听源性惊厥发作后中脑导水管周围灰质内c-fos基因的变化
作者：刘猛 许鹿希
单位：刘猛 许鹿希(北京医科大学解剖学系，北京 100083)
关键词：导水管周围灰质；Fos蛋白；听源性惊厥；大鼠
解剖学报990305
【摘要】 目的 探讨中脑导水管周围灰质(PAG)与听源性惊厥的关系。 方法 用神经细胞(Nissl)染色和免疫细胞化学技术，观察听源性惊厥发作后易感大鼠(P77PMC)PAG内即早基因c-fos的表达情况。 结果 听源性惊厥发作2h后，P77PMC大鼠PAG的背侧亚区及背外侧亚区、尾侧段腹外侧亚区内出现大量Fos阳性神经元，Fos阳性神经元百分率显著高于对照组。 结论 听源性惊厥易感大鼠PAG内大量神经元参与了听源性惊厥发作过程。
CHANGES OF c-fos GENE IN PERIAQUEDUCTAL GRAY
, http://www.100md.com
OF AUDIOGENIC SEIZURES-PRONE RATS
FOLLOWING AUDIOGENIC SEIZURES
Liu Meng, Xu LuxiΔ
(Department of Anatomy, Beijing Medical University, Beijing)
【Abstract】 Objective To find out the relationship between the periaqueductal gray (PAG) and the audiogenic seizures. Methods The neuronal(Nissl)staining method and the immunocytochemical method were used to identify the Fos-postive neurons in the PAG of the audiogenic seizures-prone rats(P77PMC) after audiogenic seizures. Results There were lots of Fos-positive neurons in the dorsolateral, dorsal and caudoventrolateral subdivisions of the PAG in P77PMC rats two hours post-seizure, and the percentage of Fos-positive neurons was significant higher than that of rats in control groups. Conclusion A large number of neurons in the PAG of the audiogenic seizures-prone rats participated in the process of the audiogenic seizures.
, 百拇医药
【Key words】 Periaqueductal gray;Fos; Audiogenic seizures; Rats
听源性惊厥是一种全身强直-阵挛性癫痫发作状态，现已证明，此类惊厥属于一种“脑干癫痫发作”，中脑是其发生、发展、表达的重要部位[1，2]。有关上丘和下丘在听源性惊厥发作中作用的研究已见报道，但关于中脑导水管周围灰质(periagueductal gray,PAG)这一脑干重要的感觉、运动整合中枢与听源性惊厥关系的文献还很少。我们以即早基因c-fos的表达作为神经元功能活动的标志，对听源性惊厥易感大鼠惊厥发作后其PAG内神经元即早基因c-fos的变化进行了分析。
材料和方法
1. 动物分组与切片制备
实验动物均为成年雄性，体重350～450g。分3组，即NW组(normal Wistar rats,n=4)：正常Wistar大鼠；NP组(naive P77PMC rats,n=4)：未受处理的听源性惊厥易感大鼠；PS组(P77PMC rats exhibiting seizures,n=4)：接受1次(106dB,60s)铃声刺激呈强直-阵挛性惊厥发作的P77PMC大鼠。
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在NW组与PS组接受同样铃声(106dB,60s)刺激后2h，3组大鼠均以复合麻醉剂(chloropent, 3 ml/kg)腹腔注射麻醉，行左心室-升主动脉插管，室温下先灌注100～150 ml生理盐水，然后以400 ml含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)灌注固定。脑组织块在相同固定液中后固定24h，4℃。常规脱水、透明，石蜡包埋，冠状连续切片，厚10 μm。分两套裱于涂有铬矾明胶的载片上。1套作克紫(Nissl)染色，另1套作免疫细胞化学染色。
2. 免疫细胞化学方法
