活性维生素D对卵巢切除大鼠骨转换与骨质量的影响
作者：包方 李东 薛延 孙葆明 王芊 颜卉君
单位：包方 李东 薛延 孙葆明 王芊(北京市创伤骨科研究所生化研究室，骨与关节病研究中心，北京 100036)；颜卉君(北京师范大学生物系)
关键词：去卵巢大鼠；1αOHD3；骨转换；生物力学；骨形态计量学；骨粘连蛋白
解剖学报990422 【摘要】 目的 研究1αOHD3对骨质疏松的预防治疗效果和作用机理。 方法 将40只雌性Wistar大鼠分为4组，以切除卵巢大鼠为模型，分别用0.04 μg/kg.d和0.5 μg/kg.d 1αOHD3灌胃给药12周。测定各组大鼠的血、尿生化指标，骨密度，生物力学和形态计量学等参数，以及骨粘连蛋白基因的表达水平。 结果 切除卵巢大鼠骨吸收和骨形成显著加强，骨密度明显降低，骨小梁结构恶化，骨生物力学性质显著降低。1αOHD3使大鼠骨量恢复，骨密度提高，骨小梁相对体积(TBV)增大，并使骨生物力学性质明显提高。0.5 μg/kg.d 1αOHD3对骨生物力学的效果优于0.04 μg/kg.d 1αOHD3的给药量。不同浓度1αOHD3对骨形成与骨吸收的作用不同：0.5 μg/kg.d 1αOHD3明显抑制骨转换；0.04 μg/kg.d 1αOHD3则促进骨转换。1αOHD3的浓度对骨的矿化速率无显著影响。大鼠去卵巢后，骨粘连蛋白(osteonectin, ON)mRNA表达水平降低，0.5 μg/kg.d 1αOHD3处理可恢复并促进ON mRNA表达。 结论 1αOHD3有明显增加骨密度和骨强度的作用。高浓度1αOHD3抑制骨转换，低浓度的1αOHD3促进骨转换和ON mRNA表达。
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EFFECTS OF 1αOHD3 ON THE BONE TURNOVER AND
QUALITY IN OVARIECTOMIZED RATS
Bao Fang, Li Dong, Xue Yan△, Sun Baoming, Wang Qian， Yan Huijun
(Laboratory of Biochemistry, Jishuitan Hospital, Beijing; Department of Biology,Beijing Normal University, Beijing)
【Abstract】 Objective To investigate mechanisms of prevention and treatment of osteoporosis using 1αOHD3. Methods Forty female Wistar rats(3 months old) were divided into two groups, sham operated(sham) and ovariectomized. 1αOHD3 was given orally at the dose of 0.5 μg/kg.d and 0.04 μg/kg.d for 12 weeks, respectively. At the end of the experiments, serum levels of bone gel protein(BGP) and estrogen were determined by ELISA, serum alkaline phosphatase(ALP), calcium(Ca),phosphatase, tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) and urinary creatinine (Cr), hydroxyproline(HOP) and urinary Ca were determined by chemical method. Mechanical parameters for femur fracture in a three-point bending test, histomorphometric parameters and the expression of osteonectin(ON) mRNA were measured.Results Ovariectomy increased bone formation and resorption and decreased bone mineral density(BMD) of the femur and the 4th lumbar vertebra and decreased the mechanical parameters of trabecular significantly. After administration of 1αOHD3, the bone loss decreased while BMD, BV/TV(trabecular bone volume) and mechanical parameters increased. There was a more effective improvement of mechanical parameters in 0.5 μg/kg.d 1αOHD3 group than that in 0.04 μg/kg.d 1αOHD3 group. The former group inhibited bone turnover significantly, while the later group significantly stimulated bone turnover. There was no significant effect on mineral apposition rate(MAR) after treatment. The expression of ON mRNA increased after 0.04 μg/kg.d 1αOHD3 treatment.Conclusion 1αOHD3 could significantly improve the BMD and bone strength. The former group inhibited bone turnover significantly, while the later group significantly stimulated bone turnover.
