SD乳鼠窦房结细胞原代分散培养的光电镜研究
作者：张炎 凌凤东
单位：张炎凌凤东(西安医科大学解剖学教研室，西安 710061)
关键词：窦房结；细胞原代培养；细胞光电镜结构；新生SD大鼠
解剖学报990312
【摘要】 目的 探索体外窦房结细胞原代纯化培养方法，观察培养的窦房结细胞生长状况及光电镜形态学特征。 方法 (1)用差速贴壁和Brdu处理作细胞培养；(2)观察和记录各类型培养细胞的生长状况；(3)HE染色和Heidenhain苏木素染色；(4)透射电镜观察。 结果 在培养的窦房结细胞中，至少有3种自发性收缩细胞及少量的星状和不规则细胞。收缩性细胞中，最多的是多边形细胞，其次是梭形，最少的是三角形细胞，且多边形细胞收缩频率最低(75.27±1.73/min
±s)，细胞染色和电镜观察结果显示：多边形细胞的细胞器相似于原位窦房结组织中的起搏(P)细胞，梭形细胞相似于移行(T)细胞，P细胞核旁较易见到电子致密颗粒和中心粒，也常见细胞核染色体正处于细胞周期的分裂期的前、中期。 结论 多边形细胞很幼稚，具有不断分裂增埴的能力。
, 百拇医药
LIGNT AND ELECTRON MICROSCOPIC STUDY ON ISOLATED
SINOATRIAL NODE CELLS IN PRIMARY DISSOCIATED
CULTURE FROM THE NEONATAL SD RATS
Zhang Yan, Ling FengdongΔ
(Department of Anatomy,Xi'an Medical University,Xi'an)
【Abstract】 Objective The purpose of the study was to develop primary pure-culture of the sinoatrial node(SAN) cells in vitro and to investigate the growth conditions,morphological criteria of light and eletron microscopy of cultured cells. Methods (1)Cell culture with differential attachment technique and BrdU-treated.(2)Observing and recording the growth condition of cultured cells of each type.(3)HE staining and Heidenhain hematoxylin staining for facilitating morphologic identification of cultured nodal cells.(4)TEM observation for demonstrating of cultured cells of SAN.Results Among the cultured cells of SAN,at least three distinctly different types of spontaneously contracting cells were observed,as well as a few stellar and irregular cells.The greatest proportion of contracting cells were relatively large polygonal cells and the second group of cells was those with spindle configuration and the last group of cells was triangle cell.The mean frequency(75.27±1.73/min±s)of spontaneous contraction of the polygonal cells was lowest in all contraction cells.The results of cells staining and ultrastructure observation in cultured cells indicated that the characteristic of polygonal and spindle cells were separately similar to these in P and T cells of SAN.The centrosome and a few electron dense granules near the nuclei were easily seen in the cytoplasm of polygonal cells.The chromosome appeared in nuclei of polygonal cells,and the cells was just at the prophase or metaphase in cell cycle. Conclusion The polygonal cells were infantile and proliferating cells.
, 百拇医药
【Key words】 SAN; Cell primary culture; Cell structure of light microscopy and TEM; Neonatal SD rat
迄今，在窦房结形态与功能的研究中，所用材料主要是在体组织、立体小标本及微小标本，近几年也有用酶消化窦房结组织块而得到的细胞团或单细胞[1，2]，它们数量有限，也不能传代，且操作过程中酶的消化及机械作用可使细胞活力大大减弱。在对窦房结单细胞作直接电生理和药理学研究时，体外培养的结窦房单细胞被认为是较前述更为理想的材料，但迄今国内尚未做此工作，国外也少有报道[3]。我们在新生SD大鼠窦房结的光、电镜定位研究的基础上[4，5]，取材做窦房结细胞原代分散培养，旨为窦房结形态和功能的研究提供有活力的数量充足的单细胞材料。
材料和方法
, 百拇医药 1. 材料
新生第4d SD大鼠360只，9次实验，每次40只，雌雄不拘。
2. 方法