3组切片经二甲苯脱蜡、0.01 mol/L磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS，pH7.4)漂洗后，室温下依次入含0.3% Triton X-100的0.01mol/L PBS、含0.3% H2O2的纯甲醇(封闭内源性过氧化物酶)及2%正常羊血清(抑制非特异性IgG的结合)各30 min；之后入兔抗Fos的多克隆抗体(1：150，Santa Cruz)，4℃孵育24h；再依次入生物素结合的羊抗兔IgG(1：200,Vector)和卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)(1∶100，Vector)中各孵育1.5 h，室温；以上各步骤之间均以0.01 mol/L PBS充分漂洗。最后以含0.01% H2O2的0.04% DAB(二氨基联苯胺，TCI)溶液呈色5～10 min，随时镜检并及时以0.01 mol/L PBS终止反应。切片经0.01 mol/L PBS充分漂洗后，常规脱水透明，中性树胶封片。每组的对照切片不加兔抗Fos抗体孵育，其余步骤相同。
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3. Fos阳性神经元百分率的计算
每只大鼠的PAG冠状连续切片由首侧向尾侧每隔150 μm取片，其中背盖背侧核至滑车神经核尾端之间的切片归入PAG尾侧段，滑车神经核至动眼神经核上端之间的切片归入PAG中段，后连合至室旁灰质间的切片归入PAG首侧段[3]；这样，每只大鼠共观察约15张切片，其中尾侧段3张，首侧段2张，中段10张[3]。然后以目镜正方网格测试系统在明视野显微镜(400倍)下测量每张切片PAG各亚区0.0225 mm2面积内的Fos阳性神经元数，以此作为该亚区Fos阳性神经元的密度，各节段各亚区的测量部位保持一致以减小人为误差；以相同方法计数相邻Nissl切片上相同部位0.0225mm2面积内神经元剖面的数量作为该部位的神经元密度。Fos阳性神经元密度与Nissl切片神经元密度的比值即为该部位的Fos阳性神经元百分率。然后以方差分析检验各组Fos阳性神经元百分率之间的差异。
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结 果
1. NW组PAG内的Fos阳性神经元
正常Wistar大鼠接受1次铃声(106dB,60s)刺激后，PAG背侧亚区、背外侧亚区和尾侧段腹外侧亚区内仅观察到个别散在的Fos阳性神经元，其阳性百分率见附表。
2. NP组PAG内的Fos阳性神经元
在没有接受铃声(106dB,60s)刺激的P77PMC大鼠的PAG背侧亚区、背外侧亚区和尾侧段腹外侧亚区内同样仅观察到个别散在的Fos阳性神经元，其阳性百分率见附表。
3.PS组PAG内的Fos阳性神经元
听源性惊厥易感大鼠(P77PMC)在接受铃声刺激(106dB,60s)的第30～40s时出现惊厥发作，持续大约30～40s。听源性惊厥发作后的第2h，在PAG内可见广泛的c-fos表达。Fos阳性产物为棕黄色细颗粒状，位于细胞核内。在PAG尾侧段，Fos阳性神经元主要分布在腹外侧亚区，中缝核团内亦可见少量阳性神经元(图1，图5A)；在中段，Fos阳性神经元集中成簇分布在背侧亚区及背外侧亚区内，而腹外侧亚区内的Fos阳性神经元则由尾侧向首侧逐渐减少直至消失；中段还可见少量散在的阳性神经元勾勒出中缝核团的轮廓(图2，4；图5B，C)；在首侧PAG水平，Fos阳性神经元集中分布在后连合内下方的背侧亚区内(图3，图5D)。PAG各亚区各节段内Fos阳性神经元的分布情况以及Fos阳性神经元百分率见图5和附表。
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4. 每组的对照切片上均未见Fos阳性神经元。
附表 3组大鼠PAG内Fos阳性神经元百分率(%，
±s)
Table Percentage of Fos-postive neurons in the PAG of three groups of rats(%,±s)
腹外侧亚区
ventrolateral subdivison
背侧亚区
dorsal subdivision
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背外侧亚区
dorsolateral subdivision
NW
NP
PS
NW
NP
PS
NW
NP
PS
尾侧段
caudal segment
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7.24±2.74
7.33±2.68
27.28±5.33
中段
middle segment
9.26±2.45
11.37±3.24
40.56±7.38
12.76±3.13
10.29±3.57
45.11±6.13
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首侧段
rostral segment
6.48±3.10
5.64±2.02
25.65±4.20
*：与NW及NP组相比，P<0.001
*：Compare with NW and NP groups,P<0.001
