六亚甲基双乙酰胺及其衍生物对人红白血病K562细胞的诱导分化作用*
作者：黄河 张世馥 刘群 周建平 章士伟 章静波
单位：黄河 张世馥 周建平 章静波(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 10005；刘群 章士伟(北京大学化学系 北京)
关键词：诱导分化；HMBA；HMBA-Ⅰ；HBMA-Ⅱ；人红白血病细胞K562
解剖学报990323
【摘要】 目的 探索HMBA及其衍生物HMBA-Ⅰ和HMBA-Ⅱ对人红白血病细胞系K562的诱导分化作用。 方法 细胞生长曲线绘制、集落形成试验，检测HMBA及其衍生物对细胞生长的影响，以Western blot检测p21、c-fos蛋白表达，以联苯胺染色显示血红蛋白。 结果 HMBA-Ⅰ，HMBA-Ⅱ呈现对K562细胞生长有不同程度的抑制作用，基因表达产物血红蛋白联苯胺染色呈阳性反应，p21、c-fos蛋白表达有不同程度的增高。 结论 HMBA-Ⅰ，HMBA-Ⅱ对K562有一定的诱导分化活性，作用机制可能与p21、c-fos表达增高有关。
, http://www.100md.com
EFFECT OF HMBA AND ITS DERIVATIVES ON THE
DIFFERENTIATION OF HUMAN LEUKEMIA K562 CELLS
Huang He, Zhang Shifu, Liu Qun*, Zhou Jianping, Zhang Shiwei*, Zhang Jingbo△
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences
Peking Union Medical College, Beijing; *The University of Peking)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To Study the differnetiation-inducing effect of HMBA and its derivatives HMBA-Ⅰ and HMBA-Ⅱ on K562 cells. Methods K562 cells were cultured and treated with HMBA and its derivatives. We studied their effect of inducing differentiation on K562 cells by benzidine staining and other methods often used. The c-fos, p21 gene expression were detected by Western blot, and cell cycle analyzed. Result It was revealed that both HMBA-Ⅰ,HMBA-Ⅱ as well as HMBA exerted growth inhibition effect on K562 cells and the expression of p21 and c-fos proteins were increased. Conclusion HMBA-Ⅰ and HMBA-Ⅱ as well as HBMA are potential cell differentiation inducers.
, http://www.100md.com
【Key words】 differentiation; HMBA; HMBA-Ⅰ;HMBA-Ⅱ;K562 cell
六亚甲基双乙酰胺(HMBA)为杂合极性化合物类的细胞分化诱导剂，可诱导小鼠红白血病细胞及某些其他细胞分化，在美国已进入Ⅱ期临床实验，但其剂量依赖性毒性使之还不能成为令人满意的临床抗肿瘤药物[1]。本实验旨在探索两种新型HMBA衍生物N，N’-双乙酰基-N，N’-双氨甲酰基乙基-1，6-己二胺(HMBA-Ⅰ)和N，N’-双乙酰基-N，N’-双羧乙基-1，6-己二胺二钠(HMBA-Ⅱ)作为细胞分化诱导剂的潜力及作用机制。实验以人红白血病(K562)细胞为靶细胞，观察HMBA及其衍生物对其生长速度，分裂指数，集落形成，血红蛋白的表达以及p21，c-fos蛋白表达的影响。结果提示，HMBA衍生物对细胞有不同程度的诱导分化作用。
材料和方法
1. 肿瘤细胞系
, 百拇医药
人K562细胞系源自美国ATCC，本室储存。用含10%小牛血清的DMEM培养基按常规培养条件进行培养。
2. HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ的来源
均为北京大学化学系合成，白色结晶，通过熔点，质谱及元素分析测定。
3. 细胞生长速度及分裂指数测定
按常规方法[2]，将5×104/ml细胞分别接种到96孔板，分别加入不同浓度的HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ，每组设8孔为平行实验。培养1、3、5、7d后，分别记数细胞，并绘制生长曲线，同时将细胞进行瑞氏染色，计算其分裂指数。
4. 成集落实验(colony-forming test)
, 百拇医药
成集落实验是检验肿瘤细胞恶性程度的标志之一，将105/ml细胞接种到1.3%甲基纤维素半固体培养基中，加入不同浓度的药物，5%CO2培养箱中培养14d后，显微镜下观察集落生长情况，40个细胞以上者为1个集落。
5. 联苯胺染色
将K562细胞与不同浓度的药物培养3d、5d、7d后，进行联苯胺染色，置光学显微镜下观察结果，联苯胺可显示血红蛋白的存在(蓝色)。
6. 流式细胞仪测定不同浓度的药物对细胞周期的影响
将培养至对数生长期的(105/ml)细胞分别与不同浓度的药物共孵育12、24h后，收集细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色30min，应用流式细胞仪进行测定，计算出各组细胞在细胞周期各时相(G1、S、G2+M)的分布情况。
, 百拇医药
图1 HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对细胞生长、分裂增殖的影响
Fig.1 Cell growth curve of K562 cells which were exposed to HMBA 10mmol/L,HMBA-Ⅰ 10mmol/L, HMBA-Ⅱ 10mmol/L for 1,3,5,7days.
