凋亡的分子标志及其应用
作者：张爱群 姚大卫
单位：香港中文大学解剖学系 香港
关键词：
解剖学报00zk03
【中图分类号】 Q255 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)增-09
MOLECULAR MARKERS FOR THE DETECTION OF APOPTOSIS
凋亡(apoptosis)是一种无论从形态表现还是发生机制上均明显区别 于坏死的细胞死亡方式，它是多细胞生物个体发育过程中细胞选择性死亡的基本形式，也参 与生理状态下多余或受损细胞的清除，以维持细胞增殖与死亡之间的动态平衡[1] 。正常凋亡过程的受抑或异常启动是多种疾病发生的病理学基础，如肿瘤、自身免疫病、退 行性疾病等。因此，阐明凋亡发生和调控的分子机制，对于充分揭示和有效干预病理状态下 的细胞增殖或死亡具有重要意义。与凋亡过程分子机制研究进展迅速，不断有新的调控因子 被发现相比，对凋亡发生过程的检测，尤其针对体内复杂的生理或病理条件下细胞凋亡现象 的识别，至今仍缺乏一个全面准确的评判标准。为此，我们在概括地描述细胞凋亡的信号传 递途径、典型表征出现的分子机理的基础上，详细介绍凋亡标志的研究进展及相应检测手段 ，为实际应用提供参考。
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凋亡(apoptosis)是一种无论从形态表现还是发生机制上均明显区别 于坏死的细胞死亡方式，它是多细胞生物个体发育过程中细胞选择性死亡的基本形式，也参 与生理状态下多余或受损细胞的清除，以维持细胞增殖与死亡之间的动态平衡[1] 。正常凋亡过程的受抑或异常启动是多种疾病发生的病理学基础，如肿瘤、自身免疫病、退 行性疾病等。因此，阐明凋亡发生和调控的分子机制，对于充分揭示和有效干预病理状态下 的细胞增殖或死亡具有重要意义。与凋亡过程分子机制研究进展迅速，不断有新的调控因子 被发现相比，对凋亡发生过程的检测，尤其针对体内复杂的生理或病理条件下细胞凋亡现象 的识别，至今仍缺乏一个全面准确的评判标准。为此，我们在概括地描述细胞凋亡的信号传 递途径、典型表征出现的分子机理的基础上，详细介绍凋亡标志的研究进展及相应检测手段 ，为实际应用提供参考。
1.凋亡信号传递的基本过程
大量的研究结果表明，凋亡是一个由适宜刺激启动、细胞内多种蛋白成分参与 并且受到精细 调控的主动过程。尽管对于不同刺激或者不同的细胞类型，凋亡信号传递通路上的某些具体 环节不尽相同，但是从凋亡发生的总体趋势上看，可以将其划分为以下3个阶段[2] ：
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1.1 启动期：凋亡刺激信号通过中介激活起始caspases。以研究得比较清楚的Fas(CD95 ) 死亡受体为例，Fas配体与膜受体Fas的特异结合，通过中间蛋白FADD(Fas-associated dea th domain protein)使胞浆内的caspase-8由无活性的酶原转化为活性酶。
以caspase-8为代表的起始或上游caspases一旦活化，除继续传递凋亡信号给下游的caspas e s之外，本身作为蛋白酶开始对细胞骨架蛋白及其相关蛋白进行水解切割，后者包括Vimenti n、Actin、Fodrin等，使细胞呈现凋亡早期的形态学变化，如细胞皱缩、“大疱”形成。另 外，caspase-8还通过作用于某些膜酶类，改变膜脂质的分布状态，使正常存在于膜胞浆 侧的磷酯酰丝氨酸翻转向外暴露于膜表面，有关机制后有详述。
1.2 决定期：起始caspases活化下游caspases，凋亡过程不可逆转。位居下游的caspas es ，如caspase-3、6和7，尤其caspase-3的活化是凋亡发生分子通路上的关键环节，无论从 死 亡受体起始，还是通过线粒体途径启动凋亡，均在此汇聚，即caspase-3由酶原转化为活性 酶。caspase-3等下游caspases具有自催化和它催化的特点，以此形成正反馈环路，使凋亡 信号呈级联式放大。
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凋亡信号通过线粒体的传递途径包括两种因子由线粒体释放入胞浆，一是AIF(apoptosis in itiating factor)，它一种分子量为50kD的蛋白酶，除了能使下游caspases活化外，还参与裂解DNA。另一种促凋亡因子是细胞色素C(也称Apaf 2)，它在胞 浆中作用于Bc1-2/Apaf-1/caspase-9前体复合物，使Apaf-1脱离Bc1-2的抑制 ， 在ATP的辅助下，裂解caspase-9酶原生成有活性的caspase-9，后者进一步激活caspase- 3。