图5 A～D 显示P77PMC大鼠惊厥发作后尾侧段(A)、中段(B、C)和首侧段(D) PAG各亚区内Fos阳性神经元分布情况的线条图。a～d 为显示PAG相应节段和位置的线条图。Aq.中脑导水管。Cb1.小脑。DK.达克谢维奇核。DLS、DS、MS、VLS分别为PAG的背外侧亚区、背侧亚区、内侧亚区和腹外侧亚区。DR.中缝背核。DTg.背盖背核。LDT.背盖背核外侧部。MLF.内侧纵束。PC.后连合。3.动眼神经核。4.滑车神经核。
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Fig.5 A-D， The distribution of Fos-positive neurons in the subdivisions of the caudal(A), middle (B and C), and rostral(D) segments of the PAG of P77PMC rats after seizures. a-d, drawings show the mesencephalic levels of the PAG; Aq, cerebral aqueduct. Cbl,cerebellum; DK, nucleus of Darkschewitsch. DLS, dorsolateral subdivision of PAG; DR, dorsal raphe nucleus; DS, dorsal subdivision of PAG; DTg, dorsal tegmental nucleus; LDT, laterodorsal tegmental nucleus; MLF, medial longitudinal fascicullus; MS, medial subdivision of PAG; PC, posterior commissure; VLS, ventrolateral subdivision of PAG; 3,oculomotor nuclei; 4,trochlear nuclei.
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讨 论
中脑导水管周围灰质(PAG)是一个结构与功能均非常复杂的区域，它广泛参与镇痛、心血管反应、恐惧与焦虑等功能活动的调控，是脑干部位重要的感觉、运动整合中枢及自主调节中枢。其内部层叠交错的柱式环路是其执行各项复杂功能的结构基础，而PAG内的亚区或亚群这一细胞构筑形式又是其柱式环路的主体成分[4]。目前，PAG内存在亚区或亚群的观点已被广泛接受，并已初步发现了PAG各亚区不同的结构及功能特性。但有关PAG内部详细的功能定位尚未完全明了。
P77PMC听源性惊厥易感大鼠属Wistar品系，由北京医科大学实验动物中心培育，其特点是受到外源声音刺激可致典型的听源性惊厥发作，表现为野性狂奔(wild-running)及随后的全身强直-阵挛发作。Marescaux[1]和Simler[2]等利用不同的方法分别证实，听源性惊厥是一种脑干型癫痫发作，其发作后放电及参与发作的主要解剖结构是在脑干部位。Garcia-cairasco[5]等从神经行为学和神经化学角度对中脑上、下丘及黑质在听源性惊厥中的作用进行了研究及综述，但对PAG的作用未做细致分析。虽然PAG与听觉、视觉系统没有直接、广泛的纤维联系，但是各种感觉信息可通过多突触联系到达PAG，并在PAG内进行重要的整合，因此，单靠毁损大部PAG不能阻止听源性惊厥发作[6]这一点并不能断定PAG完全与听源性惊厥无关。
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由于参与多种持续性内脏活动的调节，PAG在正常情况下也会存在一定量的c-fos基础表达(basal expression)[7]，故在NW组和NP组大鼠PAG内可见到少量Fos阳性神经元，但其阳性百分率显著小于PS组，这说明PS组的阳性结果并不仅缘于PAG内c-fos的基础表达，也不是缘于单纯的铃声刺激，而是一种与听源性惊厥发作特异相关的变化。PAG背侧及背外侧亚区，尾侧段腹外侧亚区内有大量神经元参与了听源性惊厥的表达过程，尤其以背外侧亚区Fos阳性细胞最为密集，并几乎贯穿PAG首尾全长。目前已知PAG各亚区具有独特的功能特性和神经化学特性，如背外侧亚区介导血压升高，心率加快，奔跑，发声等积极的兴奋性防御行为[4]，同时此亚区又是PAG内各种兴奋性神经元及兴奋性氨基酸受体(包括谷氨酸能神经元和NMDA受体)分布密度最高的区域；而PAG尾侧段的腹外侧亚区则介导血压降低，心率减慢，静默状态(quiescence)等消极的抑制性的防御行为[4]，此区内GABA能神经元最为丰富而谷氨酸能神经元则较少[8～10]。以上迥然不同的功能及化学特性表明此两亚区内的Fos阳性神经元在听源性惊厥发作过程中的作用也可能不同。可以推测，PAG背外侧亚区表达c-fos的神经元可能参与了惊厥兴奋性的扩散过程，而尾侧段腹外侧亚区的Fos阳性神经元则可能参与惊厥兴奋性的终止过程。