7. Western blot方法[3]
用Western blot方法检测分化诱导剂对细胞p21、c-fos蛋白表达的影响。
结果和讨论
1. HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ诱导细胞分化活性比较
实验组联苯胺染色结果呈阳性(表1)，表明有珠蛋白基因表达产物血红蛋白的合成，证实上述3种药物均可诱导细胞合成正常的功能性蛋白。
, 百拇医药
表1 3种药物HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ诱导细胞分化5d后联苯胺染色结果
Table 1 Benzidine staining positive percentage of K562
cells which were exposed to different concentrations
of HMBA, HMBA-Ⅰ, HMBA-Ⅱ for 5 days. 药物
drug
浓度(concentration)
5 mmol/L
10 mmol/L
, 百拇医药
20 mmol/L
HMBA
27%
51%
78%
HMBA-Ⅰ
1%
3.3%
6.2%
HMBA-Ⅱ
1.8%
5.2%
24%
, 百拇医药
对照(control)
0
0
0
2. HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对细胞生长、分裂增殖的影响
图1为在10 mmol/L浓度下3种药物对K562细胞生长的影响，从图1中可看出与对照组相比，它们的生长较缓慢，其抑制的能力递次是HMBA，HMBA-Ⅱ，HMBA-Ⅰ。另外，我们的实验还显示HMBA最低有效浓度为2 mmol/L，而其他两种衍生物的最低有效浓度为5 mmol/L(未绘图显示)，这是否因HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ与HMBA结构有差异，其作用途径不同而导致诱导能力差异有待进一步验证。
同样，在10 mmol/L浓度下，分裂指数(表2)及集落形成数(图2)有很大的不同。该结果与生长曲线相一致。
, 百拇医药
3. 细胞周期的测定
我们比较了3种药物的最适浓度对K562细胞周期的影响，流式细胞仪之检测结果表明(表3)HMBA及其衍生物不同程度地抑制K562细胞从G1期向S期的转换，从而引起细胞周期分布的差异，其作用机制是否为抑制DNA合成，有否存在校准点(check point)的调控，与p21、p53、c-fos有何关系等均有待深入研究。
表2 HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对细胞分裂指数的影响Table 2 Cell mitosis index of K562 cells which were
exposed to HMBA, HMBA-Ⅰ,HMBA-Ⅱ for 5 day 药物
drug
浓度
, 百拇医药
concentration
分裂相数/细胞数
division/Cell number
分裂指数
mitosis index
对照(control)---
23/205
0.112
HMBA
10mmol/L
16/201
0.079
, 百拇医药
HMBA-Ⅱ
10mmol/L
17/198
0.085
HMBA-Ⅰ
10mmol/L
19/210
0.090
图2 HMBA-Ⅰ(a)、HMBA-Ⅱ(b)对细胞集落形成的影响，对照(c) ×400
Fig.2 The result of colony-forming test of K562 cells which were exposed to HMBA-Ⅰ 10mmol/L(a), HMBA-Ⅱ 10mmol/L(b), and the control(c)for 10 days. ×400
, 百拇医药
表3 HMBA及其衍生物对K562细胞周期(%)的影响
Table 3 Effect of HMBA, HMBA-Ⅰ,HMBA-Ⅱ on cell cycle progression.
