鸡胚房间隔与第二孔的形态发生*
作者：谢小薰 陈维平 徐锦雯
单位：谢小薰 陈维平 徐锦雯(广西医科大学组织学胚胎学教研室，南宁 530021)
关键词：第二孔；房间隔；扫描电镜；形态发生；鸡胚
解剖学报990317
【摘要】 目的 探讨心脏房间隔与第二孔形态发生机制。 方法 按Hamburger和Hamilton分期法，选用第20～26期鸡胚，用显微解剖术和扫描电镜方法，观察房间隔与第二孔的形态发生过程。 结果 房间隔尚未与心内膜垫融合前，房间隔中央部上皮处出现小孔，小孔随着长突起状细胞的出现而增多。筛状的第二孔形成后，长突起状细胞减少并消失。 结论 第二孔形成不是被动破裂的过程，在形成的早期可能与长突起状细胞有密切关系。
MORPHOGENESIS OF ATRIAL SEPTUM AND
, 百拇医药
FORAMINA SECUNDA IN CHICK EMBRYO
Xie Xiaoxun, Cheng Weiping, Xu Jingwen
(Department of Histology and Embyology,Guangxi Medical University,Nanning)
【Abstract】 Objective To study the morphogenesis of atrial septum and foramina secunda.Methods Based on Hamburger and Hamilton staging, chick embryos were selected.The formation of atrial septun and foramina secunda were observed with microdissection and SEM.Result Before the fusion of the atrial septum with the endocardial cushion,some small perforations on the epithelia appeared in the central part of atrial septum.These perforations increased with appearance of the long process cells.When the formation of sieve foramina secunda,the cells with long processes were decreased and gradually disappeared.Conclusion The formation of foramina secunda is not a process of passive breaking.The cells with long process might be closely related with the early formation of foramina secunda.
, 百拇医药
【Key words】 Foramina secunda; Atrial septum; Scanning electron microscopy; Morphogenesis; Chick embryo
房间隔缺损是常见的先天性心脏病之一。从胚胎发生学角度看，一般认为，房间隔缺损的原因与第二孔形成部位的异常或过大有密切关系，但目前对第二孔形成的机制尚未完全清楚。研究第二孔的形成机制，无论是对胚胎的正常发育，还是对先天性心脏畸形的发生都有着重要意义。本研究利用显微解剖术，在扫描电镜下观察了鸡胚房间隔的形成，特别是第二孔的发生。
材料和方法
1. 取材、固定
莱亨鸡受精卵常规孵育，按Hamburger-Hamilton分期法[1]，选取第20～26期发育正常的鸡胚(孵育时间为3～5d)，每期5个。置胚胎于Locke液中，在体视显微镜下剪去胚头，剖开心包腔。用毛细玻璃管插入颈部或肝血管内，将Locke液缓慢地注入心腔。当心脏由红色变为白色时，心脏内血液已被冲洗干净。然后将胚胎移入Asami液中，使心脏停跳于舒张期。立即将胚胎置于0.2 mol/L二甲胂酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛液(pH7)中，4℃固定12～24h。
, 百拇医药
2. 扫描电镜标本制备
将固定后的标本进行逐级酒精脱水， 醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥后，按胚胎心脏显微解剖法[2]，在体视显微镜下，用钨针、发针剖开心房并暴露房间隔。将干燥后的胚胎用导电银固定于铜台上，喷金，T-300扫描电镜下观察，摄片。加速电压为20kV。
结果
第20期鸡胚，原始心房头端中央处长出一镰状隔膜，即房间隔(图1)。随后房间隔不断地向心内膜垫方向生长，至第22期鸡胚，房间隔第一孔仍然较大，但在房间隔中央部的心内膜表面出现许多小孔，同时一些上皮细胞略凸向表面，并有少数短小的突起(图2a,2b)；至第25期，虽然房间隔尚未完全与心内膜垫融合，但在低倍镜下已可见到房间隔中央部有几个小穿孔形成，即刚形成的第二孔(图3a)；此时房间隔心内膜上皮呈现出两类形态明显不同的细胞。一类明显凸于表面，有许多长突起，突起彼此相连。另一类细胞呈扁平状，细胞上可见许多大小不等的小孔，在长突起细胞周围尤为明显(3b)。
, http://www.100md.com