1.3 执行期：活化的下游caspases对靶蛋白进行切割，细胞呈现凋亡的典型形态学改变 。下 游caspases，或称执行caspases一经活化，即作用于细胞内与细胞生存密切相关的多种结构 和功能蛋白质，后者的瓦解或者失活，使细胞表现出一系列特有的形态学变化和生化特征。 (1)参与DNA修复的PARP[Poly(ADP-ribose)polymerase]失活，同时DFF、CAD等核酸内切 酶 的活化，使DNA在核小体连接处被切割，产生成倍于180～200bp大小的DNA片段。(2)细胞骨 架蛋白及相关蛋白如actin、spectrin、PAK2等的降解，使细胞失去正常形态。(3)位于细胞 - 细胞、细胞-细胞外基质接触位点上的VMEKK-1、FAK等蛋白蛋激酶失活，使细胞失去与环 境 之间的联系，进一步加速凋亡进程。(4)涉及染色质结构及染色质与核基质相互作用的蛋白 质，如NuMa的受累，染色质发生凝聚，并沿核周呈块状分布。(5)核中间丝蛋白LaminA和B的 降解，使核囊结构解体。(6)转谷氨酰胺酶被诱导合成，并聚集于近胞膜处，催化微管微丝 蛋白的交联，在胞膜下形成牢固的蛋白分子支架，防止细胞内容物的外泄。
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2.凋亡的标志及其检测方法
所谓凋亡标志，即能够表明凋亡而非其他形式的死亡，在一既定环境中发生的 特有指征。显然，与坏死膜结构肿胀崩解、内容物外泄截然不同的细胞皱缩、染 色体凝聚等 形态学改变，不仅是几十年前凋亡命名的依据，而且至今仍然是判定凋亡发生的金标准，对 新的凋亡标志物的评价也往往以上述形态学改变为参照。然而此标准在实际应用时往往遇到 问题，如形态学特征出现于凋亡过程的后期，凋亡细胞将被周围细胞吞噬清除，因此单纯以 形 态改变为依据往往低估了凋亡在细胞群体中发生的频率。另外，体内一些具有体积小、核质 浓聚等形态特征的细胞如多形核白细胞、少突胶质细胞，以及正处于分裂期的正常细胞，在 光镜下易与凋亡细胞混淆。因此，人们在对凋亡信号传递分子机制进行不断探索的同时，找 到了一系列凋亡的分子标志，其中几种已得到广泛的应用，现分述如下。
2.1 核小体间DNA的切割
内源性核酸内切酶的活化发生于凋亡过程的早期，其作用对象乃染色质内高度螺旋卷曲、并 与核蛋白呈结合状态的DNA分子，因此切割作用只在有限的范围，即核小体间的连接处进行 ，产生一定长度的DNA片段。而细胞坏死时，溶酶体释放的核酸内切酶及外切酶共同作用于 结构松散的染色质DNA，产物为长短不一的DNA片段。就切割性质而言，凋亡DNA的切割类似D NA酶I样作用，缺口处的3羟基末端，是原位标记检测方法建立的基础[3]。
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2.1.1 DNA梯度：凋亡时发生在核小体间的DNA切割，经琼脂糖凝胶电泳，呈现出长度为18 0～200bp多倍体的阶梯样DNA谱带，而细胞坏死时DNA碎片则呈涂布式连续分布。此方法最 大的 缺点是不能对同时存在的凋亡和非凋亡细胞进行甄别，而且只有当凋亡细胞占有一定比例时 ，才能在凝胶上得到易分辨的DNA梯度。电泳前对DNA切割点进行酶促修饰，可以大大提高检 测灵敏度，减少样品用量，但应注意此修饰不应使DNA片段的长度发生明显改变而干扰对梯 度的观察。另外有报道，在某些细胞的凋亡过程中，并无核小体间DNA切割的发生[4] 。因此，DNA梯度的出现特异地提示凋亡发生，但是未见DNA梯度并不能完全排除凋亡。
2.1.2 DNA切割的原位显示：针对DNA切割后产生的断端，利用酶催化已标记的脱氧单核苷酸或者DNA片段连接其上，通过 标 记物显示切割发生的部位，候选酶类包括，模板非依赖性的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、E .coli DNA聚合酶I或其Klenow片段，以及T4DNA连接酶等，其相应的检测方法分别为TUNEL( TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)、ISEL(in situ end labeling)及标记D N A片段的原位连接，其中以TUNEL最为常用。此类方法能够检测到尚未发生明显形态改变的凋 亡细胞，提高了检出率。