合成前期(G1)
(%)
合成期(S)
(%)
合成后期(G2+M)
(%)
12h
24h
, http://www.100md.com
12h
24h
12h
24h
对照
(control)
37.9
26.2
52.5
73
9.6
0.8
HMBA 5mmol/L
, http://www.100md.com
38.8
43.0
37.4
46.4
23.8
10.6
HMBA-Ⅰ 10mmol/L
36.4
36.8
52.2
61.5
11.4
1.7
, 百拇医药
HMBA-Ⅱ 10mmol/L
42.9
35.8
53.5
62.3
3.6
1.9
4. HMBA及其衍生物对p21，c-fos蛋白表达的影响
Western blot结果表明(图3)p21、c-fos蛋白随着药物浓度增加而表达增高。c-fos是某些生长因子和分化诱导剂刺激后反应最早的早期应答基因(early response gene)之一，其编码的蛋白质为DNA结合蛋白，被认为是以第三信使的方式参与调控其他基因的表达[4]。p21为一种细胞周期调节蛋白依赖性激酶抑制因子，能与cdk4及其他的cdk结合并抑制它们的激酶活性，p21基因启动子区域内存在p53的结合位点，故p53可以诱导p21表达，阻止细胞进入增殖周期。对此今后尚需作补充证明。
, 百拇医药
图3 10mmol/L HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对p21、c-fos蛋白表达的影响
Fig.3 The effect of HMBA, HMBA-Ⅰ，HMBA-Ⅱ on
protein expression of p21，c-fos
以上结果表明，HMBA及其衍生物，作为细胞分化诱导剂，由于结构的差异而诱导活性略有不同。目前对于分化诱导剂的合成和研究正不断地深入，有些药物如HMBA虽已进入临床阶段，但由于体外的最适分化浓度不一定适合体内的生理条件，所以人们正致力于寻找高效、低毒的诱导分化药物。本实验基于上述目的，对HMBA及新合成的衍生物诱导分化活性进行了初步分析，虽然总体来说，新的衍生物与原形HMBA的诱导活性无明显差别，但我们的实验及其他实验提示，HMBA的结构可以改造，并仍可保持分化活性[5]，其作用机制可能通过某些与细胞周期进展的基因有关。因此，寻找更有效的HMBA衍生物仍有很大的应用前景。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.39870893)
Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 10005,China
参考文献
[1]Marks P A, Richon V M, Kiyokawa H, et al. Inducing differentiation of transformed cells with hybrid polar compounds: a cell cycle dependent process. PNAS USA, 1994,91:10251
[2]章静波，蔡有余，张世馥.《细胞生物学实用方法与技术》第2版，北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1995：52～53
, 百拇医药
[3]萨姆布鲁克 J， 弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T.《分子克隆实验指南》第2版，北京：科学出版社，1992：888～898
[4]Richon V M, Web Y, Merger R. Second generation hybrid polar compounds are potent inducers of transformed cell differentiation. PNAS USA, 1996 93:5705
[5]文芳，张世馥，周建平，等《一种新的HMBA衍生物N，N’-双乙酰基-N，N-双羧乙基-1，6己二胺对肿瘤细胞系诱导分化作用的研究》自然杂志，1998，20(4)：242
收稿1998-03 修回1998-11, 百拇医药
单位：黄河 张世馥 周建平 章静波(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 10005；刘群 章士伟(北京大学化学系 北京)
关键词：诱导分化；HMBA；HMBA-Ⅰ；HBMA-Ⅱ；人红白血病细胞K562
解剖学报990323
【摘要】 目的 探索HMBA及其衍生物HMBA-Ⅰ和HMBA-Ⅱ对人红白血病细胞系K562的诱导分化作用。 方法 细胞生长曲线绘制、集落形成试验，检测HMBA及其衍生物对细胞生长的影响，以Western blot检测p21、c-fos蛋白表达，以联苯胺染色显示血红蛋白。 结果 HMBA-Ⅰ，HMBA-Ⅱ呈现对K562细胞生长有不同程度的抑制作用，基因表达产物血红蛋白联苯胺染色呈阳性反应，p21、c-fos蛋白表达有不同程度的增高。 结论 HMBA-Ⅰ，HMBA-Ⅱ对K562有一定的诱导分化活性，作用机制可能与p21、c-fos表达增高有关。
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EFFECT OF HMBA AND ITS DERIVATIVES ON THE
DIFFERENTIATION OF HUMAN LEUKEMIA K562 CELLS
Huang He, Zhang Shifu, Liu Qun*, Zhou Jianping, Zhang Shiwei*, Zhang Jingbo△
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences
Peking Union Medical College, Beijing; *The University of Peking)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To Study the differnetiation-inducing effect of HMBA and its derivatives HMBA-Ⅰ and HMBA-Ⅱ on K562 cells. Methods K562 cells were cultured and treated with HMBA and its derivatives. We studied their effect of inducing differentiation on K562 cells by benzidine staining and other methods often used. The c-fos, p21 gene expression were detected by Western blot, and cell cycle analyzed. Result It was revealed that both HMBA-Ⅰ,HMBA-Ⅱ as well as HMBA exerted growth inhibition effect on K562 cells and the expression of p21 and c-fos proteins were increased. Conclusion HMBA-Ⅰ and HMBA-Ⅱ as well as HBMA are potential cell differentiation inducers.
