利用原位杂交分析几种cyclin和CDK基因在人乳腺癌中的异常表达*
作者：桑建利 王永潮 周清源
单位：桑建利 王永潮(北京师范大学生物系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875) 周清源(北京天坛医院外科)
关键词：乳腺肿瘤；cyclin；CDK；异常表达
解剖学报990309
【摘要】 目的 探讨细胞周期调控基因cyclin和CDK的异常与乳腺癌发生的相关性。 方法 采集20例乳腺癌外科手术样品，用原位杂交技术分析了cyclinD1、D3、E、CDK2 和CDK4 mRNA的表达。 结果 在大多数乳腺癌样品中，这些基因有一种或几种出现高表达。cyclinD1高表达的样品17例(85%)，cyclinD3有12例(60%)，cyclinE有7例(35%)，CDK2有6例(30%)，CKD4有16例(80%)。cyclinD1和CDK4显色最强，其次是cyclinD3，cyclinE和CDK2显色较弱，正常乳腺组织为阴性显色。 结论 推测cyclin和CDK基因，特别是cyclinD1和CDK4的异常表达与乳腺癌的发生有密切关系。
, 百拇医药
IN SITU HYBIDIZATION STUDY ON EXPRESSION OF SEVERAL
cyclin AND CDK GENES IN HUMAN BREAST CARCINOMA
Sang Jianli,Wang Yongchao△,Zhou Qingyuan*
(Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing;
Beijing Tiantan Hospital)
【Abstract】 Objective Study on the relationship between dysregulated expression of cyclin and CDK genes and tumorigenecity of human breast carcinoma.Methods the expression of cyclin D1,D3,E,CDK2 and CDK4 mRNA of 20 human breast cancer specimens was analyzed.Resuts one or more than one of these genes overexpressed in the majority of the cancer specimens,namely cyclin D1 overexpressed in 17 cancer specimens(85%);cyclin D3 in 12(60%);cyclin E in 7(35%);CDK2 in 6 (30%);CDK4 in 16(80%).The staining intensity of cyclin D1 and CDK4 was strong,cyclin D3 was moderate,cyclin E and CDK2 was weak,the normal breast tissue was negative. Conclusions these data implicate that dysregulated expression of several cyclin and /or CDK genes,particularly cyclin D1 and CDK4,might act as potential factors in the pathogenesis of breast cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Breast neoplasm;cyclin;CDK;Dysregulated expression
细胞分裂失调是造成癌细胞恶性增殖的主要原因。哺乳动物细胞进入分裂周期以及完成G1/S期和G2/M期的转换是受cyclin和CDK蛋白形成的蛋白激酶复合体控制的[1]。在对cyclin 基因在乳腺癌细胞中的变异、扩增、表达等的研究中，首先发现约20%的病例出现cyclinD1基因扩增[2]。同时还发现乳腺癌中cyclinD1 mRNA水平明显高于正常乳腺组织[3]。其他几种cyclin基因在乳腺癌中的异常表达也陆续有报道[4]。但这方面的研究还处于一个初期阶段，除了cyclinD1已被认为是一种原癌基因外，其他cyclin尚未定论，特别是CDK基因表达异常与乳腺癌的相关性报道甚少。为了深入认识cyclin和CDK在细胞周期中的调控作用，以及它们与乳腺细胞癌变的关系，我们选取乳腺癌为材料，利用RNA原位杂交技术，比较分析了cyclinD1、cyclinD3、cyclinE、CDK2和CDK4 mRNA在正常乳腺及乳腺癌组织中的表达水平。