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然而，DNA切割并不是凋亡特有的现象，也见于DNA复制、DNA可修复性损伤、细胞坏死等生 理或病理状态下。从理论上讲，TUNEL对凋亡的特异性高低取决于TdT的底物特异性和凋亡是 否具有特殊的DNA剪切方式。TdT选择性作用于单链DNA和双链DNA的3突出端，而对5突出 端 及钝性末端作用较弱，钴离子可以提高TdT对后两者的催化效率[5]。就凋亡与非凋 亡 细胞DNA的切割方式有无区别，至今尚无定论，一般认为，核小体间DNA的切割方式是单链多 切口[6]，因此推测存在着单链缺口和3种形式的双链断端，即3突出、5突出 及 钝性末端，事实上这些剪切形式均可出现于正常及坏死细胞中，然而据Didenko和Hornsby报 道[7]，凋亡时出现 3单碱基突出末端，而在非凋亡情况下不出现或极少出现， 据 推测此现象与I型DNA酶样作用及凋亡时DNA的有限性剪切有关。显然，TdT对此末端缺乏特异 性。
TUNEL方法简单，敏感性强，尤其可以直接用于组织切片和进行定量检测，因此成为凋亡研 究的常用方法。但是在应用过程中应考虑本法对凋亡的特异性、方法本身的可靠性等因素， TUNEL阳性不能完全排除非凋亡DNA切割的可能性[8]，而且操作处理不当，如蛋白 酶 消化过度、TdT过量、过氧化氢对组织的破坏等均可能导致假阳性出现[9]。为此 ，除 了优化实验条件，设立适当的阳性及阴性对照外，应同时对阳性细胞进行形态学观察，排除 坏死灶，将有助于对凋亡细胞的识别。
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2.2 膜磷脂酰丝氨酸(PS)的翻转
2.2.1 PS翻转与凋亡：如前所述，PS翻转暴露于细胞膜表面，是凋亡早期指征之一。正常 情况下，PS、磷脂酰乙醇胺等氨基磷脂固定分布于膜内侧，而神经磷脂如磷脂酰胆碱则位于 膜 外侧，这种膜质分布的不对称性，最早见于红细胞，后来发现广泛存在于有核细胞的细胞膜 。此分布状态的维持有赖于一种转位酶(translocase)，它将出现于膜外侧的氨基磷脂转运 至膜内侧。凋亡发生时，活化时caspases使转位酶的作用方向发生逆转或失活，或者激活另 一种与之作用相反的酶--Scramblase，与此同时，细胞骨架交联蛋白fodrin的降解使PS失 去膜内侧的固定点，PS遂大量出现于细胞外表面，而此时细胞膜仍保持完整[10]。 暴露 于细胞表面的PS类似分子标签，吞噬细胞通过受体结合方式识别并吞噬表面显示PS的凋亡细 胞 ，如同衰老红细胞的清除过程。PS翻转存在于从启动期末到凋亡细胞或凋亡小体被吞噬之前 的一个相对较长的时间范围内，而且它与启动方式无关，增加Bcl-2的表达或抑制细胞大分 子合成能够阻止凋亡形态学改变的发生，同时也制止了PS在膜表面的出现[11] 。因此，PS翻转是凋亡发生的特异指征。
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2.2.2 Annexin V: Annexin V是一种具有抗凝作用的蛋白质，最初从脐带动脉组织中分离 获得，后经cDNA克隆及测序被确定为 Annexin 超家族中的一员。 Annexin V在毫摩尔浓度C a+2的存在下，与PS发生特异且强烈的结合[12]，后者可以通过与 Annexin V偶联 的标记物，如biotin、FITC 原位显示出来。 Annexin V不能穿过细胞膜，无法与膜内侧的P S结合，因此正常细胞不显示 Annexin V结合信号。为了排除细胞坏死或自溶时 Annexin V 漏入而造成的 Annexin V与膜内侧PS结合，可同时使用不能穿透胞膜的核酸染料PI(propidi um iodide)。
2.2.3 Annexin V结合法在凋亡研究中的应用：由于利用 Annexin V对PS在细胞膜上分布 状态的观察有赖于完整细胞膜的存在，故 Annexin V结合法主要用于对悬浮细胞凋亡的研究 ，若用于贴附生长的细胞，应注意刮取细胞时有可能破坏细胞膜，产生类似坏死细胞的强 结合信号，Annexin V与某些细胞染料同用则有助于判断。
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最近几项研究结构初步证明体内应用 Annexin V是可行的，从而可以在组织切片上原位观察 被 Annexin V标记的凋亡细胞。Van den Eijnde等[13]曾将生物素标记的Annexin V注入胎鼠心脏 ，以此在整体水平上观察发育过程的某一阶段凋亡细胞的空间分布情况。另外，用99m锝标 记的 Annexin V可以通过同位素扫描进行无创性检测，被诱导发生凋亡的组织呈现出数倍于 正常组织的放射性信号[14]。然而 Annexin V用于体内尚有不少问题有待解决，首 先 与体外应用一样， Annexin V本身不能分辨可能同时存在的凋亡和坏死，而PI等染料对生物 体有毒，不能用于体内；其次，Annexin V是机体产生的具有多种生物学功能的蛋白质，外 源Annexin V进入体内可能会干扰凝血等生理过程；另外，对标记 Annexin V在体内的分布 状况、代谢动力学等研究较少。尽管如此， Annexin V为在体定位观察组织细胞凋亡的动态 过程、探讨干预措施的有效性和作用机理带来希望。