2.1 窦房结细胞纯化培养：(1)将4d龄乳鼠体表用70%酒精擦洗后带入净化工作台内(苏州，YJ-875)，在大视场工作仪下，将鼠呈仰卧位固定，用碘酊、酒精消毒胸部皮肤，剪开胸前壁，暴露正搏动的心脏及前(上)腔静脉，于此静脉跟部取0.8×0.8×1mm组织块[5]；(2)按上述方法取材，将从各鼠剪下的组织块收集于盛有RRMI 1640培养液(美国，PRMI 1640)的培养皿中洗涤2次，再将组织充分剪碎，加入0.06%胰蛋白酶(美国Sigma,Difco 1∶250)，用尖嘴吸管轻轻吹打约2min，移至离心管，于37℃水浴中消化10min，自然沉淀，弃去上清，再加10～15ml 0.06%胰蛋白酶，再消化10min。多次消化，直至组织块成分散单细胞为止；(3)从第二次消化开始，每次消化后的细胞悬液吹打约2min，自然沉淀，吸取上清，并将上清分配至离心管中，每支离心管再加入等量1640液消除胰蛋白酶的消化作用，吹打，再离心1次，弃去上清，将沉淀的单细胞收集到有1640液的容器中；(4)将步骤(2)(3)后收集的各离心管中的单细胞沉淀集中制成单细胞悬液，加入10%～15%新生牛血清、1%～2%双抗，充分吹打、混悬后，分别吸入到预先置有玻片(1×1cm)的6孔或12孔培养板中，经红血球计数盘计数，最终细胞接种密度为1～10×155个/ml。另取细胞悬液0.9ml、0.4%台盼蓝0.1ml混匀，滴1滴于血球计数盘上数100个细胞，计算活细胞约达92%以上(活细胞不染色，死细胞被染成蓝色)；(5)将有活细胞的培养容器置于37℃、5%CO\-2培养箱中(日本，BNA-311D培养箱)，培养1.5～2h后，采用差速贴壁分离技术[6]，用吸管轻轻吸取培养孔中细胞悬液(因成纤维细胞贴壁快)，收集至另一容器中，按每2.7ml培养细胞悬液加1mmol/L 5-溴脱氧尿核苷(BrdU)(美国，Sigma)0.3ml，使BrdU终浓度为0.1mmol/L (BrdU主要抑制成纤维细胞生长)，继续培养，按每1～2d换液1次，前4次换液都使用BrdU。
, 百拇医药
2.2 对照培养：(1)常规培养 即窦房结细胞培养时不用差速贴壁技术，也不用BrdU处理培养液；(2)差速贴壁培养 即窦房结细胞培养时用贴壁分离技术但不用BrdU处理培养液；(3)窦房结细胞培养时，也分别取心房及心室肌组织作同步培养，以与窦房结细胞作鉴别。
2.3 培养细胞染色：HE染色和Heidenhain铁矾苏木素染色，步骤基本参照窦房结原位组织的染色步骤[4]。其中铁矾苏木素染色用于显示细胞内肌原纤维的有无和多寡。
2.4 透射电镜实验：倒置显微镜下选定培养板中长有细胞(5d)的盖玻片，取出后TBS洗涤10min×3次，入多聚甲醛-戊二醛固定液，室温下30min，PBS洗10min×3次，再入1%OsO\-4后固定，4℃、1h，上升酒精脱水，环氧丙烷10min，继之用环氧丙烷包埋剂、Epon-812 1∶1混合液于37℃下浸透过夜，将灌有Epon-812的胶囊倒扣于盖玻片上，烤箱内聚合60℃、40～72h；酒精加热聚合好的盖玻片，从盖玻片小心掰下胶囊，行超薄切片；醋酸铀饱和溶液(50%酒精配制)10～20min；双蒸水充分冲洗，枸橼酸铅10min，双蒸水冲洗。
, 百拇医药
2.5 观察和摄片：对培养活细胞用恒温相差倒置显微镜(日本，Olympus)观察；细胞收缩频率用手控计数器计数。对细胞染色片用AO光镜(美国产)观察，并用目镜测微尺(上海产)测量。对超薄切片用透射电镜(日本，H-600)观察。
2.6 统计分析：实验数据以(±
)和(±s)表示。
结果
1. 窦房结细胞纯化培养(图1，2)
接种后，细胞为清亮的圆形或短棒状，最迟约在8h后开始贴壁生长，胞体逐渐增大，1d后可见单个细胞搏动，2d后可见细胞相互接触，不断分裂，增殖成片层状。活细胞主要有以下几种形态：(1)胞体较大的多边形细胞；(2)胞体中等的三角形细胞；(3)胞体较前两者小的梭形细胞；(4)少量胞体最大的星状多突细胞；(5)胞体最小的不规则形细胞。多边形细胞最多(表1)。此外，还可见单个细胞自发性搏动(2d后)，此搏动常见于(2)、(3)及(1)，而在(4)和(5)几乎未见搏动(表2)。
, 百拇医药
表1 各类培养细胞的分布
Table 1 Distribution of cultured cells of each type
窦房结
SAN
心房
atrium
心室
ventricle
多边形细胞
polygon cell
+++
, 百拇医药 +/++
+
三角形细胞
triangle cell
+/++
+++
+++
梭形细胞
spindle cell
+/++
++
++
星形细胞
, 百拇医药
stellar cell
+
+
+
不规则形细胞
irregular cell
+
+
+
注：(+)稀少 (++)较多 (+++)很多
Note:(+)sparse (++)scattering (+++)many
表2 各类单个细胞自发性收缩频率
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Table 2 Spontaneous contraction frequence of isolated cells of each type 细胞类型
cell type
范围
range±s
n
多边形
polygon
60～120/min
75.27±1.73/min
, 百拇医药 63
梭形
spindle
80～160/min
109.98±1.78/min*
80
三角形
triangle
90～230/min
168.11±2.56/min*Δ
100
*与多边形细胞比较P<0.01(as compared to polygon cells,P<0.01)
, 百拇医药
Δ与梭形细胞比较P<0.01(as compared to spindle cells,P<0.01)
2. 对照培养
对照培养(包括常规培养、差速贴壁培养)及纯化培养(差速贴壁+BrdU处理)各自的细胞生长情况见表3。纯化培养的细胞，虽贴壁、出现细胞搏动和片层的时间均较迟，但星形细胞大大减少。在心房及心室肌培养细胞中，三角形细胞最多(表1)，且均可见单个细胞自发性搏动及常见到合体搏动(30～120/min)。
表3 3种培养技术细胞生长状况