第26期鸡胚，房间隔与心内膜垫融合，第一孔消失。房间隔中央部的小孔增多并融合为较大的孔，使第二孔呈筛状(图4a)。此时房间隔心内膜上皮处的长突起状细胞明显减少，并逐渐消失，在小孔周围常见一些固缩的细胞，明显凸于表面，并逐渐与上皮分离，脱落(图4b)。
讨论
关于房间隔第二孔的形成，目前仍有争议。较为普遍的观点认为[3]，随着房间隔向心内膜垫方向生长，第一孔逐渐缩小，使右心房压力不断升高，最终导致房间隔中央部薄弱处破裂，形成第二孔。这一观点认为血流压力对第二孔的形成起了重要作用，第二孔的形成是一种被动破裂的过程。另一种观点则认为，第二孔形成是由于隔本身不完全生长形成的，即在心房分隔过程中，第二孔始终存在[3]。上述观点均基于传统的连续切片光镜观察提出，有一定的局限性。
本研究通过显微解剖结合扫描电镜观察，发现在房间隔向心内膜垫方向生长过程中，当第一孔还相当大时，房间隔上的心内膜就已出现许多小穿孔，表明第二孔已开始出现。显然，这一现象不支持血流压力致使房间隔被动破裂形成第二孔的观点。我们的观察亦未显示出房间隔的不完全生长。值得注意的是，房间隔中央部的心内膜上皮细胞起初较平整，细胞无明显突起；随后一部分细胞明显凸于表面，出现许多细长的突起。在这些细胞的周围为一种形态完全不同的扁平状上皮细胞，无长突起，但可见到许多小孔，这些小孔随着长突起细胞增多及突起相互连接而增多，当第二孔呈筛状后，长突起状细胞又渐减少并消失。据此我们认为，房间隔心内膜上皮处出现的长突起细胞值得注意，这种细胞可能通过细胞突起彼此连接，或分泌一些细胞因子类物质，起着“挖掘”作用，导致第二孔的形成。心内膜上皮在特定时期和特定部位出现这种“挖掘”作用，在心脏发生过程中并不罕见，如心室小梁形成的早期，半月瓣Valsalva窦的发生中就有类似现象[4，5]。由此可见，心内膜上这种特殊的细胞与胚胎时期心脏许多结构的形成有密切关系；这种细胞形态上似吞噬细胞，它的来源目前还未确定，虽有文献报道，孵育4d的鸡胚血循环中出现吞噬细胞也支持这一观点[6]，但亦不能排除由内皮细胞分化而来。
, 百拇医药
筛状的第二孔形成后，在筛孔周围可见到一些上皮细胞明显凸于表面，胞体逐渐缩小，与周围上皮细胞分离、脱落，虽然这一过程似细胞凋亡的形态学变化[7，8]，但在房间隔第二孔形成过程中，具体哪一阶段出现细胞凋亡，脱落细胞的前身是哪类细胞，筛状的第二孔形成后，其小孔进一步的融合扩大是否与细胞凋亡有关等问题，都有待深入研究。
综上所述，我们认为，房间隔第二孔的形成不完全是一种被动破裂的过程，至少在第二孔形成的早期，可能与一种特殊细胞的主动挖掘有关，而这种细胞异常增多或功能过度活跃，可能是造成房间隔缺损的原因之一。
汕头大学医学院中心实验室霍霞指导电镜图片的观察，谨致谢意。
图版说明
图1 第20期鸡胚，心房左侧壁已剖开，★示刚形成的房间隔，SEM ×100
, 百拇医药
图2a 第22期鸡胚，示房间隔；↑示第一孔，SEM ×100
图2b 为图2a房间隔中央部局部放大，↑示心内膜上出现许多小孔，SEM ×3 500
图3a 第24期鸡胚，心房左侧壁已剖开，★示明显缩小的第一孔，↑示形成中的第二孔，SEM ×75
图3b 为图3a房间隔中央部局部放大，↑示心内膜上皮一些细胞明显凸向表面，并有长突起 ×3 500
图4a 第26期鸡胚，心房左侧壁已剖开，第一孔消失，↑示筛状的第二孔已完全形成，SEM ×50
图4b 为图4a局部放大，↑示一些上皮细胞凸向表面，逐渐固缩并与周围细胞分离、脱落；示已形成的小孔，SEM ×2 000
Explanation of figures
, 百拇医药
Fig.1 Chick embryo of stage 20.The wall of left atrium had been removed.The atrial septum(★)was begun to form .SEM×100
Fig.2a Chick embryo of stage 22.The atrial septum(*)and the foramina primum (↑) were present.SEM×100
Fig.2b A local magnification of the central part of atrial septum at Fig.2a.There were lot of perforations on the endocardium(↑).SEM×3 500
Fig.3a Chick embryo of stage 24.The wall of left atrium had been removed.The foramina primum(★) was obviously small,and the foramina secunda(↑) were developing.SEM×75
, 百拇医药
Fig.3b A local magnification of the central part of atrial septum at Fig.3a.There were some projecting cells(*) with the long processes on the epithelium of endocardium.SEM×3 500
Fig.4a Chick embryo of stage 26.The wall of left atrium had been removed.The foramina primum disappeared.The sieve foramina secunda(↑) were completely formed.SEM×50