, 百拇医药
【Key words】 Ovariectomized rats; 1αOHD3; Bone turnover; Biomechanism; Histomorphometry; Osteonectin
维生素D(vitamin D, VD)对于维持骨的正常代谢与矿化具有重要作用。一般认为绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)与1α、25(OH)2D3合成中的关键酶、25羟1α羟化酶的继发性水平降低有关。因此用维生素D治疗骨质疏松症的策略日益得到重视。
活性维生素D作为一种具有广泛生理活性的激素类物质，其作用机理十分复杂。当前对于活性维生素D作用机理的研究主要集中于细胞水平，而整体水平的研究相对薄弱。在维生素D对骨吸收与骨形成的影响方面，体内与体外的研究结果不尽一致。只有从整体上考察活性维生素D对骨代谢的作用，及其对骨质量的最终影响，才能更好地与临床相联系，为维生素D的临床应用提供理论依据。
, 百拇医药
材料和方法
实验动物为3月龄雌性Wistar大鼠(合格证书：医动字第01-3008)，体重231.6±16.0g。自然光照，自由饮水、取食。饲料含钙0.32%，磷0.17%。动物实验设施合格[京动管准字(1996)第006号]。
将大鼠分为4组，每组10只：(1)假手术组(sham operated, sham)：打开腹腔，找出卵巢但不切除；(2) 去卵巢组(ovariectomized, OVX):腹部双侧切除卵巢；(3) 1αOHD3 高剂量组(high dose of 1αOHD3, DH)去卵巢后，以0.5 μg/kg.d 1αOHD3的剂量灌胃12周；(4) 1αOHD3低剂量组(low dose of 1αOHD3,DL)，去卵巢后，以0.04 μg/kg.d 1αOHD3的剂量灌胃12周。
, 百拇医药
在处死大鼠前12d及前1d以0.1 ml/100g体重的剂量腹腔注射0.5%荧光素水溶液。处死前1d用代谢笼收集24h尿液。处死前眼眶取血，收集血清-20℃保存。剥取下肢骨液氮保存，第2～3节腰椎(L2～3)福尔马林液固定，第4～6节腰椎(L4～6)浸于生理盐水中，-20℃保存。
测定血尿各项生化指标：(1) 血清碱性磷酸酶(serum alkaline phosphatase,ALP)以磷酸苯二钠为底物，高铁氯化钾显色，510 nm比色；(2)钙、磷、肌酐(creatinine,Cr)用北京中生生物技术公司试剂盒测定；(3)血清骨钙素(bone Gla protein, BGP)用丹麦Osteometer A/S公司酶标试剂盒测定；(4)血清雌二醇(estrodiol,E2)用比利时Biosource公司酶标试剂盒测定。
骨生物力学与形态计量学指标：取第4腰椎用浮力法测骨密度；参照崔伟等[1]方法，用右股骨在流变仪上做三点弯曲实验测算生物力参数，加载速度6 mm/min，跨距22 mm;用第2～3腰椎制备不脱钙切片，OptionⅢRS多功能显微镜下计数，计算形态计量学指标(参照郑丰裕等[2]方法)。
, 百拇医药
参照Chomczynski P等[3]方法，从右股骨中提取总RNA。取20 μg RNA倍比稀释3次，热变性后点于硝酸纤维素膜上。以α-P32-dCTP标记的1.9 kb ON cDNA片段(Yong MF教授惠赠)为探针进行杂交。方法见《分子克隆实验指南》[4]，杂交温度42℃。
统计处理，各组数据用均值±标准误(
±s)表示，t检验比较差异：P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著。
结 果
1. 血清与尿生化指标
OVX组血清E2浓度较Sham组显著降低(P<0.01)，血钙、磷、BGP、ALP和尿Ca/Cr等指标与sham组无显著差异；DH组：血清E2浓度与sham组无显著差异，而明显高于OVX组(P<0.01)，血钙和尿Ca/Cr显著高于OVX组(P<0.05)，BGP显著低于OVX组(P<0.01)；DL组：血清E2浓度显著低于sham组和OVX组(P<0.01)，血钙、BGP和ALP显著高于OVX组(P<0.05)，见表1。
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表1 血清及尿生化指标
Table 1 The level of serum and urinary biochemical markers 组别
group
雌二醇(ng/L)
E2
血钙(mmol/L)
Ca
血磷(mmol/L)
P
骨钙素(μg/L)
BGP
, 百拇医药
碱性磷酸酶(mg/L)
ALP
尿钙/肌酐
Ca/Cr
假手术 sham
94.4±4.72
2.12±0.08
1.46±0.13
12.8±1.42
2.37±0.19
0.08±0.02
去卵巢(OVX)
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87.6±5.59b
2.20±0.12
1.47±0.29
14.1±0.59
2.42±0.30
0.10±0.02
1αOHD3高剂量
high-dose 1αOHD3
98.6±6.62d
2.36±0.08bd
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1.49±0.29
11.8±0.52d
3.07±0.32
0.38±0.05bc
1αOHD3低剂量
low-dose 1αOHD3
77.3±4.58bd
3.00±0.20bd
1.39±0.06
14.7±0.72a
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3.49±0.36ac
0.14±0.02a
与sham组比较(compared with sham group):a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group): c,P<0.05，d,P<0.01
2. 股骨与第4腰椎骨密度
OVX组股骨与第4腰椎(L4)骨密度显著低于sham组(P<0.05)；DH与DL组骨密度显著高于OVX组，见表2。
表2 股骨生物力学参数
Table 2 Biomechanical parameters of femur 组别
, 百拇医药
group
最大载荷(N)
max of load
最大桡度(mm)
max of deformation
最大应力(MPa)
max of stress
最大应变
max of strain
结构硬度
structure rigidity
, 百拇医药
弹性模量
elastic modulus