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PAG背外侧亚区独特的化学特性还表现在它是PAG内唯一含有丰富一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)阳性神经元的区域[11]。PS组大鼠PAG内表达c-fos基因的神经元中很可能存在着一氧化氮(nitric oxide, NO)能神经元。NO作为一种神经递质(调质)在听源性惊厥中的作用，可能与其介导谷氨酸作用于NMDA受体导致的CGMP生成有关，CGMP作为胞内第二信使可直接或间接地改变细胞的功能状态，而恰好背外侧亚区又是PAG内兴奋性氨基酸受体激动剂，包括NMDA在内的结合位点密度最高的区域，并且含有丰富的谷氨酸能神经元；此外，PAG内的NO还可能通过那些与之共存的神经递质或调质之间的相互作用参与听源性惊厥的表达。
总之，听源性惊厥发作诱导PAG内大量神经元表达c-fos基因，揭示了PAG内神经元功能活动的剧烈改变，N’Gouemo[12]的电生理研究也发现，听源性惊厥易感大鼠PAG内许多神经元表现为异常的高反应性状态，而且出现与强直相关的神经元异常放电，这些都进一步说明PAG参与了听源性惊厥发作过程，但其中的神经化学机制尚需进一步探讨。
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图 版 说 明
图1～3 Fos阳性神经元在PS组大鼠PAG尾侧段(图1)、中段(图2)和首侧段(图3)各亚区内的分布 ×75
图4 PS组大鼠PAG中段背侧亚区和背外侧亚区内Fos阳性神经元的分布 ×150
Explanation of figures
Fig.1-3 The distribution of Fos-postive neurons in subdivisions of the caudal(Fig.1), middle(Fig.2),and rostral(Fig.3,)segments of PAG in PS rats ×75
Fig.4 The distribution of Fos-postive neurons in the dorsal subdivision and dorsolateral subdivision of the middle segment PAG of PS rats. ×150
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△ Department of anatomy, Beijing Medical University, Beijing 100083,China
参考文献
[1]Marescaux C, Vergnes M, Kiesmann M, et al. Kindling of audiogenic seizures in Wistar rats: an EGG study. Exp Neurol,1987,97(1)：160
[2]Simler S, Hirsch E, Danober L, et al. c-fos expression after single and kindled audiogenic seizures in Wistar rats. Neurosci Lett, 1994,175(1-2)：58
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[4]Richard B, Michael TS. Columnar organization in the midbrain periaqueductal gray:modules for emotional expression. TINS,1994,17(3):379
[5]Carcia-Cairasco NV, Terra VC, Doretto MC. Midbrain substrates of audiogenic seizures in rats. Behav Brain Res, 1993,58(1-2):57
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[6]Bagri A, Discala G, Sandner G. Wild running elicited by microinjections of bicululline or morphine into the inferior colliculus of rats: lack of effect of periaqueductal gray lesions. Pharmacol Biochem Behav, 1992,41(4)：727
[7]Valverde-Navarro AA, 01ucha FE, Garcia-Verdugo JM, et al. Distribution of basal-expressed c-fos-like immunoreactive cells of the periaqueductal gray
[8]Albin RL, Maddowiec RL, Hhollingsworth Z, et al. Excitatory amino acid receptors in the periaqueductal gray of the rats. Neurosci Lett,1990,118(1):112.