Table 3 Cell growth status cultured with three different techniques 技术techniques
开始贴壁
, 百拇医药
attachment
开始收缩
contraction
开始成片
in flakes
生长状况
condition
星形细胞
stellar cells
(1)
1～2(h)
6～8(h)
, 百拇医药
24～28(h)
很好
very good
很多
many
(2)
4～6(h)
10～15(h)
36～38(h)
好
good
较多
scattering
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(3)
8～10(h)
24～28(h)
48～46(h)
好
good
稀少
a few
注：(1)常规培养 (2)差速贴壁培养 (3)差速贴壁+BrdU处理
Note：(1)common cell culture; (2)culturel with differential attachment technique; (3) (2)+Brdu
, 百拇医药
3. 细胞染色
3.1 HE染色：与倒置相差显微镜下所见的几类活细胞形态基本一致。各类细胞染色和形态特征见表4，图3。
表4 各类培养细胞HE染色光镜特征的比较(μm,±s,n=60)
Table 4 Comparison of HE staining characteristics of cultured cell
of each type by light microscopy observation(μm,±s,n=6) 细胞类型
type
, 百拇医药
胞体长径
lenth
胞体宽径
breadth
核
nucleus
突起
projection
胞浆染色
staining
多边型
polygon
66.02±12.02
, http://www.100md.com
53.40±8.85
大
large
2～4
淡
pale
梭形
spindle
85.09±14.75
24.39±10.69
小
small
2
, 百拇医药
较深
comparatively deep
三角形
tringle
83.72±16.06
32.17±9.88
中等
middle
3～4
深
deep
星形
, 百拇医药 stellar
73.92±10.29
55.06±8.15
大
large
>4
淡
pale
不规则形
irregular
45.88±6.51
41.68±6.31
, 百拇医药 小
small
2～3
很深
quite deep
其中多边形细胞核大而圆，约为胞体的1/2，核仁2～4个。
3.2 Heidenhain铁矾苏木素染色：多边形细胞胞浆染色浅，肌原纤维不丰富，呈同心圆状围绕核附近。核大而圆，可有双核，易见核内染色体常处于细胞分裂期的前、中期(图5，6)。梭形细胞胞浆染色稍深，肌原纤维丰富，位于核附近或两端。三角形细胞染色深，肌原纤维很丰富，位于核附近或两端，与细胞长轴平行(图4)。星形多突细胞和不规则细胞均无明显肌原纤维。
4. 透射电镜观察(图7，8)
, http://www.100md.com
多边形细胞核大，核仁明显，线粒体、内质网、高尔基复合体不发达，糖原颗粒丰富，核旁电子致密颗粒少，肌原纤维不发达，仅可见少量成束肌微丝围绕核周分布，未见完整肌节及Z线，在核附近易见中心粒。梭形细胞线粒体较多，嵴密，肌原纤维束分布于核附近或两端，比多边形细胞的丰富，可见不完整肌节，偶可见Z线。三角形细胞的细胞器均较发达，核旁有较多电子致密颗粒，肌原纤维丰富，一般与细胞长轴平行，可一直伸达细胞末端，有完整的肌节、Z线。星形细胞突起多，核大而圆，核仁明显，核旁未见电子致密颗粒和肌原纤维。该细胞附近有一些明暗相间横纹的胶原纤维。
讨论1. 方法学探讨
分散培养的窦房结细胞可广范应用于窦房结的形态与功能研究。迄今仅国外少有开展窦房结细胞培养，究其原因，可能是由于结的位置、大小、构造在不同动物之间有较大差异，且又有增龄性变化[7]，给准确取材带来一定困难，还可能由于对窦房结组织细胞光、电镜研究尚未有成熟、完整的资料，使对培养细胞的形态学鉴定无统一的参照标准。Marvin等[3]做新生鼠窦房结细胞培养所取材部位实际是仅依据人的窦房结位置，而我们在对新生乳鼠窦房结作了较详细的光、电镜形态学定位研究后[4，5]，再取材做本实验。我们所确定的新生乳鼠窦房结位于前(上)腔静脉根部(静脉入口以上)，与Marvin等取材位置(上腔静脉与右心房交界处的右心房壁上)并不一致，哪一种取材准确，尚待进一步电生理和药理学实验证实。根据窦房结细胞在胚胎期与普通心房、心室肌细胞共同起源于原始、幼稚、未分化的心肌干细胞[8]，它们之间有结构、代谢方面的某些共同点，我们与Marvin等作窦房结细胞培养时，都参照了普通心肌细胞培养技术。有文献报道做心肌细胞培养时用差速贴壁分离技术并结合用BrdU抑制非心肌细胞，可使心肌细胞比例提高到95%[6]。Marvin等的实验未采用上述技术，因此他们观察到许多非心肌细胞(如成纤维细胞、内皮细胞等)。本实验做了3种培养方法的比较，结果表明，差速贴壁方法加BrdU处理是比较好的纯化培养方法，可大大减少成纤维细胞，使所培养的窦房结细胞具有应用价值。本实验观察到，用差速贴壁及BrdU处理后，培养的窦房结细胞中星形多突细胞大大减少，而此细胞几乎无搏动，电镜下亦未见有肌原纤维，因此我们推测这种细胞也许就是成纤维细胞。
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2. 培养的窦房结细胞形态学鉴别
对大鼠原位窦房结的形态学观察得到，窦房结主要有3种细胞，即起搏(P)细胞(pacemaker cell,P-cell)、移行(T)细胞(transitional cell,T-cell)及在结边缘少量普通心房肌细胞[4，5，9]，其中P细胞最幼稚，肌原纤维最不发达，普通心房肌细胞肌原纤维最发达，T细胞的肌原纤维介于两者之间。本实验所做窦房结体外培养细胞中，能收缩搏动的有多边形、梭形和三角形细胞，它们各自的肌原纤维发达程度分别与原位组织的P、T细胞及普通心房肌细胞相似[4，5]，因此我们推测，多边形细胞可能是起搏P细胞，梭形细胞可能是T细胞，三角形细胞可能是普通心房肌细胞。生理学认为，肌细胞的收缩频率和强弱与肌原纤维的多少与发达程度有关，多边形细胞肌原纤维最少、收缩装置发育最差，因此该细胞的搏动频率最慢，我们的这一推测与Marvin等的结论有差异，他们认为窦房结细胞是一种体积最小、收缩频率(185±8/min)最快的梭形细胞[3]。总之，对培养窦房结细胞的形态学鉴别还未取得一致，我们的推测是否客观，还需进一步功能研究的证实。当然，我们也应该认识到，培养细胞不可避免地存在一些局限性，如体外培养的窦房结细胞失去了体内正常的细胞比例及相互关系，对培养细胞的形态有一定的影响等。