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材料和方法
1.实验材料
从外科手术中收集了20例乳腺癌组织样本，为了表明cyclin和CDK基因与乳腺细胞癌变的关系，主要收集早期乳腺癌标本，其中16例按TNM分期法为Ⅰ期，4例为Ⅱ期，还收集了3例正常乳腺组织样本。收集后立即用OCT胶包埋，置于液氮中冷却，然后保存在-70℃冰箱中。
2.质粒构建
cyclinD1、cyclinD3、CDK2和CDK4基因cDNA由美国Cold Spring Harbor实验室的David Beach博士惠赠，cyclinE基因cDNA由美国Scripps研究所的Steve Reed博士惠赠。
本研究是利用体外转录获取DIG标记的RNA作为探针，这样基因片段需插入具RNA聚合酶启动子的质粒上。cyclinE、CDK2和CDK4的cDNA连接在含有RNA聚合酶启动子的pBluescript SK质粒上，符合要求。cyclinD1和cyclinD3最初连接在不含RNA聚合酶启动子的pUC118质粒上，因此需将它们重新构建到含启动子的pGEM3Z质粒上。根据酶切位点，cyclinD1用E.CoR Ⅰ和HindⅢ双酶切(1.14kb),cyclinD3用E.CoR Ⅰ和XbaⅠ双酶切(1.44kb)，同时用相同的酶切pGEM3Z质粒，然后将酶切片段分别连接到质粒上(图1显示cyclinD1重组质粒的构建，cyclinD3以相同的方式构建)。
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图1 重组质粒构建示意
Fig.1 Construction of recombinant plasmid pGEM3Z-cyclin D1
3.合成DIG标记的探针
首先，选择适当的酶切位点，将含各基因cDNA的质粒线性化，它们分别是E.CoRⅠ(cyclinD1、cyclinD3和CDK)、BamHI(cyclinE)、HindⅢ(CDK2)。然后确定转录合成RNA探针的RNA聚合酶，它们分别是SP6(cyclinD1、cyclinD3和CDK4)，T3(CDK2和CDK4)，T7(cyclinE)。利用德国Boehringer Mannheim公司生产的试剂盒合成DIG标记的反义及正义RNA。标记方法依据试剂盒所附使用说明书。由于最初合成的RNA片段较大，利用NaHCO3和Na2CO3将它们分解成约300个碱基的片段。
, 百拇医药
4.原位杂交
冷冻切片厚10μm，切片的固定、预处理，探针杂交及显色等主要参考《原位杂交》[5]及试剂盒说明书介绍的方法。各组织样品不仅用反义RNA探针进行杂交，同时也用正义RNA探针或不加探针作为对照。镜下观察、比较正常组织和癌组织的显色结果。
结 果
原位分子杂交结果显示(附表)，部分或大部分乳腺癌标本的癌细胞中不同程度地表达3种cyclin和2种CDK基因。根据阳性标本的相对显色程度，将它们分为强阳性、中阳性和弱阳性。cyclinD1和CDK4 mRNA的表达比例最高，并且高表达的程度也最大，中等以上阳性显色分别为17例和14例(阳性显色程度代表着mRNA表达水平)。约一半样品呈cyclinD3 mRNA高表达，但程度低于cyclinD1和CDK4。cyclinE和CDK2阳性的样品较少，出现阳性显色的也多为弱阳性。对于每一个病例样品来说，没有发现5种基因均为高表达的。均无高表达的2例，多数为1～3基因呈现高表达。
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各基因在样品中的显色结果见图2～9，显色最强的是cyclinD1和CDK4，其次是cyclinD3，较弱的是cyclinE和CDK2。所有基因在正常组织中均为阴性显色，仅见部分导管细胞呈cyclinD1弱阳性。
在用反义标记RNA链对组织切片进行杂交的同时，还采用正义标记RNA链作探针或不加探针作为对照，结果显示所有对照样品均为阴性。
附表 cyclin和CDKs在乳腺癌中的原位杂交结果
Table Expressions of cyclin and CDKs in breast
carcinoma detected by in situ hybridization 基因名称
name of genes
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cyclinD1
cyclinD3
cyclinE
CDK2
CDK4
阴性
negative
3
8