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【Key words】 differentiation; HMBA; HMBA-Ⅰ;HMBA-Ⅱ;K562 cell
六亚甲基双乙酰胺(HMBA)为杂合极性化合物类的细胞分化诱导剂，可诱导小鼠红白血病细胞及某些其他细胞分化，在美国已进入Ⅱ期临床实验，但其剂量依赖性毒性使之还不能成为令人满意的临床抗肿瘤药物[1]。本实验旨在探索两种新型HMBA衍生物N，N’-双乙酰基-N，N’-双氨甲酰基乙基-1，6-己二胺(HMBA-Ⅰ)和N，N’-双乙酰基-N，N’-双羧乙基-1，6-己二胺二钠(HMBA-Ⅱ)作为细胞分化诱导剂的潜力及作用机制。实验以人红白血病(K562)细胞为靶细胞，观察HMBA及其衍生物对其生长速度，分裂指数，集落形成，血红蛋白的表达以及p21，c-fos蛋白表达的影响。结果提示，HMBA衍生物对细胞有不同程度的诱导分化作用。
材料和方法
1. 肿瘤细胞系
, 百拇医药
人K562细胞系源自美国ATCC，本室储存。用含10%小牛血清的DMEM培养基按常规培养条件进行培养。
2. HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ的来源
均为北京大学化学系合成，白色结晶，通过熔点，质谱及元素分析测定。
3. 细胞生长速度及分裂指数测定
按常规方法[2]，将5×104/ml细胞分别接种到96孔板，分别加入不同浓度的HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ，每组设8孔为平行实验。培养1、3、5、7d后，分别记数细胞，并绘制生长曲线，同时将细胞进行瑞氏染色，计算其分裂指数。
4. 成集落实验(colony-forming test)
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成集落实验是检验肿瘤细胞恶性程度的标志之一，将105/ml细胞接种到1.3%甲基纤维素半固体培养基中，加入不同浓度的药物，5%CO2培养箱中培养14d后，显微镜下观察集落生长情况，40个细胞以上者为1个集落。
5. 联苯胺染色
将K562细胞与不同浓度的药物培养3d、5d、7d后，进行联苯胺染色，置光学显微镜下观察结果，联苯胺可显示血红蛋白的存在(蓝色)。
6. 流式细胞仪测定不同浓度的药物对细胞周期的影响
将培养至对数生长期的(105/ml)细胞分别与不同浓度的药物共孵育12、24h后，收集细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色30min，应用流式细胞仪进行测定，计算出各组细胞在细胞周期各时相(G1、S、G2+M)的分布情况。
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图1 HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对细胞生长、分裂增殖的影响
Fig.1 Cell growth curve of K562 cells which were exposed to HMBA 10mmol/L,HMBA-Ⅰ 10mmol/L, HMBA-Ⅱ 10mmol/L for 1,3,5,7days.
7. Western blot方法[3]
用Western blot方法检测分化诱导剂对细胞p21、c-fos蛋白表达的影响。
结果和讨论
1. HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ诱导细胞分化活性比较
实验组联苯胺染色结果呈阳性(表1)，表明有珠蛋白基因表达产物血红蛋白的合成，证实上述3种药物均可诱导细胞合成正常的功能性蛋白。
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表1 3种药物HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ诱导细胞分化5d后联苯胺染色结果
Table 1 Benzidine staining positive percentage of K562
cells which were exposed to different concentrations
of HMBA, HMBA-Ⅰ, HMBA-Ⅱ for 5 days. 药物
drug
浓度(concentration)
5 mmol/L
10 mmol/L
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20 mmol/L
HMBA
27%
51%
78%
HMBA-Ⅰ
1%
3.3%
6.2%
HMBA-Ⅱ
1.8%
5.2%
24%
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对照(control)
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2. HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对细胞生长、分裂增殖的影响
图1为在10 mmol/L浓度下3种药物对K562细胞生长的影响，从图1中可看出与对照组相比，它们的生长较缓慢，其抑制的能力递次是HMBA，HMBA-Ⅱ，HMBA-Ⅰ。另外，我们的实验还显示HMBA最低有效浓度为2 mmol/L，而其他两种衍生物的最低有效浓度为5 mmol/L(未绘图显示)，这是否因HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ与HMBA结构有差异，其作用途径不同而导致诱导能力差异有待进一步验证。
同样，在10 mmol/L浓度下，分裂指数(表2)及集落形成数(图2)有很大的不同。该结果与生长曲线相一致。
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3. 细胞周期的测定
我们比较了3种药物的最适浓度对K562细胞周期的影响，流式细胞仪之检测结果表明(表3)HMBA及其衍生物不同程度地抑制K562细胞从G1期向S期的转换，从而引起细胞周期分布的差异，其作用机制是否为抑制DNA合成，有否存在校准点(check point)的调控，与p21、p53、c-fos有何关系等均有待深入研究。
表2 HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对细胞分裂指数的影响Table 2 Cell mitosis index of K562 cells which were
exposed to HMBA, HMBA-Ⅰ,HMBA-Ⅱ for 5 day 药物
drug
浓度
, 百拇医药
concentration
分裂相数/细胞数
division/Cell number
分裂指数
mitosis index
对照(control)---
23/205
0.112
HMBA
10mmol/L
16/201
0.079
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HMBA-Ⅱ
10mmol/L
17/198
0.085
HMBA-Ⅰ
10mmol/L
19/210
0.090
图2 HMBA-Ⅰ(a)、HMBA-Ⅱ(b)对细胞集落形成的影响，对照(c) ×400
Fig.2 The result of colony-forming test of K562 cells which were exposed to HMBA-Ⅰ 10mmol/L(a), HMBA-Ⅱ 10mmol/L(b), and the control(c)for 10 days. ×400
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表3 HMBA及其衍生物对K562细胞周期(%)的影响
Table 3 Effect of HMBA, HMBA-Ⅰ,HMBA-Ⅱ on cell cycle progression.