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[9]Clements JR, Madl JE, Johnson RL, et al. Localization of glutamate, glutaminase, spartate and aspartate aminotransferase in the rat midbrain periaqueduactal gray. Exp Brain Res 1987,67(3):594
[10]Williams FG, Beitz AJ. Ultrastructural morphometric analysis of GABA-immunoreactive terminals in the ventrocaudal periaqueductal grey:analysis of the relationship of GABA terminals and the GABAA receptor to periaqueductal grey-raphe magnus projection neurons. Journal of Neurocytology,1990,19(4):686
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[11]Onstott D, Mayer B, Beitz AJ. Nitric Oxide Synthase immunoreactive neurons anatomically define a longitudinal dorsolateral column within the midbrain periaqueductal gray of the rat: analysis using laser confocal microscopy. Brain Res, 1993,610(2):317
[12]N'Gouemo P, Faingold CL. Periaqueductal gray neurons exhibit increased responsiveness associated with audiogenic seizures in the genetically epilepsy-prone rat. Neuroscience,1998,84(2):619
收稿1998-12 修回1998-03, 百拇医药
单位：刘猛 许鹿希(北京医科大学解剖学系，北京 100083)
关键词：导水管周围灰质；Fos蛋白；听源性惊厥；大鼠
解剖学报990305
【摘要】 目的 探讨中脑导水管周围灰质(PAG)与听源性惊厥的关系。 方法 用神经细胞(Nissl)染色和免疫细胞化学技术，观察听源性惊厥发作后易感大鼠(P77PMC)PAG内即早基因c-fos的表达情况。 结果 听源性惊厥发作2h后，P77PMC大鼠PAG的背侧亚区及背外侧亚区、尾侧段腹外侧亚区内出现大量Fos阳性神经元，Fos阳性神经元百分率显著高于对照组。 结论 听源性惊厥易感大鼠PAG内大量神经元参与了听源性惊厥发作过程。
CHANGES OF c-fos GENE IN PERIAQUEDUCTAL GRAY
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OF AUDIOGENIC SEIZURES-PRONE RATS
FOLLOWING AUDIOGENIC SEIZURES
Liu Meng, Xu LuxiΔ
(Department of Anatomy, Beijing Medical University, Beijing)
【Abstract】 Objective To find out the relationship between the periaqueductal gray (PAG) and the audiogenic seizures. Methods The neuronal(Nissl)staining method and the immunocytochemical method were used to identify the Fos-postive neurons in the PAG of the audiogenic seizures-prone rats(P77PMC) after audiogenic seizures. Results There were lots of Fos-positive neurons in the dorsolateral, dorsal and caudoventrolateral subdivisions of the PAG in P77PMC rats two hours post-seizure, and the percentage of Fos-positive neurons was significant higher than that of rats in control groups. Conclusion A large number of neurons in the PAG of the audiogenic seizures-prone rats participated in the process of the audiogenic seizures.