13
12
4
强阳性
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strong
14
12
中阳性
moderate
3
9
2
2
弱阳性
weak
3
7
, 百拇医药 6
2
讨 论
近年研究发现，人乳腺癌中的cyclinD1 mRNA或其他cyclin mRNA的表达高于正常乳腺组织，但这些结果均是用Northern blot方法检测的，还未见利用原位杂交分析的报道。在检测癌组织mRNA表达水平上，原位杂交有其特有的优点。Northern blot操作过程中，RNA易发生降解，而且从外科标本中提取RNA可能并不完全来自于癌细胞。这些可能会影响最终的检测结果。原位杂交术的操作可减少RNA降解的可能性。另外，从组织切片中可直接观察到癌细胞，分析有关基因的表达。同时这一技术还有一定的辅助病理诊断的意义。
cyclinD1是以乳腺癌为材料研究的比较多的一种细胞周期调控基因。有结果表明约20%乳腺癌患者的癌细胞的cyclinD1基因明显扩增，故有人提出cyclinD1是一种原癌基因[6]，至于它的高表达比例及强度，各家研究的结果各异。本研究结果中，多数样品呈cyclinD1 mRNA高表达，表明cyclinD1在乳腺癌中确有异常高表达，支持了cyclinD1为原癌基因的推测。
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cyclinD1、D2和D3统称为D型cyclin，它们都可以与CDK4或CDK6形成有激酶活性的复合体，但它们又各有自己独特的生物学效应。一般认为，增殖细胞主要表达cyclinD1，少数情况下表达D2或D3或与D1共表达，乳腺癌通常呈cyclinD1高表达[7]。本研究中有几例样品与cyclinD1同时或单独出现cyclinD3的高表达，说明cyclinD3也与细胞恶性增殖相关。cyclinE mRNA的表达程度较低，但还不能据此推测它的异常与细胞癌变无关。因为已发现乳腺癌中有相当比例的样品cyclinE蛋白量高于正常组织[8]。此现象还有待于进一步探讨。
CDK基因异常与乳腺癌发生的相关性报道甚少。本研究发现多数乳腺癌样品中CDK4 mRNA水平很高，表明作为催化亚基的CDK4异常表达也是细胞癌变的重要原因之一，它也可能是一个原癌基因。CDK2在大多数样品中都无高表达。
总的来说，大多数癌组织样品中呈现出高水平的cyclinD1和CDK4 mRNA，约半数样品中有cyclinD3 mRNA高表达。癌组织与正常组织中的cyclinE和CDK2表达水平差异不大。细胞的增殖受到多种cyclin和CDK基因的调控，当细胞中cyclinD1(或D3)和CDK4基因产物结合形成有活性的蛋白激酶复合体时，细胞便通过了G1期限制点，进入分裂周期。cyclinE与CDK2形成的蛋白激酶复合体能使细胞完成G1/S的转换，开始DNA的复制。这样，这些基因的异常表达可使本应停滞在G1期或进入G0期的细胞不断地异常分裂，细胞出现恶性增殖。这方面的深入研究将有助于揭示细胞癌变的机理。
, 百拇医药
图2 cyclinD1在乳腺癌细胞中的较强显色.ISH×400(下同)
图3 cyclinD3在乳腺癌细胞中的中等强度显色
图4 cyclinE在乳腺癌细胞中的较弱显色
图5 CDK2在乳腺癌细胞中的中偏弱显色
图6 CDK4在乳腺癌细胞中的较强显色
图7 cyclinD1在正常乳腺细胞中为阴性显色
图8 cyclinD1正链探针在乳腺癌细胞中为阴性显色
图9 无探针对照为阴性显色
Fig.2 Strong staining of cyclinD1 in breast carcinoma. ISH×400(all figures)
, 百拇医药
Fig.3 Moderate staining of cyclinD3 in breast carinoma.
Fig.4 Weak staining of cyclinE in breast carinoma.
Fig.5 Weak staining of CDK2 in breast carcinoma.
Fig.6 Strong staining of CDK4 in breast carcinoma.
Fig.7 Negative staining of cyclind1 in normal breast tissue.
Fig.8 Negative staning of probe control in breast carcinoma.
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Fig.9 Negative stainin without probe.
* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
△ Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875，China
参考文献
[1]Jacobs T.Control of the cell cycle.Developmental Biology,1992,153(1):1
[2]Lammie GA,Fantl V,Smith R,et al.D11s287,a putative oncogene on chromosome 11q13,is amplified and expressed in squamous cell and mammery carcinomas and linked to BCL-1.Oncogene,1991,64(3):439
, 百拇医药
[3]Sutherland,RL,Hamilton JA,Sweeney KJ,et al.Expression and regulation of cyclin gene in breast cancer.Acta Oncologica,1995,34(5):651
[4]Khandan K,Arthur BP.Redundant cyclin overexpression and gene amplification in breast cancer cells.Proc Nat1 Acad Sci USA,1993,90(5):1112
[5]苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994：59
[6]Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer.Cell,1991,66(6):1071
[7]Buckley MF,Sweeney KJE,Hamilton,JA,et al.Expression and amplifcation of cyclin genes in human breast cancer.Oncogene,1993,8(8):2127
[8]Khandan,K,Nuala,O'L,Gyongyi M,et al.Cyclin E,a potential prognostic maker for breast cancer.Cancer Research,1994,54(2):380
收稿1998-05 修回1998-07, http://www.100md.com
单位：桑建利 王永潮(北京师范大学生物系细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京 100875) 周清源(北京天坛医院外科)
关键词：乳腺肿瘤；cyclin；CDK；异常表达
解剖学报990309
【摘要】 目的 探讨细胞周期调控基因cyclin和CDK的异常与乳腺癌发生的相关性。 方法 采集20例乳腺癌外科手术样品，用原位杂交技术分析了cyclinD1、D3、E、CDK2 和CDK4 mRNA的表达。 结果 在大多数乳腺癌样品中，这些基因有一种或几种出现高表达。cyclinD1高表达的样品17例(85%)，cyclinD3有12例(60%)，cyclinE有7例(35%)，CDK2有6例(30%)，CKD4有16例(80%)。cyclinD1和CDK4显色最强，其次是cyclinD3，cyclinE和CDK2显色较弱，正常乳腺组织为阴性显色。 结论 推测cyclin和CDK基因，特别是cyclinD1和CDK4的异常表达与乳腺癌的发生有密切关系。
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IN SITU HYBIDIZATION STUDY ON EXPRESSION OF SEVERAL
cyclin AND CDK GENES IN HUMAN BREAST CARCINOMA
Sang Jianli,Wang Yongchao△,Zhou Qingyuan*
(Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing;
Beijing Tiantan Hospital)
【Abstract】 Objective Study on the relationship between dysregulated expression of cyclin and CDK genes and tumorigenecity of human breast carcinoma.Methods the expression of cyclin D1,D3,E,CDK2 and CDK4 mRNA of 20 human breast cancer specimens was analyzed.Resuts one or more than one of these genes overexpressed in the majority of the cancer specimens,namely cyclin D1 overexpressed in 17 cancer specimens(85%);cyclin D3 in 12(60%);cyclin E in 7(35%);CDK2 in 6 (30%);CDK4 in 16(80%).The staining intensity of cyclin D1 and CDK4 was strong,cyclin D3 was moderate,cyclin E and CDK2 was weak,the normal breast tissue was negative. Conclusions these data implicate that dysregulated expression of several cyclin and /or CDK genes,particularly cyclin D1 and CDK4,might act as potential factors in the pathogenesis of breast cancer.
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【Key words】 Breast neoplasm;cyclin;CDK;Dysregulated expression