弯曲硬度
bending rigidity
变形位能(N.mm)
energy at proportional limited
假手术(sham)
116±4.2
0.63±0.10
275±10.8
0.018±0.001
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260±21.0
18744±896
57746±4660
16.1±0.56
去卵巢(OVX)
99±3.9b
0.54±0.05a
245±15.2b
0.017±0.001
225±13.1b
17799±580
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49832±2905b
15.5±1.30
1αOHD3高剂量DH(high-dose 1αOHD3)
119±5.8d
0.64±0.04d
300±11.6bd
0.020±0.001bd
230±20.2b
18 563±1 287
, 百拇医药
53106±4566
16.1±0.70
1αOHD3低剂量DL(low-dose 1αOHD3)
111±3.6ad
0.62±0.04c
247±14.6b
0.021±0.001bd
235±17.8a
15 589±1 295bc
, 百拇医药
52206±3937a
15.5±1.73
与sham组比较(compared with sham group): a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group):c,P<0.05，d,P<0.01
3. 骨生物力学参数
OVX组股骨各项生物力学参数均低于sham组，其中最大载荷、最大桡度、弹性载荷、最大应力、弹性应变、结构硬度和弯曲硬度值显著低于sham组(P<0.05)；DH组和DL组最大载荷、最大桡度、最大应力、最大应变、弹性应变值显著高于OVX组(P<0.05)，其他参数略高但不显著(表3)。
, http://www.100md.com 表3 股骨与第4腰椎骨密度值
Table 3 Bone mineral density of femur and the fourth lumbar vertebrae 组别
group
股骨干重(g)
dry weight of femur
股骨骨密度(g/cm3)
BMD of femur
L4干重(g)
dry weight of L4
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L4骨密度(g/cm3)
BMD 0f L4
假手术(sham)
0.552±0.04
1.72±0.04
0.122±0.003
1.95±0.05
去卵巢(OVX)
0.456±0.10a
1.57±0.13a
, 百拇医药
0.115±0.002b
1.67±0.02b
1αOHD3高剂量
high-dose 1αOHD3
0.511±0.06
1.72±0.06c
0.126±0.005d
1.77±0.05bd
1αOHD3低剂量
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low-dose 1αOHD3
0.512±0.04
1.71±0.04c
0.122±0.004d
1.73±0.03bd
与sham组比较(compared with sham group): a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group):c，P<0.05，d，P<0.01
4. 腰椎形态计量学指标
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OVX组骨小梁相对体积(BV/TV)明显低于sham组(P<0.01)；骨小梁吸收表面(ES/BS)、骨小梁形成表面(MS/BS)和矿化速率(MAR)显著高于sham组(P<0.01)。DH组骨小梁相对体积显著高于OVX组(P<0.01)，骨小梁吸收表面和骨小梁形成表面明显低于OVX组(P<0.01)，矿化速率与OVX无显著差异；DL组的骨小梁相对体积、骨小梁吸收表面、骨小梁形成表面明显高于OVX组，矿化速率与OVX无显著差异；各组骨小梁相对宽度(MTT)无显著差异(表4)。
表4 骨形态计量学参数
Table 4 Histomorphometric parameters of the third lumbar vertebrae 组别
group
骨小梁相对体积(%)
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BV/TV
骨小梁相对宽度
(μm)BV/BS
吸收表面(%)
ES/BS
形成表面(%)
MS/BS
矿化速率(μm/d)
MAR
假手术 sham
36.62±1.63
37.68±0.83
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4.68±1.57
6.81±1.70
5.04±0.39
去卵巢 OVX
26.55±1.24b
32.64±1.64a
7.02±1.53a
18.69±3.06b
6.09±0.43
1αOHD3高剂量
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high-dose 1αOHD3
35.25±3.04d
36.94±1.73d
4.35±2.17c
4.53±1.53ad
5.99±0.43
1αOHD3低剂量
low-dose 1αOHD3
33.68±2.84ad
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51.4±1.53bd
17.35±4.61bd
26.53±7.71bd
5.98±0.32
与Sham组比较(compared with sham group): a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group):c，P<0.05，d，P<0.01
5. 骨粘连蛋白(ON)mRNA表达水平
以ON cDNA为探针，对大鼠股骨、胫骨总RNA作斑点杂交，结果如图1所示：OVX组ON mRNA表达较sham组略有降低，DH与sham组相比无明显变化，DL组表达加强。
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附图 骨粘连蛋白mRNA斑点杂交
Figure mRNA Dot blotting of ON mRNA.
