像分析
电镜下正常大鼠附睾体部上皮主细胞TPPase反应产物满布于高尔基复合体1～3层分泌面扁囊内(图10)。此外，在顶部质膜微绒毛、上皮细胞质膜相邻面以及小管周组织平滑肌细胞周围也可见该酶反应产物沉着。
镉注射后1h，高尔基复合体膜囊内的TPPase反应产物较对照组分布松散，数量减少；4h后，酶反应产物明显减少，甚至消失(图11)。24h后有所增加，至3d后明显恢复，但在注射后7～15d酶反应产物量再次下降。镉注射后30d，酶反应产物量再次回升(图12)，60d后达正常水平。锌保护各组TPPase反应产物分布及含量与对照组无明显差异。
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有关对附睾体部上皮主细胞核上区胞质内TPPase反应产物目标面积/背景面积(TA/BA)的超微酶学图像分析结果见附表。
从TA/BA的比值变化看，镉注射后1h，TPPase反应产物变化不明显(与对照组比较P>0.05)；4h后明显减少，24h稍有回升，但仍较低(与对照组比较P<0.05)；3d后明显增多至正常水平(与对照组比较P>0.05)；7～15d，酶反应产物再次减少(与对照组比较P<0.05)；30～60d恢复正常。
附表 硫胺素焦磷酸酶(TPPase)超微酶学图像分析(
±s)Table Image analysis of TPPase reaction product TA/BA(
±s) 给药后时间, http://www.100md.com
time after
treatment
镉注射组
groups treated
with Cd
锌保护组
groups protected
by Zn
1h
0.071±0.023
-
4h
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0.018±0.007a
-
24h
0.031±0.017a
0.068±0.038
3d
0.080±0.037
0.076±0.032
7d
0.051±0.022a
0.041±0.013
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15d
0.036±0.013a
0.088±0.030c
30d
0.053±0.028
-
60d
0.125±0.062b
-
对照组
control
0.098±0.027
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a.与对照组比较，P<0.05；b.与其他各组比较，P<0.05；c.与对应时间镉注射组比较，P<0.05
a,Compared with control group,P<0.05；b,compared with other groups,P<0.05；c,compared with Cd groups of the same time,P<0.05
讨论
李维信等[7]曾报道小剂量氯化镉(2 mg/kg体重)腹腔内注射能迅速导致大鼠睾丸超微结构的损伤及锌有明显的保护作用。有关镉对附睾上皮及小管周组织的超微结构影响报道很少。廖晓岗等用此剂量研究镉对大鼠附睾头部的超微结构影响。结果表明，镉注射后30min，头部主细胞已有轻度超微结构改变：3～7d主细胞和管周组织及毛细血管退变加重；15～30d退变有所减轻；60d后主细胞有恢复趋势而管周组织增厚。提出镉对附睾头部早期有直接损伤作用，3～7d后的超微结构退变与雄激素减少及血管损害有关[2]。大鼠附睾头部与体、尾部的血供来源于不同的动、静脉。Sacerdote[1]的研究指出，镉对附睾血供的影响，只导致附睾头部毛细血管通透性增加，而体、尾部毛细血管则无明显改变。鉴于附睾头部与体部的血供以及生化功能上皆有明显的差异，本研究亦采用小剂量镉注射法，观察分析镉对大鼠附睾体部的超微结构影响。结果表明，镉对附睾体部主细胞超微结构有损伤，但较附睾头部的轻。从损伤出现时间看，镉注射后30min，附睾头部主细胞已出现超微结构改变[2]，而附睾体部主细胞在镉注射4h才出现轻度超微结构改变，损伤明显延后于附睾头部；从早期损伤的超微结构表现来看，附睾头部主细胞表现为线粒体明显肿胀，粗面内质网及高尔基复合体囊泡均显著扩张[2]，而在此时间段体部的主细胞损伤除线粒体及粗面内质网呈现超微结构改变外，高尔基复合体则无明显改变，说明后者的损伤明显轻于前者。镉注射后3～7d，附睾头部毛细血管内皮细胞核异染色质凝集，线粒体肿胀，部分内皮断裂[2]。本研究在附睾体部各时间段均未查见毛细血管的超微结构改变。提示镉对附睾不同部位毛细血管损伤的差异，可能是导致附睾头、体部主细胞损伤程度明显不同的原因之一。有关阉割实验的研究表明，大鼠阉割后30min血清睾丸酮含量就已经降至最低点，但2～3d后附睾头部上皮主细胞才出现超微结构改变，主要表现为粗面内质网减少、高尔基复合体退变等[8]。徐晨等[9]在镉对大鼠精囊腺的超微结构损伤研究中表明，镉注射后7～15d，血清睾丸酮的含量才降至基线水平，而镉对附睾体部主细胞的损伤在注射后4h已出现，明显早于雄激素效应。另外，实验证明镉能够导致附睾LPO含量升高，造成膜结构的损伤[2]，此与附睾体部主细胞膜性成分出现的损伤表现相同。由此提示，我们所见附睾体部主细胞的早期的超微结构损伤系镉的直接毒性作用所致，而7～15d后超微结构退变加重与雄激素水平的下降有关。