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【Key words】 Periaqueductal gray;Fos; Audiogenic seizures; Rats
听源性惊厥是一种全身强直-阵挛性癫痫发作状态，现已证明，此类惊厥属于一种“脑干癫痫发作”，中脑是其发生、发展、表达的重要部位[1，2]。有关上丘和下丘在听源性惊厥发作中作用的研究已见报道，但关于中脑导水管周围灰质(periagueductal gray,PAG)这一脑干重要的感觉、运动整合中枢与听源性惊厥关系的文献还很少。我们以即早基因c-fos的表达作为神经元功能活动的标志，对听源性惊厥易感大鼠惊厥发作后其PAG内神经元即早基因c-fos的变化进行了分析。
材料和方法
1. 动物分组与切片制备
实验动物均为成年雄性，体重350～450g。分3组，即NW组(normal Wistar rats,n=4)：正常Wistar大鼠；NP组(naive P77PMC rats,n=4)：未受处理的听源性惊厥易感大鼠；PS组(P77PMC rats exhibiting seizures,n=4)：接受1次(106dB,60s)铃声刺激呈强直-阵挛性惊厥发作的P77PMC大鼠。
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在NW组与PS组接受同样铃声(106dB,60s)刺激后2h，3组大鼠均以复合麻醉剂(chloropent, 3 ml/kg)腹腔注射麻醉，行左心室-升主动脉插管，室温下先灌注100～150 ml生理盐水，然后以400 ml含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4，4℃)灌注固定。脑组织块在相同固定液中后固定24h，4℃。常规脱水、透明，石蜡包埋，冠状连续切片，厚10 μm。分两套裱于涂有铬矾明胶的载片上。1套作克紫(Nissl)染色，另1套作免疫细胞化学染色。
2. 免疫细胞化学方法
3组切片经二甲苯脱蜡、0.01 mol/L磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS，pH7.4)漂洗后，室温下依次入含0.3% Triton X-100的0.01mol/L PBS、含0.3% H2O2的纯甲醇(封闭内源性过氧化物酶)及2%正常羊血清(抑制非特异性IgG的结合)各30 min；之后入兔抗Fos的多克隆抗体(1：150，Santa Cruz)，4℃孵育24h；再依次入生物素结合的羊抗兔IgG(1：200,Vector)和卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)(1∶100，Vector)中各孵育1.5 h，室温；以上各步骤之间均以0.01 mol/L PBS充分漂洗。最后以含0.01% H2O2的0.04% DAB(二氨基联苯胺，TCI)溶液呈色5～10 min，随时镜检并及时以0.01 mol/L PBS终止反应。切片经0.01 mol/L PBS充分漂洗后，常规脱水透明，中性树胶封片。每组的对照切片不加兔抗Fos抗体孵育，其余步骤相同。
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3. Fos阳性神经元百分率的计算
每只大鼠的PAG冠状连续切片由首侧向尾侧每隔150 μm取片，其中背盖背侧核至滑车神经核尾端之间的切片归入PAG尾侧段，滑车神经核至动眼神经核上端之间的切片归入PAG中段，后连合至室旁灰质间的切片归入PAG首侧段[3]；这样，每只大鼠共观察约15张切片，其中尾侧段3张，首侧段2张，中段10张[3]。然后以目镜正方网格测试系统在明视野显微镜(400倍)下测量每张切片PAG各亚区0.0225 mm2面积内的Fos阳性神经元数，以此作为该亚区Fos阳性神经元的密度，各节段各亚区的测量部位保持一致以减小人为误差；以相同方法计数相邻Nissl切片上相同部位0.0225mm2面积内神经元剖面的数量作为该部位的神经元密度。Fos阳性神经元密度与Nissl切片神经元密度的比值即为该部位的Fos阳性神经元百分率。然后以方差分析检验各组Fos阳性神经元百分率之间的差异。
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结 果
1. NW组PAG内的Fos阳性神经元
正常Wistar大鼠接受1次铃声(106dB,60s)刺激后，PAG背侧亚区、背外侧亚区和尾侧段腹外侧亚区内仅观察到个别散在的Fos阳性神经元，其阳性百分率见附表。
2. NP组PAG内的Fos阳性神经元
在没有接受铃声(106dB,60s)刺激的P77PMC大鼠的PAG背侧亚区、背外侧亚区和尾侧段腹外侧亚区内同样仅观察到个别散在的Fos阳性神经元，其阳性百分率见附表。
3.PS组PAG内的Fos阳性神经元