1.sham 2.OVX 3.DH 4.DL
讨 论
去卵巢(OVX)大鼠是目前公认的妇女绝经后骨质疏松症(PMOP)动物模型。去卵巢大鼠所发生的骨丢失情况与PMOP引起的骨丢失有许多共同之处[5]。因此，可用该模型对骨质疏松治疗药物与方案进行初步评价。
实验结果显示，OVX大鼠模型组血清雌二醇(E2)浓度与骨密度显著低于sham组，这证明去势手术及动物模型造模成功，因为血清雌二醇(E2)水平降低和骨量减少符合绝经后骨质疏松症的特点。并且高剂量组用药量相当于生理剂量的60倍，而病理检查未见心、肾等器官发生异位钙化。
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一般认为1αOHD3是骨转换的双向调节激素。本研究发现浓度影响1αOHD3的作用效果。处理12周后，1αOHD3高剂量组(DH)血清中BGP浓度下降，1αOHD3低剂量组(DL)BGP浓度上升；骨形态计量学测量显示DH组大鼠第2，3腰椎骨形成表面(MS/BS)显著低于OVX组(P<0.01)，而DL组MS/BS显著高于OVX组。说明在体内，高剂量1αOHD3抑制骨形成，低剂量1αOHD3则促进骨形成。骨形态计量学显示，DH组骨吸收表面(ES/BS)显著低于OVX组，而DL组显著高于OVX。提示高剂量1αOHD3抑制骨吸收和骨转换，低剂量促进骨吸收与骨转换。
此外，OVX组血清雌二醇(E2)浓度显著低于sham组，DH组血清雌二醇浓度恢复到sham组水平，而低剂量组血清雌二醇浓度却低于OVX对照组。此现象以前未见有报道，我们推测这是由于不同剂量1αOHD3对E2代谢有不同调节作用。Tanakaba[6]报道，绝经后妇女体内保持相当水平的肾上腺雄性激素，可以在芳香化酶(aromatase)催化下转变为雌激素，而1α，25(OH)2D3间接促进并维持这种酶基因的表达，提示活性VD有可能间接调节雌激素的合成。但这一推测尚需进一步研究证明。
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活性VD处理后，大鼠骨密度显著高于OVX组。同时DH与DL组骨形态计量学指标较OVX组也有所改善。股骨生物力学性质也明显提高，特别是股骨最大载荷显著提高，说明其抗骨折能力加强。其中高剂量组骨结构力学性质(结构硬度、弹性模量、弯曲硬度等)得到全面改善，效果优于低剂量组。
骨粘连蛋白(ON)是骨基质中主要的非胶原蛋白之一，在发育的骨的矿化部分中ON可占到非胶原蛋白总量的10%～15%。ON蛋白质结构高度保守，提示其在进化过程中具有重要作用。但ON的生理作用目前尚不十分清楚。通常认为ON参与起始矿化[7]，但也有相反的证据[8]。免疫组织化学检测发现，ON在矿化和骨再建的组织中表达水平较高，具有组织特异性[9，10]，提示它可能参与骨再建作用的调节。我们的目的是通过病理与正常条件下ON在mRNA水平表达的差异来探讨ON这一重要的骨基质蛋白是否与骨重建及矿化有关。结果显示，与正常对照组相比，去势后大鼠股骨中ON表达有所下降，用活性VD处理可恢复其表达水平。根据ON在矿化组织特异性的表达，我们推测：去卵巢导致骨重建负平衡，使矿化组织减少，从而降低了ON的表达水平；而活性VD处理使骨重建与矿化作用得以恢复。这说明ON的表达与骨重建和矿化有关，印证了ON参与骨重建和矿化作用的猜测。
, http://www.100md.com
△ Laboratory of Biochemistry, Jishuitan Hospital, Beijing 100035，China
参考文献
1 崔伟，刘成林，史之桢，等.卵巢切除大鼠血清甲状旁腺、降钙素变化与骨质量降低.中国骨质疏松杂志，1996，2(2)：22
2 郑丰裕，党耕町.单纯或联合应用雌激素、钙、氟化钠防止去势后雌性大鼠骨丢失的实验研究.中华骨科杂志，1995，15(5)：266
3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem,1987，162(8)：156
, 百拇医药
4 萨姆布鲁克 J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南，北京：科学出版社，1992：372
5 Kalu DN. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone Mineral,1991,15(3):175
6 Tanaka S, Haji M, Takayangi R, et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 enhances the enzymatic activity and expression of the messager ribonucleic acid for aromatase cytochrome 450 synergistically with dexamethasone depending on the vitamin D receptor level in cultured human osteoblasts. Endocrinology,1996,137(suppl):1860
, 百拇医药
7 Fisher LW, Termine JD, Noncollagen protein influencing the local mechanisms of calcification. Clin Orthop,1985,200(2)：362
8 Romberg RW, Werness PG, Riggs B L, et al. Inhibition of hydroxyapatite crystal growth by bone-specfic and other calcium-binding proteins. Biochemistry 1986,25(5)：1176
9 Bianco P, Silvestrini G, Termine JD, et al, Immunohistochemical localization of osteonectin in developing human and calf bone using monoclonal antibody. Calcif Tissue Int,1988，43(1)：155
10 Pacific M,Oshima D, Fisher LW, et al. Changes in osteonectin distribution and levels are associated with mineralization of the chicken tibial growth cartilage. Calcif Tissue Int,1990，47(1)：51