, http://www.100md.com
图1 培养窦房结(SAN)细胞(4d)，细胞已长成片 ×66
图2 示培养窦房结细胞几种类型(5d)，多边形细胞(Pol)，梭形细胞(spin)，三角形细胞(T ri)
×132
图3 示培养窦房结细胞几种类型(5d)，培养的窦房结细胞以多边形细胞(Pol)为主，培养的 心
房肌(A)、心室肌(V)细胞以三角形细胞(Tri)为主.Spin:梭形细胞 A：心房 V：心室 H E染色
×66
图4 示培养的三角形细胞中丰富的肌原纤维呈纵行排列，Heidenhain苏木素染色 ×198
图5 示培养的窦房结多边形细胞核内染色体处于细胞分裂期的前(↑)期，Heidenhain苏木 素染
, http://www.100md.com
色 ×198
图6 示培养的窦房结多边形细胞核内染色体处于细胞分裂期的中期(↑)，Heidenhain苏木 素染
色 ×198
图7，8 示培养的窦房结多边形细胞核(N)旁单个或成对中心粒(C)，一些电子致密颗粒(DG) ，丰富的糖原颗粒(↑)，透射电镜 图7 ×25 000；图8 ×40 000
Fig.1 The cultured cells (4th day) in flakes of SAN ×66
Fig.2 The types of cultured cells(5th day) of SAN.Polygon cell(Pol);Triangle ce
lls(Tri);Spindle cells(Spin) ×132
, 百拇医药
Fig.3 The greatest proportion of cells in cultured cells(5th day)of SAN were po
lygon cells(Pol) and in cultured cells of atrium and ventricle were triangle cel
ls(Tri).A:atrium;V:ventricle;HE ×66
Fig.4 It showed much more myofibrils which tend to be longitudinally arrayed in
cultured triangle cell.Heidenhain hematoxylin staining ×198
, 百拇医药
Fig.5 The cultured polygon cells of SAN.The chromosome appearance in nucleus wa s
just at the prophase(↑) of division stage of cells cycle.Heidenhain hematoxyl in
staining ×198
Fig.6 The cultured polygon cells of SAN.The chromosome appearance in nucleus wa s
just at the metaphase(↑) of division stage of cells cycle.Heidenhain hematoxy lin
, 百拇医药
staining ×198
Fig.7,8 The cultured polygon cells of SAN.The single centrosome of a pair of ce
ntrosomes(C),a few electron dense granules(DG) and more glycogen granules(↑) ne ar
the nucleus were easily seen in cytoplasm.TEM Fig.7 ×25 000; Fig.8 ×40 00 0
* 现在第二军医大学解剖学教研室工作，上海 200433
△ Department of Anatomy,Xi'an Medical University,Xi'an 710061,China
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Satoh H.Effects of ATP-sensitive K+ channel opener on pacemaker activity in isolated single rabbit sinoatrial node cells.J Cardiovas Pharmacol,1993,22(6):863
[2]Sun XD,Hao LY,Li JM.Whole-dell patch clamp measurments and berberine inhibition of hyperpolarization-activeted inward current in rabbit sinoatrial node cells.Chung Kuo Yao Li Hsueh Pao,1993,14(6):509
[3]Marvin WJ,Chittck VL,Rosenthal JK,et al.The isolated sinoatrial node cell in primary culture from the newborn rat.Cir Res,1984,55(2):253
, http://www.100md.com
[4]张炎，凌凤东，杨月鲜.新生乳鼠窦房结的光镜观察.解剖学杂志，1998，21(1)：31
[5]张炎，赵根然，杨少毅，等.新生乳鼠窦房结的电镜研究.西北大学学报(自然科学版)，1997，27(108)：217
[6]Simpson P,Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells.Circ Res,1982,50(1):101