听源性惊厥易感大鼠(P77PMC)在接受铃声刺激(106dB,60s)的第30～40s时出现惊厥发作，持续大约30～40s。听源性惊厥发作后的第2h，在PAG内可见广泛的c-fos表达。Fos阳性产物为棕黄色细颗粒状，位于细胞核内。在PAG尾侧段，Fos阳性神经元主要分布在腹外侧亚区，中缝核团内亦可见少量阳性神经元(图1，图5A)；在中段，Fos阳性神经元集中成簇分布在背侧亚区及背外侧亚区内，而腹外侧亚区内的Fos阳性神经元则由尾侧向首侧逐渐减少直至消失；中段还可见少量散在的阳性神经元勾勒出中缝核团的轮廓(图2，4；图5B，C)；在首侧PAG水平，Fos阳性神经元集中分布在后连合内下方的背侧亚区内(图3，图5D)。PAG各亚区各节段内Fos阳性神经元的分布情况以及Fos阳性神经元百分率见图5和附表。
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4. 每组的对照切片上均未见Fos阳性神经元。
附表 3组大鼠PAG内Fos阳性神经元百分率(%，
±s)Table Percentage of Fos-postive neurons in the PAG of three groups of rats(%,
±s)腹外侧亚区
ventrolateral subdivison
背侧亚区
dorsal subdivision
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背外侧亚区
dorsolateral subdivision
NW
NP
PS
NW
NP
PS
NW
NP
PS
尾侧段
caudal segment
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7.24±2.74
7.33±2.68
27.28±5.33
中段
middle segment
9.26±2.45
11.37±3.24
40.56±7.38
12.76±3.13
10.29±3.57
45.11±6.13
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首侧段
rostral segment
6.48±3.10
5.64±2.02
25.65±4.20
*：与NW及NP组相比，P<0.001
*：Compare with NW and NP groups,P<0.001
图5 A～D 显示P77PMC大鼠惊厥发作后尾侧段(A)、中段(B、C)和首侧段(D) PAG各亚区内Fos阳性神经元分布情况的线条图。a～d 为显示PAG相应节段和位置的线条图。Aq.中脑导水管。Cb1.小脑。DK.达克谢维奇核。DLS、DS、MS、VLS分别为PAG的背外侧亚区、背侧亚区、内侧亚区和腹外侧亚区。DR.中缝背核。DTg.背盖背核。LDT.背盖背核外侧部。MLF.内侧纵束。PC.后连合。3.动眼神经核。4.滑车神经核。
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Fig.5 A-D， The distribution of Fos-positive neurons in the subdivisions of the caudal(A), middle (B and C), and rostral(D) segments of the PAG of P77PMC rats after seizures. a-d, drawings show the mesencephalic levels of the PAG; Aq, cerebral aqueduct. Cbl,cerebellum; DK, nucleus of Darkschewitsch. DLS, dorsolateral subdivision of PAG; DR, dorsal raphe nucleus; DS, dorsal subdivision of PAG; DTg, dorsal tegmental nucleus; LDT, laterodorsal tegmental nucleus; MLF, medial longitudinal fascicullus; MS, medial subdivision of PAG; PC, posterior commissure; VLS, ventrolateral subdivision of PAG; 3,oculomotor nuclei; 4,trochlear nuclei.
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讨 论
中脑导水管周围灰质(PAG)是一个结构与功能均非常复杂的区域，它广泛参与镇痛、心血管反应、恐惧与焦虑等功能活动的调控，是脑干部位重要的感觉、运动整合中枢及自主调节中枢。其内部层叠交错的柱式环路是其执行各项复杂功能的结构基础，而PAG内的亚区或亚群这一细胞构筑形式又是其柱式环路的主体成分[4]。目前，PAG内存在亚区或亚群的观点已被广泛接受，并已初步发现了PAG各亚区不同的结构及功能特性。但有关PAG内部详细的功能定位尚未完全明了。