细胞分裂失调是造成癌细胞恶性增殖的主要原因。哺乳动物细胞进入分裂周期以及完成G1/S期和G2/M期的转换是受cyclin和CDK蛋白形成的蛋白激酶复合体控制的[1]。在对cyclin 基因在乳腺癌细胞中的变异、扩增、表达等的研究中，首先发现约20%的病例出现cyclinD1基因扩增[2]。同时还发现乳腺癌中cyclinD1 mRNA水平明显高于正常乳腺组织[3]。其他几种cyclin基因在乳腺癌中的异常表达也陆续有报道[4]。但这方面的研究还处于一个初期阶段，除了cyclinD1已被认为是一种原癌基因外，其他cyclin尚未定论，特别是CDK基因表达异常与乳腺癌的相关性报道甚少。为了深入认识cyclin和CDK在细胞周期中的调控作用，以及它们与乳腺细胞癌变的关系，我们选取乳腺癌为材料，利用RNA原位杂交技术，比较分析了cyclinD1、cyclinD3、cyclinE、CDK2和CDK4 mRNA在正常乳腺及乳腺癌组织中的表达水平。
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材料和方法
1.实验材料
从外科手术中收集了20例乳腺癌组织样本，为了表明cyclin和CDK基因与乳腺细胞癌变的关系，主要收集早期乳腺癌标本，其中16例按TNM分期法为Ⅰ期，4例为Ⅱ期，还收集了3例正常乳腺组织样本。收集后立即用OCT胶包埋，置于液氮中冷却，然后保存在-70℃冰箱中。
2.质粒构建
cyclinD1、cyclinD3、CDK2和CDK4基因cDNA由美国Cold Spring Harbor实验室的David Beach博士惠赠，cyclinE基因cDNA由美国Scripps研究所的Steve Reed博士惠赠。
本研究是利用体外转录获取DIG标记的RNA作为探针，这样基因片段需插入具RNA聚合酶启动子的质粒上。cyclinE、CDK2和CDK4的cDNA连接在含有RNA聚合酶启动子的pBluescript SK质粒上，符合要求。cyclinD1和cyclinD3最初连接在不含RNA聚合酶启动子的pUC118质粒上，因此需将它们重新构建到含启动子的pGEM3Z质粒上。根据酶切位点，cyclinD1用E.CoR Ⅰ和HindⅢ双酶切(1.14kb),cyclinD3用E.CoR Ⅰ和XbaⅠ双酶切(1.44kb)，同时用相同的酶切pGEM3Z质粒，然后将酶切片段分别连接到质粒上(图1显示cyclinD1重组质粒的构建，cyclinD3以相同的方式构建)。
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图1 重组质粒构建示意
Fig.1 Construction of recombinant plasmid pGEM3Z-cyclin D1
3.合成DIG标记的探针
首先，选择适当的酶切位点，将含各基因cDNA的质粒线性化，它们分别是E.CoRⅠ(cyclinD1、cyclinD3和CDK)、BamHI(cyclinE)、HindⅢ(CDK2)。然后确定转录合成RNA探针的RNA聚合酶，它们分别是SP6(cyclinD1、cyclinD3和CDK4)，T3(CDK2和CDK4)，T7(cyclinE)。利用德国Boehringer Mannheim公司生产的试剂盒合成DIG标记的反义及正义RNA。标记方法依据试剂盒所附使用说明书。由于最初合成的RNA片段较大，利用NaHCO3和Na2CO3将它们分解成约300个碱基的片段。
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4.原位杂交
冷冻切片厚10μm，切片的固定、预处理，探针杂交及显色等主要参考《原位杂交》[5]及试剂盒说明书介绍的方法。各组织样品不仅用反义RNA探针进行杂交，同时也用正义RNA探针或不加探针作为对照。镜下观察、比较正常组织和癌组织的显色结果。
结 果
原位分子杂交结果显示(附表)，部分或大部分乳腺癌标本的癌细胞中不同程度地表达3种cyclin和2种CDK基因。根据阳性标本的相对显色程度，将它们分为强阳性、中阳性和弱阳性。cyclinD1和CDK4 mRNA的表达比例最高，并且高表达的程度也最大，中等以上阳性显色分别为17例和14例(阳性显色程度代表着mRNA表达水平)。约一半样品呈cyclinD3 mRNA高表达，但程度低于cyclinD1和CDK4。cyclinE和CDK2阳性的样品较少，出现阳性显色的也多为弱阳性。对于每一个病例样品来说，没有发现5种基因均为高表达的。均无高表达的2例，多数为1～3基因呈现高表达。
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各基因在样品中的显色结果见图2～9，显色最强的是cyclinD1和CDK4，其次是cyclinD3，较弱的是cyclinE和CDK2。所有基因在正常组织中均为阴性显色，仅见部分导管细胞呈cyclinD1弱阳性。
在用反义标记RNA链对组织切片进行杂交的同时，还采用正义标记RNA链作探针或不加探针作为对照，结果显示所有对照样品均为阴性。
附表 cyclin和CDKs在乳腺癌中的原位杂交结果
Table Expressions of cyclin and CDKs in breast
carcinoma detected by in situ hybridization 基因名称
name of genes
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cyclinD1
cyclinD3
cyclinE
CDK2
CDK4
阴性
negative
3
8
13
12
4
强阳性
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strong
14
12
中阳性
moderate
3
9
2
2
弱阳性
weak
3
7
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2
讨 论
近年研究发现，人乳腺癌中的cyclinD1 mRNA或其他cyclin mRNA的表达高于正常乳腺组织，但这些结果均是用Northern blot方法检测的，还未见利用原位杂交分析的报道。在检测癌组织mRNA表达水平上，原位杂交有其特有的优点。Northern blot操作过程中，RNA易发生降解，而且从外科标本中提取RNA可能并不完全来自于癌细胞。这些可能会影响最终的检测结果。原位杂交术的操作可减少RNA降解的可能性。另外，从组织切片中可直接观察到癌细胞，分析有关基因的表达。同时这一技术还有一定的辅助病理诊断的意义。