Fig.4b A local magnification of Fig.4a some of epithelial cells(↑),which gradually became pyknocytes,projected on the surface,and were detached and isolated form other epithelial cells around them.The formed foramina(*) were presented.SEM×2 000
, http://www.100md.com
* 广西壮族自治区科委青年科学自然基金资助课题(No.9811001)
参考文献
[1]Hamburger V,Hamilton HL.A series of normal stages in the development of chick embryo.J Morph,1951,88(1):49
[2]谢小薰，杨永瑾.胚胎心脏显微解剖及扫描电镜标本制作方法.解剖学杂志，1994，17(4)：376
[3]Langman J.Medical Embryology.ed 3.Baltimore:Williams and Wilkins Company,1975:212-217
[4]Steding G,Seidle W.Contribution to the development of the heart.Part I.Normal development.Thorac Cardiovasc Surg,1988,28(6):386
, http://www.100md.com
[5]谢小薰，杨永瑾，方中古.鸡胚半月瓣Valsalva窦的形态发生.解剖学报，1993，24(1)：109
[6]Sunders,J W.Death in embryonic systems.Science,1966,15(3749):604
[7]成军.程序性细胞死亡与疾病.第1版，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：1～3
[8]霍霞，黄行许，朴英杰.胚胎发育与细胞凋亡.解剖科学进展，1996，2(3)：212
收稿1998-08 修回1999-02, 百拇医药
单位：谢小薰 陈维平 徐锦雯(广西医科大学组织学胚胎学教研室，南宁 530021)
关键词：第二孔；房间隔；扫描电镜；形态发生；鸡胚
解剖学报990317
【摘要】 目的 探讨心脏房间隔与第二孔形态发生机制。 方法 按Hamburger和Hamilton分期法，选用第20～26期鸡胚，用显微解剖术和扫描电镜方法，观察房间隔与第二孔的形态发生过程。 结果 房间隔尚未与心内膜垫融合前，房间隔中央部上皮处出现小孔，小孔随着长突起状细胞的出现而增多。筛状的第二孔形成后，长突起状细胞减少并消失。 结论 第二孔形成不是被动破裂的过程，在形成的早期可能与长突起状细胞有密切关系。
MORPHOGENESIS OF ATRIAL SEPTUM AND
, 百拇医药
FORAMINA SECUNDA IN CHICK EMBRYO
Xie Xiaoxun, Cheng Weiping, Xu Jingwen
(Department of Histology and Embyology,Guangxi Medical University,Nanning)
【Abstract】 Objective To study the morphogenesis of atrial septum and foramina secunda.Methods Based on Hamburger and Hamilton staging, chick embryos were selected.The formation of atrial septun and foramina secunda were observed with microdissection and SEM.Result Before the fusion of the atrial septum with the endocardial cushion,some small perforations on the epithelia appeared in the central part of atrial septum.These perforations increased with appearance of the long process cells.When the formation of sieve foramina secunda,the cells with long processes were decreased and gradually disappeared.Conclusion The formation of foramina secunda is not a process of passive breaking.The cells with long process might be closely related with the early formation of foramina secunda.