收稿1998-05 修回1998-11, http://www.100md.com
单位：包方 李东 薛延 孙葆明 王芊(北京市创伤骨科研究所生化研究室，骨与关节病研究中心，北京 100036)；颜卉君(北京师范大学生物系)
关键词：去卵巢大鼠；1αOHD3；骨转换；生物力学；骨形态计量学；骨粘连蛋白
解剖学报990422 【摘要】 目的 研究1αOHD3对骨质疏松的预防治疗效果和作用机理。 方法 将40只雌性Wistar大鼠分为4组，以切除卵巢大鼠为模型，分别用0.04 μg/kg.d和0.5 μg/kg.d 1αOHD3灌胃给药12周。测定各组大鼠的血、尿生化指标，骨密度，生物力学和形态计量学等参数，以及骨粘连蛋白基因的表达水平。 结果 切除卵巢大鼠骨吸收和骨形成显著加强，骨密度明显降低，骨小梁结构恶化，骨生物力学性质显著降低。1αOHD3使大鼠骨量恢复，骨密度提高，骨小梁相对体积(TBV)增大，并使骨生物力学性质明显提高。0.5 μg/kg.d 1αOHD3对骨生物力学的效果优于0.04 μg/kg.d 1αOHD3的给药量。不同浓度1αOHD3对骨形成与骨吸收的作用不同：0.5 μg/kg.d 1αOHD3明显抑制骨转换；0.04 μg/kg.d 1αOHD3则促进骨转换。1αOHD3的浓度对骨的矿化速率无显著影响。大鼠去卵巢后，骨粘连蛋白(osteonectin, ON)mRNA表达水平降低，0.5 μg/kg.d 1αOHD3处理可恢复并促进ON mRNA表达。 结论 1αOHD3有明显增加骨密度和骨强度的作用。高浓度1αOHD3抑制骨转换，低浓度的1αOHD3促进骨转换和ON mRNA表达。
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EFFECTS OF 1αOHD3 ON THE BONE TURNOVER AND
QUALITY IN OVARIECTOMIZED RATS
Bao Fang, Li Dong, Xue Yan△, Sun Baoming, Wang Qian， Yan Huijun
(Laboratory of Biochemistry, Jishuitan Hospital, Beijing; Department of Biology,Beijing Normal University, Beijing)
【Abstract】 Objective To investigate mechanisms of prevention and treatment of osteoporosis using 1αOHD3. Methods Forty female Wistar rats(3 months old) were divided into two groups, sham operated(sham) and ovariectomized. 1αOHD3 was given orally at the dose of 0.5 μg/kg.d and 0.04 μg/kg.d for 12 weeks, respectively. At the end of the experiments, serum levels of bone gel protein(BGP) and estrogen were determined by ELISA, serum alkaline phosphatase(ALP), calcium(Ca),phosphatase, tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) and urinary creatinine (Cr), hydroxyproline(HOP) and urinary Ca were determined by chemical method. Mechanical parameters for femur fracture in a three-point bending test, histomorphometric parameters and the expression of osteonectin(ON) mRNA were measured.Results Ovariectomy increased bone formation and resorption and decreased bone mineral density(BMD) of the femur and the 4th lumbar vertebra and decreased the mechanical parameters of trabecular significantly. After administration of 1αOHD3, the bone loss decreased while BMD, BV/TV(trabecular bone volume) and mechanical parameters increased. There was a more effective improvement of mechanical parameters in 0.5 μg/kg.d 1αOHD3 group than that in 0.04 μg/kg.d 1αOHD3 group. The former group inhibited bone turnover significantly, while the later group significantly stimulated bone turnover. There was no significant effect on mineral apposition rate(MAR) after treatment. The expression of ON mRNA increased after 0.04 μg/kg.d 1αOHD3 treatment.Conclusion 1αOHD3 could significantly improve the BMD and bone strength. The former group inhibited bone turnover significantly, while the later group significantly stimulated bone turnover.