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2.3 Caspase-3
回顾细胞凋亡分子机理研究的历史，有两个关键性问题的相继突破引人注目，一是找到了控 制 美丽线虫早期发育过程中细胞凋亡的3个基因--ced-3、ced-4和ced-9，提示凋亡是 由 细胞内在机制操纵的主动过程；二是在此基础上发现哺乳动物细胞存在一组与ced-3编码 产 物结构相似的蛋白质，即ICE家族，对后者结构、功能及不同成员间相互关系的进一步揭示 ，大大加快了凋亡分子机理研究的步伐。ICE家族是一类半胱氨酸蛋白酶，其切割点位于门 冬氨酸之后故也称作caspases(cystein-dependent aspartate specific protease)。目前 为止已发现多达14种的caspases ,根据结构相似程度把研究的比较清楚的前10种caspases划分为ICE样(caspase-1,4,5)、C PP32样。(caspase-3,6～10)及ICH-1样(casppase-2)3个亚群。大量研究结果表明，CPP3 2 亚群是构成凋亡信号传递通路的基本要素，其中caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇 聚 点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志，并且活化的caspase-3将作用于包括细胞结构和 功能蛋白、酶类及其他caspases,如caspase-2,3,6,7,9在内的多种蛋白质，最终使细胞 呈现典型的凋亡形态学改变[15]。为此，越来越多的研究者将caspase-3活化作 为凋亡发生的分子标志。
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Caspase-3活化的直接检测是利用抗活化形式caspase-3的特异抗体，对组织切片进行免疫 组织化学染色，以确定发生凋亡的细胞个体[16]。另外应用比较多的是生化检测法 ， 如Western blot 和 caspase-3酶活性测定。前者使用能同时识别caspase-3酶原和亚单 位 的抗体，显示出支持膜上的活性亚单位，后者与酶原的分子量不同，故易分辨[17] 。 酶活性测定则是以人工合成的荧光标记短肽DEVD-AFC为底物，caspase-3在连接处进行切 割，游离下来的AFC发光，其强度与活性caspase-3的量成正比[18]，但该法测得 的是 caspase-3样作用，而非专一反映caspase-3活性。最近，Komoriya等[19]以能穿 过 细胞膜的标记底物为探针，观察活细胞凋亡过程中caspase-3的活化。此外利用caspase-3 的 特异抑制物可以间接证明细胞是通过凋亡方式死亡，或者在凋亡已被明确的前提下，应用ca spase抑制物反过来判断某种caspase是否参与了凋亡过程。
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2.4 Caspase切割产物
据统计，至少有40种蛋白是caspase的切割目标，其中数种与凋亡表征及细胞死亡之间 的关系已得到阐明，有的已被看作凋亡发生的标志。
PARP参与DNA损伤修复过程，对DNA结构完整性的维持起着重要作用。PARP是多种casppases 作用的靶点，116kD的功能单体被水解为89kD和25kD长短两部份，据称这一切割方式不同于 坏死时的PARP降解。Kim[20]等进一步研究发现，25kD短链牢固结合在DNA缺口处， 而89kD长链则 与其他单体分子发生聚合，进一步使PARP失活，阻止DNA修复机制发挥作用。对PARP切割产 物的检测主要通过Western blot，也有使用抗89kD特异抗体的报道[21]。另外 细胞骨架蛋白或核基质蛋白的瓦解是一系列细胞形态学变化发生的分子基础。利用特异抗体 检测原有抗原决定簇的改变或者新的抗原性状的出现，均可以判断这些蛋白的存在状态，如 cytokeratin 18、 actin和fractin等[22]。