cyclinD1是以乳腺癌为材料研究的比较多的一种细胞周期调控基因。有结果表明约20%乳腺癌患者的癌细胞的cyclinD1基因明显扩增，故有人提出cyclinD1是一种原癌基因[6]，至于它的高表达比例及强度，各家研究的结果各异。本研究结果中，多数样品呈cyclinD1 mRNA高表达，表明cyclinD1在乳腺癌中确有异常高表达，支持了cyclinD1为原癌基因的推测。
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cyclinD1、D2和D3统称为D型cyclin，它们都可以与CDK4或CDK6形成有激酶活性的复合体，但它们又各有自己独特的生物学效应。一般认为，增殖细胞主要表达cyclinD1，少数情况下表达D2或D3或与D1共表达，乳腺癌通常呈cyclinD1高表达[7]。本研究中有几例样品与cyclinD1同时或单独出现cyclinD3的高表达，说明cyclinD3也与细胞恶性增殖相关。cyclinE mRNA的表达程度较低，但还不能据此推测它的异常与细胞癌变无关。因为已发现乳腺癌中有相当比例的样品cyclinE蛋白量高于正常组织[8]。此现象还有待于进一步探讨。
CDK基因异常与乳腺癌发生的相关性报道甚少。本研究发现多数乳腺癌样品中CDK4 mRNA水平很高，表明作为催化亚基的CDK4异常表达也是细胞癌变的重要原因之一，它也可能是一个原癌基因。CDK2在大多数样品中都无高表达。
总的来说，大多数癌组织样品中呈现出高水平的cyclinD1和CDK4 mRNA，约半数样品中有cyclinD3 mRNA高表达。癌组织与正常组织中的cyclinE和CDK2表达水平差异不大。细胞的增殖受到多种cyclin和CDK基因的调控，当细胞中cyclinD1(或D3)和CDK4基因产物结合形成有活性的蛋白激酶复合体时，细胞便通过了G1期限制点，进入分裂周期。cyclinE与CDK2形成的蛋白激酶复合体能使细胞完成G1/S的转换，开始DNA的复制。这样，这些基因的异常表达可使本应停滞在G1期或进入G0期的细胞不断地异常分裂，细胞出现恶性增殖。这方面的深入研究将有助于揭示细胞癌变的机理。
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图2 cyclinD1在乳腺癌细胞中的较强显色.ISH×400(下同)
图3 cyclinD3在乳腺癌细胞中的中等强度显色
图4 cyclinE在乳腺癌细胞中的较弱显色
图5 CDK2在乳腺癌细胞中的中偏弱显色
图6 CDK4在乳腺癌细胞中的较强显色
图7 cyclinD1在正常乳腺细胞中为阴性显色
图8 cyclinD1正链探针在乳腺癌细胞中为阴性显色
图9 无探针对照为阴性显色
Fig.2 Strong staining of cyclinD1 in breast carcinoma. ISH×400(all figures)
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Fig.3 Moderate staining of cyclinD3 in breast carinoma.
Fig.4 Weak staining of cyclinE in breast carinoma.
Fig.5 Weak staining of CDK2 in breast carcinoma.
Fig.6 Strong staining of CDK4 in breast carcinoma.
Fig.7 Negative staining of cyclind1 in normal breast tissue.
Fig.8 Negative staning of probe control in breast carcinoma.
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Fig.9 Negative stainin without probe.
* 国家自然科学基金资助课题(No.39430080)
△ Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, Beijing Normal University, Beijing 100875，China
参考文献
[1]Jacobs T.Control of the cell cycle.Developmental Biology,1992,153(1):1
[2]Lammie GA,Fantl V,Smith R,et al.D11s287,a putative oncogene on chromosome 11q13,is amplified and expressed in squamous cell and mammery carcinomas and linked to BCL-1.Oncogene,1991,64(3):439
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[3]Sutherland,RL,Hamilton JA,Sweeney KJ,et al.Expression and regulation of cyclin gene in breast cancer.Acta Oncologica,1995,34(5):651
[4]Khandan K,Arthur BP.Redundant cyclin overexpression and gene amplification in breast cancer cells.Proc Nat1 Acad Sci USA,1993,90(5):1112
[5]苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994：59
[6]Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer.Cell,1991,66(6):1071
[7]Buckley MF,Sweeney KJE,Hamilton,JA,et al.Expression and amplifcation of cyclin genes in human breast cancer.Oncogene,1993,8(8):2127
[8]Khandan,K,Nuala,O'L,Gyongyi M,et al.Cyclin E,a potential prognostic maker for breast cancer.Cancer Research,1994,54(2):380
收稿1998-05 修回1998-07, http://www.100md.com