小鼠胸腺树突状细胞的分离和纯化方法的改进
作者：丁蓓蓓 缪继武 宋继志 杨宁 尹兰珍
单位：缪继武 杨宁 尹兰珍(南京铁道医学院组织学胚胎学教研室)；宋继志(电镜室，南京 210009)
关键词：树突状细胞；胸腺；分离；纯化；小鼠
解剖学报990425 【摘要】 目的 探讨一种简便易行的小鼠胸腺树突状细胞(TDC)的分离纯化方法。 方法 密度梯度离心结合小鼠CD5单克隆抗体(mAb)淘洗法(panning)。 结果 细胞浓度在1.5×107/ml时进行Percoll密度梯度离心可使分离纯度高、细胞丢失少；依次使用两种分离液分离的效果优于同一种分离液的反复使用；小鼠CD5单抗浓度为25mg/L时，淘洗纯化效果较好，TDC纯度达75%～90%。 结论 密度梯度离心与CD5单抗淘洗纯化的方法切实可行。
ISOLATION AND PURIFICATION OF MOUSE
, 百拇医药
THYMIC DENDRITIC CELLS
Ding Beibei△, Miao Jiwu, Song jizhi*, Yang Ning, Yin Lanzhen
(Department of Histology and Embryology, *Laboratory of Electron Microscopy, Nanjing Railway Medical College, Nanjing)
【Abstract】 Objective To explore a feasible method of isolating thymic dendritic cells (TDC). Methods Mouse thymic dendritic cells (TDC) were isolated from cell suspension by Ficoll-Hypaque gradients and Percoll gradients of different densities and followed by panning procedure with various concentration of mouse monoclonal antibodies (mAb) to CD5. Results (1)In percoll gradients, cell concentration at 1.5×107/ml improvs TDC purity. (2)Two sorts of gradients used consequently may obtain higher purity than one sort of gradient used repeatedly. (3)Panning procedure with mouse mAb to CD5 concentration 25mg/L may obtain 75%-90% purity of TDC. Conclusion Mouse TDCS were isolated and obtained by two sorts of gradients and panning procedure.
, 百拇医药
【Key words】 Dendritic cells; Thymus; Isolation; Purification; Mouse
胸腺树突状细胞(thymic dendritic cell,TDC)是一种重要的免疫辅佐细胞，能较强地呈递各种内源性及外源性抗原，促进胸腺细胞增殖，刺激混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction)；参与胸腺细胞的阴性选择，形成自身免疫耐受，与自身免疫性疾病和移植免疫有密切关系。TDC含量极少，占胸腺细胞总数的0.05%～0.07%[1]，原位研究较困难，很有必要做分离培养体外研究。本研究采用Percoll密度梯度离心结合小鼠CD5单抗(mAb)淘洗法(panning)对小鼠TDC进行了分离纯化。
材料和方法
1.动物
昆明种小鼠40只，5周龄，雌性。
, 百拇医药
2.主要试剂
胶原酶(Ⅳ型，Sigma)，Ficoll-Hypaque分离液(1.078～1.080)，Percoll分离液(Pharmacia),RPMI 1640培养液(Gibco),verapamil(江苏兴化制药厂)，兔抗牛S-100蛋白抗体(Dako)，大鼠抗小鼠CD5单抗(Sigma)。
3.TDC的分离、纯化
以小鼠颈椎脱臼致死，取胸腺，用分离针拨成1mm3组织块，置含胶原酶1.6g/L消化液中，37℃，60min。洗去消化液，在细胞悬液中加verapamil(5×10-2g/L)使细胞进一步分散。Percoll密度梯度离心，根据细胞浓度分为5组，每ml为0.5×107个、1.0×107个、1.5×107个、2.0×107个及2.5×107个。各组分别缓缓加在细胞分离液上(1.078、1.062)，1 000g离心，30min。取1.062层面的细胞，分别计数细胞涂片作S-100蛋白免疫染色。选最佳细胞浓度组，分3组进行密度梯度离心：第1组(F)进行Ficoll密度梯度离心；第2组(P2)进行连续两次Percoll密度梯度离心；第3组(FP)依次进行Ficoll及Percoll密度梯度离心。各组所得细胞涂片以S-100蛋白免疫染色检测纯度，其中以FP组纯度最佳。在此基础上，将FP组用淘洗法进一步纯化，即根据TDC与其他细胞对CD5单抗粘附性的不同将其分离出来。根据包被CD5单抗浓度的不同分为4组(M1～M4组)，单抗浓度分别为250mg/L,50mg/L,25mg/L,12.5mg/L，以PBS作空白对照(M0组)，加入浓度0.5×107细胞/ml悬液，室温下静置1小时，未粘附的细胞即为纯化的TDC。