P77PMC听源性惊厥易感大鼠属Wistar品系，由北京医科大学实验动物中心培育，其特点是受到外源声音刺激可致典型的听源性惊厥发作，表现为野性狂奔(wild-running)及随后的全身强直-阵挛发作。Marescaux[1]和Simler[2]等利用不同的方法分别证实，听源性惊厥是一种脑干型癫痫发作，其发作后放电及参与发作的主要解剖结构是在脑干部位。Garcia-cairasco[5]等从神经行为学和神经化学角度对中脑上、下丘及黑质在听源性惊厥中的作用进行了研究及综述，但对PAG的作用未做细致分析。虽然PAG与听觉、视觉系统没有直接、广泛的纤维联系，但是各种感觉信息可通过多突触联系到达PAG，并在PAG内进行重要的整合，因此，单靠毁损大部PAG不能阻止听源性惊厥发作[6]这一点并不能断定PAG完全与听源性惊厥无关。
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由于参与多种持续性内脏活动的调节，PAG在正常情况下也会存在一定量的c-fos基础表达(basal expression)[7]，故在NW组和NP组大鼠PAG内可见到少量Fos阳性神经元，但其阳性百分率显著小于PS组，这说明PS组的阳性结果并不仅缘于PAG内c-fos的基础表达，也不是缘于单纯的铃声刺激，而是一种与听源性惊厥发作特异相关的变化。PAG背侧及背外侧亚区，尾侧段腹外侧亚区内有大量神经元参与了听源性惊厥的表达过程，尤其以背外侧亚区Fos阳性细胞最为密集，并几乎贯穿PAG首尾全长。目前已知PAG各亚区具有独特的功能特性和神经化学特性，如背外侧亚区介导血压升高，心率加快，奔跑，发声等积极的兴奋性防御行为[4]，同时此亚区又是PAG内各种兴奋性神经元及兴奋性氨基酸受体(包括谷氨酸能神经元和NMDA受体)分布密度最高的区域；而PAG尾侧段的腹外侧亚区则介导血压降低，心率减慢，静默状态(quiescence)等消极的抑制性的防御行为[4]，此区内GABA能神经元最为丰富而谷氨酸能神经元则较少[8～10]。以上迥然不同的功能及化学特性表明此两亚区内的Fos阳性神经元在听源性惊厥发作过程中的作用也可能不同。可以推测，PAG背外侧亚区表达c-fos的神经元可能参与了惊厥兴奋性的扩散过程，而尾侧段腹外侧亚区的Fos阳性神经元则可能参与惊厥兴奋性的终止过程。
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PAG背外侧亚区独特的化学特性还表现在它是PAG内唯一含有丰富一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)阳性神经元的区域[11]。PS组大鼠PAG内表达c-fos基因的神经元中很可能存在着一氧化氮(nitric oxide, NO)能神经元。NO作为一种神经递质(调质)在听源性惊厥中的作用，可能与其介导谷氨酸作用于NMDA受体导致的CGMP生成有关，CGMP作为胞内第二信使可直接或间接地改变细胞的功能状态，而恰好背外侧亚区又是PAG内兴奋性氨基酸受体激动剂，包括NMDA在内的结合位点密度最高的区域，并且含有丰富的谷氨酸能神经元；此外，PAG内的NO还可能通过那些与之共存的神经递质或调质之间的相互作用参与听源性惊厥的表达。
总之，听源性惊厥发作诱导PAG内大量神经元表达c-fos基因，揭示了PAG内神经元功能活动的剧烈改变，N’Gouemo[12]的电生理研究也发现，听源性惊厥易感大鼠PAG内许多神经元表现为异常的高反应性状态，而且出现与强直相关的神经元异常放电，这些都进一步说明PAG参与了听源性惊厥发作过程，但其中的神经化学机制尚需进一步探讨。
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图 版 说 明
图1～3 Fos阳性神经元在PS组大鼠PAG尾侧段(图1)、中段(图2)和首侧段(图3)各亚区内的分布 ×75
图4 PS组大鼠PAG中段背侧亚区和背外侧亚区内Fos阳性神经元的分布 ×150
Explanation of figures
Fig.1-3 The distribution of Fos-postive neurons in subdivisions of the caudal(Fig.1), middle(Fig.2),and rostral(Fig.3,)segments of PAG in PS rats ×75
Fig.4 The distribution of Fos-postive neurons in the dorsal subdivision and dorsolateral subdivision of the middle segment PAG of PS rats. ×150
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△ Department of anatomy, Beijing Medical University, Beijing 100083,China
参考文献
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[2]Simler S, Hirsch E, Danober L, et al. c-fos expression after single and kindled audiogenic seizures in Wistar rats. Neurosci Lett, 1994,175(1-2)：58
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收稿1998-12 修回1998-03, 百拇医药