[7]Kitzman DW,Edewards WD.Minireview:age-related changes in the anatomy of the normal human heart.J Geront,1990,2:33
[8]Maltsev-VA,Rohwedel J,Hescheler J.Embryonic stem cells differentiate in vitro into cardiomyocytes representing sinusnodal,atrial and ventricular cell types.Mech Der,1993,44(1):41
[9]赵根然，凌凤东，陈金典，等.大鼠窦房结光镜和电镜观察.西安医科大学学报，1991，12(4)：297
收稿1998-03 修回1998-12, 百拇医药
单位：张炎凌凤东(西安医科大学解剖学教研室，西安 710061)
关键词：窦房结；细胞原代培养；细胞光电镜结构；新生SD大鼠
解剖学报990312
【摘要】 目的 探索体外窦房结细胞原代纯化培养方法，观察培养的窦房结细胞生长状况及光电镜形态学特征。 方法 (1)用差速贴壁和Brdu处理作细胞培养；(2)观察和记录各类型培养细胞的生长状况；(3)HE染色和Heidenhain苏木素染色；(4)透射电镜观察。 结果 在培养的窦房结细胞中，至少有3种自发性收缩细胞及少量的星状和不规则细胞。收缩性细胞中，最多的是多边形细胞，其次是梭形，最少的是三角形细胞，且多边形细胞收缩频率最低(75.27±1.73/min
±s)，细胞染色和电镜观察结果显示：多边形细胞的细胞器相似于原位窦房结组织中的起搏(P)细胞，梭形细胞相似于移行(T)细胞，P细胞核旁较易见到电子致密颗粒和中心粒，也常见细胞核染色体正处于细胞周期的分裂期的前、中期。 结论 多边形细胞很幼稚，具有不断分裂增埴的能力。, 百拇医药
LIGNT AND ELECTRON MICROSCOPIC STUDY ON ISOLATED
SINOATRIAL NODE CELLS IN PRIMARY DISSOCIATED
CULTURE FROM THE NEONATAL SD RATS
Zhang Yan, Ling FengdongΔ
(Department of Anatomy,Xi'an Medical University,Xi'an)
【Abstract】 Objective The purpose of the study was to develop primary pure-culture of the sinoatrial node(SAN) cells in vitro and to investigate the growth conditions,morphological criteria of light and eletron microscopy of cultured cells. Methods (1)Cell culture with differential attachment technique and BrdU-treated.(2)Observing and recording the growth condition of cultured cells of each type.(3)HE staining and Heidenhain hematoxylin staining for facilitating morphologic identification of cultured nodal cells.(4)TEM observation for demonstrating of cultured cells of SAN.Results Among the cultured cells of SAN,at least three distinctly different types of spontaneously contracting cells were observed,as well as a few stellar and irregular cells.The greatest proportion of contracting cells were relatively large polygonal cells and the second group of cells was those with spindle configuration and the last group of cells was triangle cell.The mean frequency(75.27±1.73/min
±s)of spontaneous contraction of the polygonal cells was lowest in all contraction cells.The results of cells staining and ultrastructure observation in cultured cells indicated that the characteristic of polygonal and spindle cells were separately similar to these in P and T cells of SAN.The centrosome and a few electron dense granules near the nuclei were easily seen in the cytoplasm of polygonal cells.The chromosome appeared in nuclei of polygonal cells,and the cells was just at the prophase or metaphase in cell cycle. Conclusion The polygonal cells were infantile and proliferating cells., 百拇医药