, 百拇医药
【Key words】 Foramina secunda; Atrial septum; Scanning electron microscopy; Morphogenesis; Chick embryo
房间隔缺损是常见的先天性心脏病之一。从胚胎发生学角度看，一般认为，房间隔缺损的原因与第二孔形成部位的异常或过大有密切关系，但目前对第二孔形成的机制尚未完全清楚。研究第二孔的形成机制，无论是对胚胎的正常发育，还是对先天性心脏畸形的发生都有着重要意义。本研究利用显微解剖术，在扫描电镜下观察了鸡胚房间隔的形成，特别是第二孔的发生。
材料和方法
1. 取材、固定
莱亨鸡受精卵常规孵育，按Hamburger-Hamilton分期法[1]，选取第20～26期发育正常的鸡胚(孵育时间为3～5d)，每期5个。置胚胎于Locke液中，在体视显微镜下剪去胚头，剖开心包腔。用毛细玻璃管插入颈部或肝血管内，将Locke液缓慢地注入心腔。当心脏由红色变为白色时，心脏内血液已被冲洗干净。然后将胚胎移入Asami液中，使心脏停跳于舒张期。立即将胚胎置于0.2 mol/L二甲胂酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛液(pH7)中，4℃固定12～24h。
, 百拇医药
2. 扫描电镜标本制备
将固定后的标本进行逐级酒精脱水， 醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥后，按胚胎心脏显微解剖法[2]，在体视显微镜下，用钨针、发针剖开心房并暴露房间隔。将干燥后的胚胎用导电银固定于铜台上，喷金，T-300扫描电镜下观察，摄片。加速电压为20kV。
结果
第20期鸡胚，原始心房头端中央处长出一镰状隔膜，即房间隔(图1)。随后房间隔不断地向心内膜垫方向生长，至第22期鸡胚，房间隔第一孔仍然较大，但在房间隔中央部的心内膜表面出现许多小孔，同时一些上皮细胞略凸向表面，并有少数短小的突起(图2a,2b)；至第25期，虽然房间隔尚未完全与心内膜垫融合，但在低倍镜下已可见到房间隔中央部有几个小穿孔形成，即刚形成的第二孔(图3a)；此时房间隔心内膜上皮呈现出两类形态明显不同的细胞。一类明显凸于表面，有许多长突起，突起彼此相连。另一类细胞呈扁平状，细胞上可见许多大小不等的小孔，在长突起细胞周围尤为明显(3b)。
, http://www.100md.com
第26期鸡胚，房间隔与心内膜垫融合，第一孔消失。房间隔中央部的小孔增多并融合为较大的孔，使第二孔呈筛状(图4a)。此时房间隔心内膜上皮处的长突起状细胞明显减少，并逐渐消失，在小孔周围常见一些固缩的细胞，明显凸于表面，并逐渐与上皮分离，脱落(图4b)。
讨论
关于房间隔第二孔的形成，目前仍有争议。较为普遍的观点认为[3]，随着房间隔向心内膜垫方向生长，第一孔逐渐缩小，使右心房压力不断升高，最终导致房间隔中央部薄弱处破裂，形成第二孔。这一观点认为血流压力对第二孔的形成起了重要作用，第二孔的形成是一种被动破裂的过程。另一种观点则认为，第二孔形成是由于隔本身不完全生长形成的，即在心房分隔过程中，第二孔始终存在[3]。上述观点均基于传统的连续切片光镜观察提出，有一定的局限性。
本研究通过显微解剖结合扫描电镜观察，发现在房间隔向心内膜垫方向生长过程中，当第一孔还相当大时，房间隔上的心内膜就已出现许多小穿孔，表明第二孔已开始出现。显然，这一现象不支持血流压力致使房间隔被动破裂形成第二孔的观点。我们的观察亦未显示出房间隔的不完全生长。值得注意的是，房间隔中央部的心内膜上皮细胞起初较平整，细胞无明显突起；随后一部分细胞明显凸于表面，出现许多细长的突起。在这些细胞的周围为一种形态完全不同的扁平状上皮细胞，无长突起，但可见到许多小孔，这些小孔随着长突起细胞增多及突起相互连接而增多，当第二孔呈筛状后，长突起状细胞又渐减少并消失。据此我们认为，房间隔心内膜上皮处出现的长突起细胞值得注意，这种细胞可能通过细胞突起彼此连接，或分泌一些细胞因子类物质，起着“挖掘”作用，导致第二孔的形成。心内膜上皮在特定时期和特定部位出现这种“挖掘”作用，在心脏发生过程中并不罕见，如心室小梁形成的早期，半月瓣Valsalva窦的发生中就有类似现象[4，5]。由此可见，心内膜上这种特殊的细胞与胚胎时期心脏许多结构的形成有密切关系；这种细胞形态上似吞噬细胞，它的来源目前还未确定，虽有文献报道，孵育4d的鸡胚血循环中出现吞噬细胞也支持这一观点[6]，但亦不能排除由内皮细胞分化而来。
, 百拇医药
筛状的第二孔形成后，在筛孔周围可见到一些上皮细胞明显凸于表面，胞体逐渐缩小，与周围上皮细胞分离、脱落，虽然这一过程似细胞凋亡的形态学变化[7，8]，但在房间隔第二孔形成过程中，具体哪一阶段出现细胞凋亡，脱落细胞的前身是哪类细胞，筛状的第二孔形成后，其小孔进一步的融合扩大是否与细胞凋亡有关等问题，都有待深入研究。
综上所述，我们认为，房间隔第二孔的形成不完全是一种被动破裂的过程，至少在第二孔形成的早期，可能与一种特殊细胞的主动挖掘有关，而这种细胞异常增多或功能过度活跃，可能是造成房间隔缺损的原因之一。
汕头大学医学院中心实验室霍霞指导电镜图片的观察，谨致谢意。
图版说明