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附睾体部上皮主细胞的功能主要是分泌功能。Naz等[3]的研究也表明，一些与精子成熟及精子运动有关的因子如：肝细胞生长因子、分散因子、精浆聚集素等主要由附睾体部上皮主细胞合成、分泌。TPPase与高尔基复合体内糖基化过程中的糖基转移酶活性有密切关系。本研究采用超微酶学定量分析结果表明，镉处理后1h，TPPase反应产物就开始减少，4h后减少至最低点，此改变比超微结构变化明显，提示镉对附睾上皮主细胞TPPase活性的影响早于对结构的损伤。Tam等[10]的研究表明，豚鼠阉割后6周，精囊腺及前列腺上皮主细胞高尔基复合体内的TPPase反应产物减少，提示雄激素下降可影响该酶的活性，但此效应出现较缓慢。由此也可提示本研究早期所见TPPase的变化可归因于镉的直接毒性作用，后期的变化趋势则与睾丸酮的变化同步，其中镉注射后3d TPPase反应产物出现暂时回复，此现象与我们在精囊腺的研究中看到的镉处理后3d睾丸酮水平出现暂时回升相平行[9]，说明此回复与雄激素的影响有关，其具体细节有待进一步研究。
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锌是维持哺乳动物生殖器官功能不可缺少的微量元素。锌可以通过同型置换方式将机体内与蛋白质结合的镉置换出来，从而起到对镉损伤的拮抗作用[7]。本研究结果表明，锌对体部附睾上皮结构有明显的保护作用；对于TPPase活性的保护远期效果好于近期效应，这可能是因为TPPase在早期对镉较敏感，结合较多而受抑制较大有关。
图版说明
图1 对照组大鼠附睾管体部假复层柱状上皮。P.主细胞；A.顶细胞；Go.高尔基复合体；Mi.线粒体； Mb.多泡小体；Lu.管腔 ×4 500
图2 镉注射后4h，主细胞内髓样结构(↑)增多，N.主细胞核 ×2 625
图3 镉注射后4h，主细胞粗面内质网(RER)脱颗粒。RER表面附着稀少的核蛋白体(↑) ×2 500
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图4 镉注射后24h，上皮基底部细胞间水分积聚(Δ)。N.主细胞核；B.基细胞 ×3 000
图5 镉注射后3d，主细胞部分线粒体肿胀(Mi)。 ×6 000
图6 镉注射后7d，附睾管腔内可见大量坏死细胞碎片(↑)。P.主细胞 ×2 625
图7 镉注射后15d，附睾管上皮基底膜不规则内凸(↑)，小管周组织内见多量中性粒细胞浸润(↑)。N.主细胞核 ×2 625
图8 镉注射后60d，附睾管上皮基底膜基本恢复平整(BM)。N.主细胞核 ×2 625
图9 镉锌联合注射后15d，主细胞结构基本正常。Lu.管腔；N.主细胞核 ×3 725
图10 TPPase细胞化学，对照组大鼠附睾上皮TPPase反应产物(↑)丰富 ×20 000
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图11 TPPase细胞化学，镉注射后4h，TPPase反应产物明显稀少(↑) ×20 000
图12 TPPase细胞化学，镉注射后30d，主细胞高尔基复合体内TPPase反应产物接近正常(↑) ×20 000
Explanation of figures
Fig.1 The pseudostratified epithelium from ductus epididymal corpus of the control group rats.P,principal cell;A,apical cell;Go,Golgi complex;Mi,mitochondria; Mv,multivesicular body; Lu,lumen of ductus epididymis. ×4 500
Fig.2 Myelin figures(↑)in principal cells increased after 4h of cadmium treament.N,nuclei of principal cell. ×2 625
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Fig.3 Degranulation of rough endoplasmic reticulum(RER).Sparse distribution of ribosome attached the RER membrane(↑). ×2 500
Fig.4 Water accumulated in basal parts of the epididymal epithelium(Δ) and intercellular space after 24h of cadmium treatment.N,nuclei; B,basal cell. ×3 000
Fig.5 Parts of mitochondria swelled after 3 days of cadmium treatment(Mi). ×6 000
Fig.6 A lot of fragments of degenarated cells in the lumen of ductus epididymis 7 days after cadmium treated(↑).P,principal cell. ×2 625
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Fig.7 The basement membrane of principal cells irregular invagination after 15 days of cadmium treatment(↑).Many neutrophilic granulocytes under the basement membrane (↑).N,nuclei of principal cell. ×2 625