, http://www.100md.com
4.纯度鉴定
S-100蛋白免疫染色(ABC法)：第一抗体为兔抗牛S-100蛋白(1∶200)，二抗为生物素化羊抗兔IgG(1∶200)，亲和素及生物素-辣根过氧化物酶复合物(1∶100)，H2O2-DAB显色。以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。苏木素复染5min。各组涂片油镜下每片观察200个细胞，计数S-100阳性细胞百分率。
结果和讨论
采用S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定TDC，胞质和突起内呈现弥散或颗粒状棕黄色反应物者为阳性细胞(即TDC)。
1.不同细胞悬液浓度下Percoll密度梯度离心获得细胞百分率及S-100蛋白免疫染色阳性率(表1)
表1 不同细胞浓度Percoll密度梯度离心获得细胞百分率及S-100蛋白免疫染色阳性率比较
, 百拇医药
Table 1 Comparison of the percentage of cells acquired and S-100 positive-stained cells by
percoll gradients with various cell concentration 细胞浓度(×107)
number of cells per milliliter
获得细胞百分率
cells acquired(%)
S-100阳性率
positive cells(%)
0.5
, 百拇医药
3.5
15.5
1.0
4.3
35.4
1.5
10.8
39.6
2.0
5.4
30.3
2.5
10.0
, 百拇医药
9.8
由表1可见，最佳的细胞浓度为1.5×107/ml左右，此时不仅收获细胞多，TDC纯度也高；细胞浓度大于2.5×107/ml时，细胞收获百分率下降不明显，但TDC纯度显著降低；而细胞浓度低于1×107/ml时，收获细胞百分率及TDC纯度都有显著下降。
2.不同分离步骤涂片S-100蛋白免疫染色阳性率(表2)
表2 各组分S-100蛋白免疫染色阳性率比较
Table 2 Comparison of the percentage of S-100 protein positive-stained cells in various groups 组别
groups
, 百拇医药
计数细胞数
cells counted
阳性细胞数
positive cells
阳性率
positive cells(%)
F
800
114
14.3
P2
800
, 百拇医药
318
39.8
FP
800
525
65.6
FP+M3
800
682
85.3
F、P2、FP组TDC纯度以FP组最高，3组比较有显著性差异(P<0.005)，表明运用两种不同分离液进行密度梯度离心效果优于同一种分离液的反复使用，可能是源于两种分离液的互补作用，从而使丢失细胞减少，提高了分离纯度。
, 百拇医药
3.不同浓度CD5单抗淘洗所得细胞S-100阳性率比较(表3)
表3 不同浓度CD5单抗淘洗所得细胞S-100阳性率比较
Table 3 Comparison of the percentage of S-100 protein positive-stained cells by panning procedure with various
concentration of anti-CD5 monoclonal antibody 组别
groups
mAbCD5浓度
concentration
(μg)
, http://www.100md.com
计数细胞数
cells counted
阳性细胞数
positive cells
S-100阳性率
positive cells
(%)
M1
250
800
356
44.5
, http://www.100md.com
M2
50
800
558
69.8
M3
25
800
682
85.3
M4
12.5
800
, http://www.100md.com
633
79.1
M0
0
800
437
54.6
单抗浓度为25mg/L时，S-100蛋白免疫染色阳性率最高。单抗浓度过高不利于其和胸腺细胞结合；或因与胸腺细胞形成细胞簇的TDC间接和单抗结合，从而TDC丢失增多，纯度下降。从表2可看出，在FP组的基础上采用CD5单抗淘洗法(FP+M3)可显著提高TDC纯度。
目前，国外TDC分离方法主要有两种：一种是“培养粘附法”，根据TDC和单核细胞粘附性的不同，收集未粘附细胞即为TDC组分[2]，TDC纯度达60%～80%。另一种为“单抗法”，是以密度梯度离心法为基础，继以免疫磁珠清除法或流式细胞仪法[3]，TDC纯度达90%以上。两种方法各有优缺点。“培养粘附法”收集的TDC常出现抗原标志的改变[4]；“单抗法”分离纯度高，可保持TDC原有特征，但单抗量消耗大，而且单抗选用不当，很容易丢失部分TDC。本研究的特色在于：(1)采用CD5单抗淘洗法进一步纯化TDC；小鼠CD5抗原又称淋巴细胞抗原1(LY-1)，位于全部胸腺细胞表面及90%的外周T细胞和部分B细胞表面。小鼠TDC不表达CD5抗原[5]，因此仅用小鼠CD5单抗就能去除绝大部分混杂的胸腺细胞。(2)密度梯度离心采用两种分离液交替使用取代原先的同种分离液的反复使用；(3)摸索出Percoll分离TDC的最佳细胞浓度；(4)采用verapamil替代EDTA阻止TDC与胸腺细胞的聚集成簇，其优点是使用方便，可随时添加；半衰期短(4～7h)，对细胞损伤较小。与国外相比，本方法简便、经济，易推广，可避免TDC特征的改变，同时仅用一种单抗，可减少TDC的丢失，纯度达75%～90%。为进一步研究TDC的形态结构和功能奠定了良好的基础。