【Key words】 SAN; Cell primary culture; Cell structure of light microscopy and TEM; Neonatal SD rat
迄今，在窦房结形态与功能的研究中，所用材料主要是在体组织、立体小标本及微小标本，近几年也有用酶消化窦房结组织块而得到的细胞团或单细胞[1，2]，它们数量有限，也不能传代，且操作过程中酶的消化及机械作用可使细胞活力大大减弱。在对窦房结单细胞作直接电生理和药理学研究时，体外培养的结窦房单细胞被认为是较前述更为理想的材料，但迄今国内尚未做此工作，国外也少有报道[3]。我们在新生SD大鼠窦房结的光、电镜定位研究的基础上[4，5]，取材做窦房结细胞原代分散培养，旨为窦房结形态和功能的研究提供有活力的数量充足的单细胞材料。
材料和方法
, 百拇医药 1. 材料
新生第4d SD大鼠360只，9次实验，每次40只，雌雄不拘。
2. 方法
2.1 窦房结细胞纯化培养：(1)将4d龄乳鼠体表用70%酒精擦洗后带入净化工作台内(苏州，YJ-875)，在大视场工作仪下，将鼠呈仰卧位固定，用碘酊、酒精消毒胸部皮肤，剪开胸前壁，暴露正搏动的心脏及前(上)腔静脉，于此静脉跟部取0.8×0.8×1mm组织块[5]；(2)按上述方法取材，将从各鼠剪下的组织块收集于盛有RRMI 1640培养液(美国，PRMI 1640)的培养皿中洗涤2次，再将组织充分剪碎，加入0.06%胰蛋白酶(美国Sigma,Difco 1∶250)，用尖嘴吸管轻轻吹打约2min，移至离心管，于37℃水浴中消化10min，自然沉淀，弃去上清，再加10～15ml 0.06%胰蛋白酶，再消化10min。多次消化，直至组织块成分散单细胞为止；(3)从第二次消化开始，每次消化后的细胞悬液吹打约2min，自然沉淀，吸取上清，并将上清分配至离心管中，每支离心管再加入等量1640液消除胰蛋白酶的消化作用，吹打，再离心1次，弃去上清，将沉淀的单细胞收集到有1640液的容器中；(4)将步骤(2)(3)后收集的各离心管中的单细胞沉淀集中制成单细胞悬液，加入10%～15%新生牛血清、1%～2%双抗，充分吹打、混悬后，分别吸入到预先置有玻片(1×1cm)的6孔或12孔培养板中，经红血球计数盘计数，最终细胞接种密度为1～10×155个/ml。另取细胞悬液0.9ml、0.4%台盼蓝0.1ml混匀，滴1滴于血球计数盘上数100个细胞，计算活细胞约达92%以上(活细胞不染色，死细胞被染成蓝色)；(5)将有活细胞的培养容器置于37℃、5%CO\-2培养箱中(日本，BNA-311D培养箱)，培养1.5～2h后，采用差速贴壁分离技术[6]，用吸管轻轻吸取培养孔中细胞悬液(因成纤维细胞贴壁快)，收集至另一容器中，按每2.7ml培养细胞悬液加1mmol/L 5-溴脱氧尿核苷(BrdU)(美国，Sigma)0.3ml，使BrdU终浓度为0.1mmol/L (BrdU主要抑制成纤维细胞生长)，继续培养，按每1～2d换液1次，前4次换液都使用BrdU。
, 百拇医药
2.2 对照培养：(1)常规培养 即窦房结细胞培养时不用差速贴壁技术，也不用BrdU处理培养液；(2)差速贴壁培养 即窦房结细胞培养时用贴壁分离技术但不用BrdU处理培养液；(3)窦房结细胞培养时，也分别取心房及心室肌组织作同步培养，以与窦房结细胞作鉴别。
2.3 培养细胞染色：HE染色和Heidenhain铁矾苏木素染色，步骤基本参照窦房结原位组织的染色步骤[4]。其中铁矾苏木素染色用于显示细胞内肌原纤维的有无和多寡。
2.4 透射电镜实验：倒置显微镜下选定培养板中长有细胞(5d)的盖玻片，取出后TBS洗涤10min×3次，入多聚甲醛-戊二醛固定液，室温下30min，PBS洗10min×3次，再入1%OsO\-4后固定，4℃、1h，上升酒精脱水，环氧丙烷10min，继之用环氧丙烷包埋剂、Epon-812 1∶1混合液于37℃下浸透过夜，将灌有Epon-812的胶囊倒扣于盖玻片上，烤箱内聚合60℃、40～72h；酒精加热聚合好的盖玻片，从盖玻片小心掰下胶囊，行超薄切片；醋酸铀饱和溶液(50%酒精配制)10～20min；双蒸水充分冲洗，枸橼酸铅10min，双蒸水冲洗。
, 百拇医药
2.5 观察和摄片：对培养活细胞用恒温相差倒置显微镜(日本，Olympus)观察；细胞收缩频率用手控计数器计数。对细胞染色片用AO光镜(美国产)观察，并用目镜测微尺(上海产)测量。对超薄切片用透射电镜(日本，H-600)观察。
2.6 统计分析：实验数据以(
±)和(±s)表示。结果
1. 窦房结细胞纯化培养(图1，2)
接种后，细胞为清亮的圆形或短棒状，最迟约在8h后开始贴壁生长，胞体逐渐增大，1d后可见单个细胞搏动，2d后可见细胞相互接触，不断分裂，增殖成片层状。活细胞主要有以下几种形态：(1)胞体较大的多边形细胞；(2)胞体中等的三角形细胞；(3)胞体较前两者小的梭形细胞；(4)少量胞体最大的星状多突细胞；(5)胞体最小的不规则形细胞。多边形细胞最多(表1)。此外，还可见单个细胞自发性搏动(2d后)，此搏动常见于(2)、(3)及(1)，而在(4)和(5)几乎未见搏动(表2)。
, 百拇医药
表1 各类培养细胞的分布
Table 1 Distribution of cultured cells of each type
窦房结
SAN
心房
atrium
心室
ventricle
多边形细胞
polygon cell
+++
, 百拇医药 +/++
+
三角形细胞
triangle cell
+/++
+++
+++
梭形细胞
spindle cell
+/++
++
++
星形细胞
, 百拇医药
stellar cell
+
+
+
不规则形细胞
irregular cell
+
+
+
注：(+)稀少 (++)较多 (+++)很多
Note:(+)sparse (++)scattering (+++)many
表2 各类单个细胞自发性收缩频率
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Table 2 Spontaneous contraction frequence of isolated cells of each type 细胞类型
cell type
范围
range
±sn
多边形
polygon
60～120/min
75.27±1.73/min