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【Key words】 Ovariectomized rats; 1αOHD3; Bone turnover; Biomechanism; Histomorphometry; Osteonectin
维生素D(vitamin D, VD)对于维持骨的正常代谢与矿化具有重要作用。一般认为绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)与1α、25(OH)2D3合成中的关键酶、25羟1α羟化酶的继发性水平降低有关。因此用维生素D治疗骨质疏松症的策略日益得到重视。
活性维生素D作为一种具有广泛生理活性的激素类物质，其作用机理十分复杂。当前对于活性维生素D作用机理的研究主要集中于细胞水平，而整体水平的研究相对薄弱。在维生素D对骨吸收与骨形成的影响方面，体内与体外的研究结果不尽一致。只有从整体上考察活性维生素D对骨代谢的作用，及其对骨质量的最终影响，才能更好地与临床相联系，为维生素D的临床应用提供理论依据。
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材料和方法
实验动物为3月龄雌性Wistar大鼠(合格证书：医动字第01-3008)，体重231.6±16.0g。自然光照，自由饮水、取食。饲料含钙0.32%，磷0.17%。动物实验设施合格[京动管准字(1996)第006号]。
将大鼠分为4组，每组10只：(1)假手术组(sham operated, sham)：打开腹腔，找出卵巢但不切除；(2) 去卵巢组(ovariectomized, OVX):腹部双侧切除卵巢；(3) 1αOHD3 高剂量组(high dose of 1αOHD3, DH)去卵巢后，以0.5 μg/kg.d 1αOHD3的剂量灌胃12周；(4) 1αOHD3低剂量组(low dose of 1αOHD3,DL)，去卵巢后，以0.04 μg/kg.d 1αOHD3的剂量灌胃12周。
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在处死大鼠前12d及前1d以0.1 ml/100g体重的剂量腹腔注射0.5%荧光素水溶液。处死前1d用代谢笼收集24h尿液。处死前眼眶取血，收集血清-20℃保存。剥取下肢骨液氮保存，第2～3节腰椎(L2～3)福尔马林液固定，第4～6节腰椎(L4～6)浸于生理盐水中，-20℃保存。
测定血尿各项生化指标：(1) 血清碱性磷酸酶(serum alkaline phosphatase,ALP)以磷酸苯二钠为底物，高铁氯化钾显色，510 nm比色；(2)钙、磷、肌酐(creatinine,Cr)用北京中生生物技术公司试剂盒测定；(3)血清骨钙素(bone Gla protein, BGP)用丹麦Osteometer A/S公司酶标试剂盒测定；(4)血清雌二醇(estrodiol,E2)用比利时Biosource公司酶标试剂盒测定。
骨生物力学与形态计量学指标：取第4腰椎用浮力法测骨密度；参照崔伟等[1]方法，用右股骨在流变仪上做三点弯曲实验测算生物力参数，加载速度6 mm/min，跨距22 mm;用第2～3腰椎制备不脱钙切片，OptionⅢRS多功能显微镜下计数，计算形态计量学指标(参照郑丰裕等[2]方法)。
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参照Chomczynski P等[3]方法，从右股骨中提取总RNA。取20 μg RNA倍比稀释3次，热变性后点于硝酸纤维素膜上。以α-P32-dCTP标记的1.9 kb ON cDNA片段(Yong MF教授惠赠)为探针进行杂交。方法见《分子克隆实验指南》[4]，杂交温度42℃。
统计处理，各组数据用均值±标准误(
±s)表示，t检验比较差异：P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著。结 果
1. 血清与尿生化指标
OVX组血清E2浓度较Sham组显著降低(P<0.01)，血钙、磷、BGP、ALP和尿Ca/Cr等指标与sham组无显著差异；DH组：血清E2浓度与sham组无显著差异，而明显高于OVX组(P<0.01)，血钙和尿Ca/Cr显著高于OVX组(P<0.05)，BGP显著低于OVX组(P<0.01)；DL组：血清E2浓度显著低于sham组和OVX组(P<0.01)，血钙、BGP和ALP显著高于OVX组(P<0.05)，见表1。
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表1 血清及尿生化指标
Table 1 The level of serum and urinary biochemical markers 组别
group
雌二醇(ng/L)
E2
血钙(mmol/L)
Ca
血磷(mmol/L)
P
骨钙素(μg/L)
BGP
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碱性磷酸酶(mg/L)
ALP
尿钙/肌酐
Ca/Cr
假手术 sham
94.4±4.72
2.12±0.08
1.46±0.13
12.8±1.42
2.37±0.19
0.08±0.02
去卵巢(OVX)
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87.6±5.59b
2.20±0.12
1.47±0.29
14.1±0.59
2.42±0.30
0.10±0.02
1αOHD3高剂量
high-dose 1αOHD3
98.6±6.62d
2.36±0.08bd
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1.49±0.29
11.8±0.52d
3.07±0.32
0.38±0.05bc
1αOHD3低剂量
low-dose 1αOHD3
77.3±4.58bd
3.00±0.20bd
1.39±0.06
14.7±0.72a
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3.49±0.36ac
0.14±0.02a
与sham组比较(compared with sham group):a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group): c,P<0.05，d,P<0.01
2. 股骨与第4腰椎骨密度
OVX组股骨与第4腰椎(L4)骨密度显著低于sham组(P<0.05)；DH与DL组骨密度显著高于OVX组，见表2。
表2 股骨生物力学参数
Table 2 Biomechanical parameters of femur 组别
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group
最大载荷(N)
max of load
最大桡度(mm)
max of deformation
最大应力(MPa)
max of stress
最大应变
max of strain