, 百拇医药
△ Department of Reproductive Biology, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China
作者简介：丁蓓蓓( 联系地址：上海市计划生育研究所生殖生物学研究室，上海 200032)
参考文献
1 Ardavin C, Shortman K. Cell surface marker analysis of mouse thymic dendritic cells. Eur J Immunol, 1992,22(3):859
2 Vremec D, Zorbas M, Scollay R. The surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen: investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells. J Exp Med, 1992,176(1):47
, 百拇医药
3 Winkel K, Sotzik F, Vremec D, et al. CD4 and CD8 expression by human and mouse thymic dendritic cells. Immunol Lett, 1994,40(2):93
4 Lafontaine M, Landry D,Aisir S M.The human thymic dendritic cell phenotype and its modification in culture. Cell Immunol, 1992,142(2):238
5 Tanaka Y, Mamalaki C, Stockinger B. In vitro negative selection of alphabet T cell receptor transgenic thymocytes by conditionally immortalized thymic cortical epithelial cell lines and dendritic cells. Eur J Immunol, 1993,23(10):2614
收稿1998-07 修回1999-02, 百拇医药
单位：缪继武 杨宁 尹兰珍(南京铁道医学院组织学胚胎学教研室)；宋继志(电镜室，南京 210009)
关键词：树突状细胞；胸腺；分离；纯化；小鼠
解剖学报990425 【摘要】 目的 探讨一种简便易行的小鼠胸腺树突状细胞(TDC)的分离纯化方法。 方法 密度梯度离心结合小鼠CD5单克隆抗体(mAb)淘洗法(panning)。 结果 细胞浓度在1.5×107/ml时进行Percoll密度梯度离心可使分离纯度高、细胞丢失少；依次使用两种分离液分离的效果优于同一种分离液的反复使用；小鼠CD5单抗浓度为25mg/L时，淘洗纯化效果较好，TDC纯度达75%～90%。 结论 密度梯度离心与CD5单抗淘洗纯化的方法切实可行。
ISOLATION AND PURIFICATION OF MOUSE
, 百拇医药
THYMIC DENDRITIC CELLS
Ding Beibei△, Miao Jiwu, Song jizhi*, Yang Ning, Yin Lanzhen
(Department of Histology and Embryology, *Laboratory of Electron Microscopy, Nanjing Railway Medical College, Nanjing)
【Abstract】 Objective To explore a feasible method of isolating thymic dendritic cells (TDC). Methods Mouse thymic dendritic cells (TDC) were isolated from cell suspension by Ficoll-Hypaque gradients and Percoll gradients of different densities and followed by panning procedure with various concentration of mouse monoclonal antibodies (mAb) to CD5. Results (1)In percoll gradients, cell concentration at 1.5×107/ml improvs TDC purity. (2)Two sorts of gradients used consequently may obtain higher purity than one sort of gradient used repeatedly. (3)Panning procedure with mouse mAb to CD5 concentration 25mg/L may obtain 75%-90% purity of TDC. Conclusion Mouse TDCS were isolated and obtained by two sorts of gradients and panning procedure.