合成前期(G1)
(%)
合成期(S)
(%)
合成后期(G2+M)
(%)
12h
24h
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12h
24h
12h
24h
对照
(control)
37.9
26.2
52.5
73
9.6
0.8
HMBA 5mmol/L
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38.8
43.0
37.4
46.4
23.8
10.6
HMBA-Ⅰ 10mmol/L
36.4
36.8
52.2
61.5
11.4
1.7
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HMBA-Ⅱ 10mmol/L
42.9
35.8
53.5
62.3
3.6
1.9
4. HMBA及其衍生物对p21，c-fos蛋白表达的影响
Western blot结果表明(图3)p21、c-fos蛋白随着药物浓度增加而表达增高。c-fos是某些生长因子和分化诱导剂刺激后反应最早的早期应答基因(early response gene)之一，其编码的蛋白质为DNA结合蛋白，被认为是以第三信使的方式参与调控其他基因的表达[4]。p21为一种细胞周期调节蛋白依赖性激酶抑制因子，能与cdk4及其他的cdk结合并抑制它们的激酶活性，p21基因启动子区域内存在p53的结合位点，故p53可以诱导p21表达，阻止细胞进入增殖周期。对此今后尚需作补充证明。
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图3 10mmol/L HMBA、HMBA-Ⅰ、HMBA-Ⅱ对p21、c-fos蛋白表达的影响
Fig.3 The effect of HMBA, HMBA-Ⅰ，HMBA-Ⅱ on
protein expression of p21，c-fos
以上结果表明，HMBA及其衍生物，作为细胞分化诱导剂，由于结构的差异而诱导活性略有不同。目前对于分化诱导剂的合成和研究正不断地深入，有些药物如HMBA虽已进入临床阶段，但由于体外的最适分化浓度不一定适合体内的生理条件，所以人们正致力于寻找高效、低毒的诱导分化药物。本实验基于上述目的，对HMBA及新合成的衍生物诱导分化活性进行了初步分析，虽然总体来说，新的衍生物与原形HMBA的诱导活性无明显差别，但我们的实验及其他实验提示，HMBA的结构可以改造，并仍可保持分化活性[5]，其作用机制可能通过某些与细胞周期进展的基因有关。因此，寻找更有效的HMBA衍生物仍有很大的应用前景。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助课题(No.39870893)
Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 10005,China
参考文献
[1]Marks P A, Richon V M, Kiyokawa H, et al. Inducing differentiation of transformed cells with hybrid polar compounds: a cell cycle dependent process. PNAS USA, 1994,91:10251
[2]章静波，蔡有余，张世馥.《细胞生物学实用方法与技术》第2版，北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1995：52～53
, 百拇医药
[3]萨姆布鲁克 J， 弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T.《分子克隆实验指南》第2版，北京：科学出版社，1992：888～898
[4]Richon V M, Web Y, Merger R. Second generation hybrid polar compounds are potent inducers of transformed cell differentiation. PNAS USA, 1996 93:5705
[5]文芳，张世馥，周建平，等《一种新的HMBA衍生物N，N’-双乙酰基-N，N-双羧乙基-1，6己二胺对肿瘤细胞系诱导分化作用的研究》自然杂志，1998，20(4)：242
收稿1998-03 修回1998-11, 百拇医药