Fig.8 The basement membrane tended to normal after 60 days of cadmium treated (BM).N,nuclei of principal cell. ×2 625
Fig.9 The appearance of principal cells was nearly normal after 15 days of cadmium add zinc treatment.Lu,lumen;N,nuclei of principal cells. ×3 750
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Fig.10 TPPase cytochemistry.TPPase reactive product was rich in Golgi complexes of principal cells in control group rats(↑). ×20 000
Fig.11 TPPase cytochemistry.TPPase reactive product in Golgi complexes of principal cells reduced prominently after 4h of cadmium treated(↑). ×20 000
Fig.12 TPPase cytochemistry.TPPase reactive product in Golgi complexes of principal cells increased markedly after 30 days of cadmium treated(↑). ×20 000
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△ Laboratory of Electron Microscopy,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016,China
作者单位:徐晨 李维信(重庆医科大学电子显微镜室，生殖医学超微结构实验室，重庆 400016)
参考文献
[1]Sacerdote FL,Cavicchia JC.Ultrastructural effects of cadmium on the rat epididymis.Int J Androl,1983,6(6):533
[2]廖晓岗，李维信.镉对大鼠附睾的损伤及锌和维生素E的保护作用.解剖学报，1997，28(3)：319
[3]Naz RK,Joseph A,Lee Y,et al.Expression of scatter factor/hepatocyte growth factor is regionally correlated with the initiation of sperm motility in murine male genital:is scatter factor/hepatocyte growth factor involved in initiation of sperm motility?Mol Reprod Dev,1994,38(4):431
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[4]Saksena S,White MJ,Mertzluff J,et al.Prevention of cadmium-induced sterility by zine in the male rat.Contraception,1983,27(5):521
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[6]Novikoff AB,Goldfischer S.Nucleoside-diphosphatase activity on the Golgi apparatus and its usefulness for cytological studied.Proc Natl Acad Sci USA,1961,47(6):802
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[8]Moore HDM,Bedford JM.Short-term effects of androgen withdrawl on the structure of different epithelial cells in the rat epididymis.Anat Rec,1979,193(2):293
[9]徐晨，李维信.镉对大鼠精囊腺超微结构及硫胺素焦磷酸酶细胞化学和血清睾酮含量的影响.解剖学报，1997，28(3)：312
[10]Tam CC,Wong YC.Thiamine pyrophosphatase activity in secretory cells of the lateral prostate and seminal vesicle of normal and castrated guinea pigs and castrates treated with oestradiol.Histochem J,1993,25(1):77
收稿1998-08 修回1999-02, 百拇医药