, 百拇医药
【Key words】 Dendritic cells; Thymus; Isolation; Purification; Mouse
胸腺树突状细胞(thymic dendritic cell,TDC)是一种重要的免疫辅佐细胞，能较强地呈递各种内源性及外源性抗原，促进胸腺细胞增殖，刺激混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction)；参与胸腺细胞的阴性选择，形成自身免疫耐受，与自身免疫性疾病和移植免疫有密切关系。TDC含量极少，占胸腺细胞总数的0.05%～0.07%[1]，原位研究较困难，很有必要做分离培养体外研究。本研究采用Percoll密度梯度离心结合小鼠CD5单抗(mAb)淘洗法(panning)对小鼠TDC进行了分离纯化。
材料和方法
1.动物
昆明种小鼠40只，5周龄，雌性。
, 百拇医药
2.主要试剂
胶原酶(Ⅳ型，Sigma)，Ficoll-Hypaque分离液(1.078～1.080)，Percoll分离液(Pharmacia),RPMI 1640培养液(Gibco),verapamil(江苏兴化制药厂)，兔抗牛S-100蛋白抗体(Dako)，大鼠抗小鼠CD5单抗(Sigma)。
3.TDC的分离、纯化
以小鼠颈椎脱臼致死，取胸腺，用分离针拨成1mm3组织块，置含胶原酶1.6g/L消化液中，37℃，60min。洗去消化液，在细胞悬液中加verapamil(5×10-2g/L)使细胞进一步分散。Percoll密度梯度离心，根据细胞浓度分为5组，每ml为0.5×107个、1.0×107个、1.5×107个、2.0×107个及2.5×107个。各组分别缓缓加在细胞分离液上(1.078、1.062)，1 000g离心，30min。取1.062层面的细胞，分别计数细胞涂片作S-100蛋白免疫染色。选最佳细胞浓度组，分3组进行密度梯度离心：第1组(F)进行Ficoll密度梯度离心；第2组(P2)进行连续两次Percoll密度梯度离心；第3组(FP)依次进行Ficoll及Percoll密度梯度离心。各组所得细胞涂片以S-100蛋白免疫染色检测纯度，其中以FP组纯度最佳。在此基础上，将FP组用淘洗法进一步纯化，即根据TDC与其他细胞对CD5单抗粘附性的不同将其分离出来。根据包被CD5单抗浓度的不同分为4组(M1～M4组)，单抗浓度分别为250mg/L,50mg/L,25mg/L,12.5mg/L，以PBS作空白对照(M0组)，加入浓度0.5×107细胞/ml悬液，室温下静置1小时，未粘附的细胞即为纯化的TDC。
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4.纯度鉴定
S-100蛋白免疫染色(ABC法)：第一抗体为兔抗牛S-100蛋白(1∶200)，二抗为生物素化羊抗兔IgG(1∶200)，亲和素及生物素-辣根过氧化物酶复合物(1∶100)，H2O2-DAB显色。以大鼠颌下腺石蜡切片作阳性对照。苏木素复染5min。各组涂片油镜下每片观察200个细胞，计数S-100阳性细胞百分率。
结果和讨论
采用S-100蛋白免疫组织化学染色鉴定TDC，胞质和突起内呈现弥散或颗粒状棕黄色反应物者为阳性细胞(即TDC)。
1.不同细胞悬液浓度下Percoll密度梯度离心获得细胞百分率及S-100蛋白免疫染色阳性率(表1)
表1 不同细胞浓度Percoll密度梯度离心获得细胞百分率及S-100蛋白免疫染色阳性率比较
, 百拇医药
Table 1 Comparison of the percentage of cells acquired and S-100 positive-stained cells by
percoll gradients with various cell concentration 细胞浓度(×107)
number of cells per milliliter
获得细胞百分率
cells acquired(%)
S-100阳性率
positive cells(%)
0.5
, 百拇医药
3.5
15.5
1.0
4.3
35.4
1.5
10.8
39.6
2.0
5.4
30.3
2.5
10.0
, 百拇医药
9.8
由表1可见，最佳的细胞浓度为1.5×107/ml左右，此时不仅收获细胞多，TDC纯度也高；细胞浓度大于2.5×107/ml时，细胞收获百分率下降不明显，但TDC纯度显著降低；而细胞浓度低于1×107/ml时，收获细胞百分率及TDC纯度都有显著下降。
2.不同分离步骤涂片S-100蛋白免疫染色阳性率(表2)
表2 各组分S-100蛋白免疫染色阳性率比较
Table 2 Comparison of the percentage of S-100 protein positive-stained cells in various groups 组别
groups
, 百拇医药
计数细胞数
cells counted
阳性细胞数
positive cells
阳性率
positive cells(%)
F
800
114
14.3
P2
800
, 百拇医药
318
39.8
FP
800
525
65.6
FP+M3
800
682
85.3
F、P2、FP组TDC纯度以FP组最高，3组比较有显著性差异(P<0.005)，表明运用两种不同分离液进行密度梯度离心效果优于同一种分离液的反复使用，可能是源于两种分离液的互补作用，从而使丢失细胞减少，提高了分离纯度。