结构硬度
structure rigidity
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弹性模量
elastic modulus
弯曲硬度
bending rigidity
变形位能(N.mm)
energy at proportional limited
假手术(sham)
116±4.2
0.63±0.10
275±10.8
0.018±0.001
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260±21.0
18744±896
57746±4660
16.1±0.56
去卵巢(OVX)
99±3.9b
0.54±0.05a
245±15.2b
0.017±0.001
225±13.1b
17799±580
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49832±2905b
15.5±1.30
1αOHD3高剂量DH(high-dose 1αOHD3)
119±5.8d
0.64±0.04d
300±11.6bd
0.020±0.001bd
230±20.2b
18 563±1 287
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53106±4566
16.1±0.70
1αOHD3低剂量DL(low-dose 1αOHD3)
111±3.6ad
0.62±0.04c
247±14.6b
0.021±0.001bd
235±17.8a
15 589±1 295bc
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52206±3937a
15.5±1.73
与sham组比较(compared with sham group): a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group):c,P<0.05，d,P<0.01
3. 骨生物力学参数
OVX组股骨各项生物力学参数均低于sham组，其中最大载荷、最大桡度、弹性载荷、最大应力、弹性应变、结构硬度和弯曲硬度值显著低于sham组(P<0.05)；DH组和DL组最大载荷、最大桡度、最大应力、最大应变、弹性应变值显著高于OVX组(P<0.05)，其他参数略高但不显著(表3)。
, http://www.100md.com 表3 股骨与第4腰椎骨密度值
Table 3 Bone mineral density of femur and the fourth lumbar vertebrae 组别
group
股骨干重(g)
dry weight of femur
股骨骨密度(g/cm3)
BMD of femur
L4干重(g)
dry weight of L4
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L4骨密度(g/cm3)
BMD 0f L4
假手术(sham)
0.552±0.04
1.72±0.04
0.122±0.003
1.95±0.05
去卵巢(OVX)
0.456±0.10a
1.57±0.13a
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0.115±0.002b
1.67±0.02b
1αOHD3高剂量
high-dose 1αOHD3
0.511±0.06
1.72±0.06c
0.126±0.005d
1.77±0.05bd
1αOHD3低剂量
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low-dose 1αOHD3
0.512±0.04
1.71±0.04c
0.122±0.004d
1.73±0.03bd
与sham组比较(compared with sham group): a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group):c，P<0.05，d，P<0.01
4. 腰椎形态计量学指标
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OVX组骨小梁相对体积(BV/TV)明显低于sham组(P<0.01)；骨小梁吸收表面(ES/BS)、骨小梁形成表面(MS/BS)和矿化速率(MAR)显著高于sham组(P<0.01)。DH组骨小梁相对体积显著高于OVX组(P<0.01)，骨小梁吸收表面和骨小梁形成表面明显低于OVX组(P<0.01)，矿化速率与OVX无显著差异；DL组的骨小梁相对体积、骨小梁吸收表面、骨小梁形成表面明显高于OVX组，矿化速率与OVX无显著差异；各组骨小梁相对宽度(MTT)无显著差异(表4)。
表4 骨形态计量学参数
Table 4 Histomorphometric parameters of the third lumbar vertebrae 组别
group
骨小梁相对体积(%)
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BV/TV
骨小梁相对宽度
(μm)BV/BS
吸收表面(%)
ES/BS
形成表面(%)
MS/BS
矿化速率(μm/d)
MAR
假手术 sham
36.62±1.63
37.68±0.83
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4.68±1.57
6.81±1.70
5.04±0.39
去卵巢 OVX
26.55±1.24b
32.64±1.64a
7.02±1.53a
18.69±3.06b
6.09±0.43
1αOHD3高剂量
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high-dose 1αOHD3
35.25±3.04d
36.94±1.73d
4.35±2.17c
4.53±1.53ad
5.99±0.43
1αOHD3低剂量
low-dose 1αOHD3
33.68±2.84ad
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51.4±1.53bd
17.35±4.61bd
26.53±7.71bd
5.98±0.32
与Sham组比较(compared with sham group): a.P<0.05，b.P<0.01
与OVX组比较(compared with OVX group):c，P<0.05，d，P<0.01
5. 骨粘连蛋白(ON)mRNA表达水平
以ON cDNA为探针，对大鼠股骨、胫骨总RNA作斑点杂交，结果如图1所示：OVX组ON mRNA表达较sham组略有降低，DH与sham组相比无明显变化，DL组表达加强。
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附图 骨粘连蛋白mRNA斑点杂交
Figure mRNA Dot blotting of ON mRNA.