, 百拇医药 63
梭形
spindle
80～160/min
109.98±1.78/min*
80
三角形
triangle
90～230/min
168.11±2.56/min*Δ
100
*与多边形细胞比较P<0.01(as compared to polygon cells,P<0.01)
, 百拇医药
Δ与梭形细胞比较P<0.01(as compared to spindle cells,P<0.01)
2. 对照培养
对照培养(包括常规培养、差速贴壁培养)及纯化培养(差速贴壁+BrdU处理)各自的细胞生长情况见表3。纯化培养的细胞，虽贴壁、出现细胞搏动和片层的时间均较迟，但星形细胞大大减少。在心房及心室肌培养细胞中，三角形细胞最多(表1)，且均可见单个细胞自发性搏动及常见到合体搏动(30～120/min)。
表3 3种培养技术细胞生长状况
Table 3 Cell growth status cultured with three different techniques 技术techniques
开始贴壁
, 百拇医药
attachment
开始收缩
contraction
开始成片
in flakes
生长状况
condition
星形细胞
stellar cells
(1)
1～2(h)
6～8(h)
, 百拇医药
24～28(h)
很好
very good
很多
many
(2)
4～6(h)
10～15(h)
36～38(h)
好
good
较多
scattering
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(3)
8～10(h)
24～28(h)
48～46(h)
好
good
稀少
a few
注：(1)常规培养 (2)差速贴壁培养 (3)差速贴壁+BrdU处理
Note：(1)common cell culture; (2)culturel with differential attachment technique; (3) (2)+Brdu
, 百拇医药
3. 细胞染色
3.1 HE染色：与倒置相差显微镜下所见的几类活细胞形态基本一致。各类细胞染色和形态特征见表4，图3。
表4 各类培养细胞HE染色光镜特征的比较(μm,
±s,n=60)Table 4 Comparison of HE staining characteristics of cultured cell
of each type by light microscopy observation(μm,
±s,n=6) 细胞类型type
, 百拇医药
胞体长径
lenth
胞体宽径
breadth
核
nucleus
突起
projection
胞浆染色
staining
多边型
polygon
66.02±12.02
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53.40±8.85
大
large
2～4
淡
pale
梭形
spindle
85.09±14.75
24.39±10.69
小
small
2
, 百拇医药
较深
comparatively deep
三角形
tringle
83.72±16.06
32.17±9.88
中等
middle
3～4
深
deep
星形
, 百拇医药 stellar
73.92±10.29
55.06±8.15
大
large
>4
淡
pale
不规则形
irregular
45.88±6.51
41.68±6.31
, 百拇医药 小
small
2～3
很深
quite deep
其中多边形细胞核大而圆，约为胞体的1/2，核仁2～4个。
3.2 Heidenhain铁矾苏木素染色：多边形细胞胞浆染色浅，肌原纤维不丰富，呈同心圆状围绕核附近。核大而圆，可有双核，易见核内染色体常处于细胞分裂期的前、中期(图5，6)。梭形细胞胞浆染色稍深，肌原纤维丰富，位于核附近或两端。三角形细胞染色深，肌原纤维很丰富，位于核附近或两端，与细胞长轴平行(图4)。星形多突细胞和不规则细胞均无明显肌原纤维。
4. 透射电镜观察(图7，8)
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多边形细胞核大，核仁明显，线粒体、内质网、高尔基复合体不发达，糖原颗粒丰富，核旁电子致密颗粒少，肌原纤维不发达，仅可见少量成束肌微丝围绕核周分布，未见完整肌节及Z线，在核附近易见中心粒。梭形细胞线粒体较多，嵴密，肌原纤维束分布于核附近或两端，比多边形细胞的丰富，可见不完整肌节，偶可见Z线。三角形细胞的细胞器均较发达，核旁有较多电子致密颗粒，肌原纤维丰富，一般与细胞长轴平行，可一直伸达细胞末端，有完整的肌节、Z线。星形细胞突起多，核大而圆，核仁明显，核旁未见电子致密颗粒和肌原纤维。该细胞附近有一些明暗相间横纹的胶原纤维。
讨论1. 方法学探讨
分散培养的窦房结细胞可广范应用于窦房结的形态与功能研究。迄今仅国外少有开展窦房结细胞培养，究其原因，可能是由于结的位置、大小、构造在不同动物之间有较大差异，且又有增龄性变化[7]，给准确取材带来一定困难，还可能由于对窦房结组织细胞光、电镜研究尚未有成熟、完整的资料，使对培养细胞的形态学鉴定无统一的参照标准。Marvin等[3]做新生鼠窦房结细胞培养所取材部位实际是仅依据人的窦房结位置，而我们在对新生乳鼠窦房结作了较详细的光、电镜形态学定位研究后[4，5]，再取材做本实验。我们所确定的新生乳鼠窦房结位于前(上)腔静脉根部(静脉入口以上)，与Marvin等取材位置(上腔静脉与右心房交界处的右心房壁上)并不一致，哪一种取材准确，尚待进一步电生理和药理学实验证实。根据窦房结细胞在胚胎期与普通心房、心室肌细胞共同起源于原始、幼稚、未分化的心肌干细胞[8]，它们之间有结构、代谢方面的某些共同点，我们与Marvin等作窦房结细胞培养时，都参照了普通心肌细胞培养技术。有文献报道做心肌细胞培养时用差速贴壁分离技术并结合用BrdU抑制非心肌细胞，可使心肌细胞比例提高到95%[6]。Marvin等的实验未采用上述技术，因此他们观察到许多非心肌细胞(如成纤维细胞、内皮细胞等)。本实验做了3种培养方法的比较，结果表明，差速贴壁方法加BrdU处理是比较好的纯化培养方法，可大大减少成纤维细胞，使所培养的窦房结细胞具有应用价值。本实验观察到，用差速贴壁及BrdU处理后，培养的窦房结细胞中星形多突细胞大大减少，而此细胞几乎无搏动，电镜下亦未见有肌原纤维，因此我们推测这种细胞也许就是成纤维细胞。