, 百拇医药
3.不同浓度CD5单抗淘洗所得细胞S-100阳性率比较(表3)
表3 不同浓度CD5单抗淘洗所得细胞S-100阳性率比较
Table 3 Comparison of the percentage of S-100 protein positive-stained cells by panning procedure with various
concentration of anti-CD5 monoclonal antibody 组别
groups
mAbCD5浓度
concentration
(μg)
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计数细胞数
cells counted
阳性细胞数
positive cells
S-100阳性率
positive cells
(%)
M1
250
800
356
44.5
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M2
50
800
558
69.8
M3
25
800
682
85.3
M4
12.5
800
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633
79.1
M0
0
800
437
54.6
单抗浓度为25mg/L时，S-100蛋白免疫染色阳性率最高。单抗浓度过高不利于其和胸腺细胞结合；或因与胸腺细胞形成细胞簇的TDC间接和单抗结合，从而TDC丢失增多，纯度下降。从表2可看出，在FP组的基础上采用CD5单抗淘洗法(FP+M3)可显著提高TDC纯度。
目前，国外TDC分离方法主要有两种：一种是“培养粘附法”，根据TDC和单核细胞粘附性的不同，收集未粘附细胞即为TDC组分[2]，TDC纯度达60%～80%。另一种为“单抗法”，是以密度梯度离心法为基础，继以免疫磁珠清除法或流式细胞仪法[3]，TDC纯度达90%以上。两种方法各有优缺点。“培养粘附法”收集的TDC常出现抗原标志的改变[4]；“单抗法”分离纯度高，可保持TDC原有特征，但单抗量消耗大，而且单抗选用不当，很容易丢失部分TDC。本研究的特色在于：(1)采用CD5单抗淘洗法进一步纯化TDC；小鼠CD5抗原又称淋巴细胞抗原1(LY-1)，位于全部胸腺细胞表面及90%的外周T细胞和部分B细胞表面。小鼠TDC不表达CD5抗原[5]，因此仅用小鼠CD5单抗就能去除绝大部分混杂的胸腺细胞。(2)密度梯度离心采用两种分离液交替使用取代原先的同种分离液的反复使用；(3)摸索出Percoll分离TDC的最佳细胞浓度；(4)采用verapamil替代EDTA阻止TDC与胸腺细胞的聚集成簇，其优点是使用方便，可随时添加；半衰期短(4～7h)，对细胞损伤较小。与国外相比，本方法简便、经济，易推广，可避免TDC特征的改变，同时仅用一种单抗，可减少TDC的丢失，纯度达75%～90%。为进一步研究TDC的形态结构和功能奠定了良好的基础。
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△ Department of Reproductive Biology, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China
作者简介：丁蓓蓓( 联系地址：上海市计划生育研究所生殖生物学研究室，上海 200032)
参考文献
1 Ardavin C, Shortman K. Cell surface marker analysis of mouse thymic dendritic cells. Eur J Immunol, 1992,22(3):859
2 Vremec D, Zorbas M, Scollay R. The surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen: investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells. J Exp Med, 1992,176(1):47
, 百拇医药
3 Winkel K, Sotzik F, Vremec D, et al. CD4 and CD8 expression by human and mouse thymic dendritic cells. Immunol Lett, 1994,40(2):93
4 Lafontaine M, Landry D,Aisir S M.The human thymic dendritic cell phenotype and its modification in culture. Cell Immunol, 1992,142(2):238
5 Tanaka Y, Mamalaki C, Stockinger B. In vitro negative selection of alphabet T cell receptor transgenic thymocytes by conditionally immortalized thymic cortical epithelial cell lines and dendritic cells. Eur J Immunol, 1993,23(10):2614
收稿1998-07 修回1999-02, 百拇医药