1.sham 2.OVX 3.DH 4.DL
讨 论
去卵巢(OVX)大鼠是目前公认的妇女绝经后骨质疏松症(PMOP)动物模型。去卵巢大鼠所发生的骨丢失情况与PMOP引起的骨丢失有许多共同之处[5]。因此，可用该模型对骨质疏松治疗药物与方案进行初步评价。
实验结果显示，OVX大鼠模型组血清雌二醇(E2)浓度与骨密度显著低于sham组，这证明去势手术及动物模型造模成功，因为血清雌二醇(E2)水平降低和骨量减少符合绝经后骨质疏松症的特点。并且高剂量组用药量相当于生理剂量的60倍，而病理检查未见心、肾等器官发生异位钙化。
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一般认为1αOHD3是骨转换的双向调节激素。本研究发现浓度影响1αOHD3的作用效果。处理12周后，1αOHD3高剂量组(DH)血清中BGP浓度下降，1αOHD3低剂量组(DL)BGP浓度上升；骨形态计量学测量显示DH组大鼠第2，3腰椎骨形成表面(MS/BS)显著低于OVX组(P<0.01)，而DL组MS/BS显著高于OVX组。说明在体内，高剂量1αOHD3抑制骨形成，低剂量1αOHD3则促进骨形成。骨形态计量学显示，DH组骨吸收表面(ES/BS)显著低于OVX组，而DL组显著高于OVX。提示高剂量1αOHD3抑制骨吸收和骨转换，低剂量促进骨吸收与骨转换。
此外，OVX组血清雌二醇(E2)浓度显著低于sham组，DH组血清雌二醇浓度恢复到sham组水平，而低剂量组血清雌二醇浓度却低于OVX对照组。此现象以前未见有报道，我们推测这是由于不同剂量1αOHD3对E2代谢有不同调节作用。Tanakaba[6]报道，绝经后妇女体内保持相当水平的肾上腺雄性激素，可以在芳香化酶(aromatase)催化下转变为雌激素，而1α，25(OH)2D3间接促进并维持这种酶基因的表达，提示活性VD有可能间接调节雌激素的合成。但这一推测尚需进一步研究证明。
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活性VD处理后，大鼠骨密度显著高于OVX组。同时DH与DL组骨形态计量学指标较OVX组也有所改善。股骨生物力学性质也明显提高，特别是股骨最大载荷显著提高，说明其抗骨折能力加强。其中高剂量组骨结构力学性质(结构硬度、弹性模量、弯曲硬度等)得到全面改善，效果优于低剂量组。
骨粘连蛋白(ON)是骨基质中主要的非胶原蛋白之一，在发育的骨的矿化部分中ON可占到非胶原蛋白总量的10%～15%。ON蛋白质结构高度保守，提示其在进化过程中具有重要作用。但ON的生理作用目前尚不十分清楚。通常认为ON参与起始矿化[7]，但也有相反的证据[8]。免疫组织化学检测发现，ON在矿化和骨再建的组织中表达水平较高，具有组织特异性[9，10]，提示它可能参与骨再建作用的调节。我们的目的是通过病理与正常条件下ON在mRNA水平表达的差异来探讨ON这一重要的骨基质蛋白是否与骨重建及矿化有关。结果显示，与正常对照组相比，去势后大鼠股骨中ON表达有所下降，用活性VD处理可恢复其表达水平。根据ON在矿化组织特异性的表达，我们推测：去卵巢导致骨重建负平衡，使矿化组织减少，从而降低了ON的表达水平；而活性VD处理使骨重建与矿化作用得以恢复。这说明ON的表达与骨重建和矿化有关，印证了ON参与骨重建和矿化作用的猜测。
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△ Laboratory of Biochemistry, Jishuitan Hospital, Beijing 100035，China
参考文献
1 崔伟，刘成林，史之桢，等.卵巢切除大鼠血清甲状旁腺、降钙素变化与骨质量降低.中国骨质疏松杂志，1996，2(2)：22
2 郑丰裕，党耕町.单纯或联合应用雌激素、钙、氟化钠防止去势后雌性大鼠骨丢失的实验研究.中华骨科杂志，1995，15(5)：266
3 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analyt Biochem,1987，162(8)：156
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4 萨姆布鲁克 J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南，北京：科学出版社，1992：372
5 Kalu DN. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone Mineral,1991,15(3):175
6 Tanaka S, Haji M, Takayangi R, et al.1，25-Dihydroxyvitamin D3 enhances the enzymatic activity and expression of the messager ribonucleic acid for aromatase cytochrome 450 synergistically with dexamethasone depending on the vitamin D receptor level in cultured human osteoblasts. Endocrinology,1996,137(suppl):1860
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7 Fisher LW, Termine JD, Noncollagen protein influencing the local mechanisms of calcification. Clin Orthop,1985,200(2)：362
8 Romberg RW, Werness PG, Riggs B L, et al. Inhibition of hydroxyapatite crystal growth by bone-specfic and other calcium-binding proteins. Biochemistry 1986,25(5)：1176
9 Bianco P, Silvestrini G, Termine JD, et al, Immunohistochemical localization of osteonectin in developing human and calf bone using monoclonal antibody. Calcif Tissue Int,1988，43(1)：155
10 Pacific M,Oshima D, Fisher LW, et al. Changes in osteonectin distribution and levels are associated with mineralization of the chicken tibial growth cartilage. Calcif Tissue Int,1990，47(1)：51
收稿1998-05 修回1998-11, http://www.100md.com