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2. 培养的窦房结细胞形态学鉴别
对大鼠原位窦房结的形态学观察得到，窦房结主要有3种细胞，即起搏(P)细胞(pacemaker cell,P-cell)、移行(T)细胞(transitional cell,T-cell)及在结边缘少量普通心房肌细胞[4，5，9]，其中P细胞最幼稚，肌原纤维最不发达，普通心房肌细胞肌原纤维最发达，T细胞的肌原纤维介于两者之间。本实验所做窦房结体外培养细胞中，能收缩搏动的有多边形、梭形和三角形细胞，它们各自的肌原纤维发达程度分别与原位组织的P、T细胞及普通心房肌细胞相似[4，5]，因此我们推测，多边形细胞可能是起搏P细胞，梭形细胞可能是T细胞，三角形细胞可能是普通心房肌细胞。生理学认为，肌细胞的收缩频率和强弱与肌原纤维的多少与发达程度有关，多边形细胞肌原纤维最少、收缩装置发育最差，因此该细胞的搏动频率最慢，我们的这一推测与Marvin等的结论有差异，他们认为窦房结细胞是一种体积最小、收缩频率(185±8/min)最快的梭形细胞[3]。总之，对培养窦房结细胞的形态学鉴别还未取得一致，我们的推测是否客观，还需进一步功能研究的证实。当然，我们也应该认识到，培养细胞不可避免地存在一些局限性，如体外培养的窦房结细胞失去了体内正常的细胞比例及相互关系，对培养细胞的形态有一定的影响等。
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图1 培养窦房结(SAN)细胞(4d)，细胞已长成片 ×66
图2 示培养窦房结细胞几种类型(5d)，多边形细胞(Pol)，梭形细胞(spin)，三角形细胞(T ri)
×132
图3 示培养窦房结细胞几种类型(5d)，培养的窦房结细胞以多边形细胞(Pol)为主，培养的 心
房肌(A)、心室肌(V)细胞以三角形细胞(Tri)为主.Spin:梭形细胞 A：心房 V：心室 H E染色
×66
图4 示培养的三角形细胞中丰富的肌原纤维呈纵行排列，Heidenhain苏木素染色 ×198
图5 示培养的窦房结多边形细胞核内染色体处于细胞分裂期的前(↑)期，Heidenhain苏木 素染
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色 ×198
图6 示培养的窦房结多边形细胞核内染色体处于细胞分裂期的中期(↑)，Heidenhain苏木 素染
色 ×198
图7，8 示培养的窦房结多边形细胞核(N)旁单个或成对中心粒(C)，一些电子致密颗粒(DG) ，丰富的糖原颗粒(↑)，透射电镜 图7 ×25 000；图8 ×40 000
Fig.1 The cultured cells (4th day) in flakes of SAN ×66
Fig.2 The types of cultured cells(5th day) of SAN.Polygon cell(Pol);Triangle ce
lls(Tri);Spindle cells(Spin) ×132
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Fig.3 The greatest proportion of cells in cultured cells(5th day)of SAN were po
lygon cells(Pol) and in cultured cells of atrium and ventricle were triangle cel
ls(Tri).A:atrium;V:ventricle;HE ×66
Fig.4 It showed much more myofibrils which tend to be longitudinally arrayed in
cultured triangle cell.Heidenhain hematoxylin staining ×198
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Fig.5 The cultured polygon cells of SAN.The chromosome appearance in nucleus wa s
just at the prophase(↑) of division stage of cells cycle.Heidenhain hematoxyl in
staining ×198
Fig.6 The cultured polygon cells of SAN.The chromosome appearance in nucleus wa s
just at the metaphase(↑) of division stage of cells cycle.Heidenhain hematoxy lin
, 百拇医药
staining ×198
Fig.7,8 The cultured polygon cells of SAN.The single centrosome of a pair of ce
ntrosomes(C),a few electron dense granules(DG) and more glycogen granules(↑) ne ar
the nucleus were easily seen in cytoplasm.TEM Fig.7 ×25 000; Fig.8 ×40 00 0
* 现在第二军医大学解剖学教研室工作，上海 200433
△ Department of Anatomy,Xi'an Medical University,Xi'an 710061,China
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参考文献
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收稿1998-03 修回1998-12, 百拇医药