图1 第20期鸡胚，心房左侧壁已剖开，★示刚形成的房间隔，SEM ×100
, 百拇医药
图2a 第22期鸡胚，示房间隔；↑示第一孔，SEM ×100
图2b 为图2a房间隔中央部局部放大，↑示心内膜上出现许多小孔，SEM ×3 500
图3a 第24期鸡胚，心房左侧壁已剖开，★示明显缩小的第一孔，↑示形成中的第二孔，SEM ×75
图3b 为图3a房间隔中央部局部放大，↑示心内膜上皮一些细胞明显凸向表面，并有长突起 ×3 500
图4a 第26期鸡胚，心房左侧壁已剖开，第一孔消失，↑示筛状的第二孔已完全形成，SEM ×50
图4b 为图4a局部放大，↑示一些上皮细胞凸向表面，逐渐固缩并与周围细胞分离、脱落；示已形成的小孔，SEM ×2 000
Explanation of figures
, 百拇医药
Fig.1 Chick embryo of stage 20.The wall of left atrium had been removed.The atrial septum(★)was begun to form .SEM×100
Fig.2a Chick embryo of stage 22.The atrial septum(*)and the foramina primum (↑) were present.SEM×100
Fig.2b A local magnification of the central part of atrial septum at Fig.2a.There were lot of perforations on the endocardium(↑).SEM×3 500
Fig.3a Chick embryo of stage 24.The wall of left atrium had been removed.The foramina primum(★) was obviously small,and the foramina secunda(↑) were developing.SEM×75
, 百拇医药
Fig.3b A local magnification of the central part of atrial septum at Fig.3a.There were some projecting cells(*) with the long processes on the epithelium of endocardium.SEM×3 500
Fig.4a Chick embryo of stage 26.The wall of left atrium had been removed.The foramina primum disappeared.The sieve foramina secunda(↑) were completely formed.SEM×50
Fig.4b A local magnification of Fig.4a some of epithelial cells(↑),which gradually became pyknocytes,projected on the surface,and were detached and isolated form other epithelial cells around them.The formed foramina(*) were presented.SEM×2 000
, http://www.100md.com
* 广西壮族自治区科委青年科学自然基金资助课题(No.9811001)
参考文献
[1]Hamburger V,Hamilton HL.A series of normal stages in the development of chick embryo.J Morph,1951,88(1):49
[2]谢小薰，杨永瑾.胚胎心脏显微解剖及扫描电镜标本制作方法.解剖学杂志，1994，17(4)：376
[3]Langman J.Medical Embryology.ed 3.Baltimore:Williams and Wilkins Company,1975:212-217
[4]Steding G,Seidle W.Contribution to the development of the heart.Part I.Normal development.Thorac Cardiovasc Surg,1988,28(6):386
, http://www.100md.com
[5]谢小薰，杨永瑾，方中古.鸡胚半月瓣Valsalva窦的形态发生.解剖学报，1993，24(1)：109
[6]Sunders,J W.Death in embryonic systems.Science,1966,15(3749):604
[7]成军.程序性细胞死亡与疾病.第1版，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：1～3
[8]霍霞，黄行许，朴英杰.胚胎发育与细胞凋亡.解剖科学进展，1996，2(3)：212
收稿1998-08 修回1999-02, 百拇医药