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3.结束语
细胞凋亡作为一种独特的生命现象，其发生和调控的分子机理几年来始终是生物学领域的研 究热点。尽管尚有许多细节问题有待进一步阐明，但是已经建立的对凋亡信号传递通路上诸 多元素的地位和作用、凋亡表现特征出现的分子基础等关键问题的认识，为新的凋亡标志 物的确立拓宽了视野，但遗憾的是，至今仍无一个公认的、可以独立指示凋亡且不受应用 范围限制的凋亡特异标志。有研究结果显示[23]，凋亡与坏死之间并无绝对严格的 界 限，两者可以共用同一条信号传递路径，尤其是刺激作用的早期；或者由于某种原因凋亡信 号传递中断，代之以坏死告终，此时细胞可兼有两种死亡特征，因此推测面向凋亡特异 性标志的窗口已很窄。另外凋亡的动态特征及在细胞群体中发生的不平衡性，决定了很难以 单一指标描述细胞凋亡发生的全貌。
鉴于上述原因，目前凋亡相关研究采用两个以上指标的联合应用(如分子标志物与形态学、caspase-3与其作用产物)，旨在提高特异性和灵敏度。尽管形态学观察和DNA切割产物的检 测(如TUNEL)仍然被广泛应用，但是caspase-3活化特异指示凋 亡进入不可逆阶段，加之检测方法的简单和多样，已成为极有应用价值的凋亡标志。Annexi n V不仅可以用于体外细胞凋亡的观察，而且对其体内应用的初步尝试，为疾病状态下凋亡 的在体定位监测提供了新思路。总之，随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，对凋亡标志 的认识将会逐步更新和完善。
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【作者简介】张爱群(1963-)，女(汉族)，江苏东海人，在读博士参考文献
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【收稿日期】2000-06-15 【修回日期】2000-07-26
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凋亡(apoptosis)是一种无论从形态表现还是发生机制上均明显区别 于坏死的细胞死亡方式，它是多细胞生物个体发育过程中细胞选择性死亡的基本形式，也参 与生理状态下多余或受损细胞的清除，以维持细胞增殖与死亡之间的动态平衡[1] 。正常凋亡过程的受抑或异常启动是多种疾病发生的病理学基础，如肿瘤、自身免疫病、退 行性疾病等。因此，阐明凋亡发生和调控的分子机制，对于充分揭示和有效干预病理状态下 的细胞增殖或死亡具有重要意义。与凋亡过程分子机制研究进展迅速，不断有新的调控因子 被发现相比，对凋亡发生过程的检测，尤其针对体内复杂的生理或病理条件下细胞凋亡现象 的识别，至今仍缺乏一个全面准确的评判标准。为此，我们在概括地描述细胞凋亡的信号传 递途径、典型表征出现的分子机理的基础上，详细介绍凋亡标志的研究进展及相应检测手段 ，为实际应用提供参考。
1.凋亡信号传递的基本过程
大量的研究结果表明，凋亡是一个由适宜刺激启动、细胞内多种蛋白成分参与 并且受到精细 调控的主动过程。尽管对于不同刺激或者不同的细胞类型，凋亡信号传递通路上的某些具体 环节不尽相同，但是从凋亡发生的总体趋势上看，可以将其划分为以下3个阶段[2] ：
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1.1 启动期：凋亡刺激信号通过中介激活起始caspases。以研究得比较清楚的Fas(CD95 ) 死亡受体为例，Fas配体与膜受体Fas的特异结合，通过中间蛋白FADD(Fas-associated dea th domain protein)使胞浆内的caspase-8由无活性的酶原转化为活性酶。
以caspase-8为代表的起始或上游caspases一旦活化，除继续传递凋亡信号给下游的caspas e s之外，本身作为蛋白酶开始对细胞骨架蛋白及其相关蛋白进行水解切割，后者包括Vimenti n、Actin、Fodrin等，使细胞呈现凋亡早期的形态学变化，如细胞皱缩、“大疱”形成。另 外，caspase-8还通过作用于某些膜酶类，改变膜脂质的分布状态，使正常存在于膜胞浆 侧的磷酯酰丝氨酸翻转向外暴露于膜表面，有关机制后有详述。
1.2 决定期：起始caspases活化下游caspases，凋亡过程不可逆转。位居下游的caspas es ，如caspase-3、6和7，尤其caspase-3的活化是凋亡发生分子通路上的关键环节，无论从 死 亡受体起始，还是通过线粒体途径启动凋亡，均在此汇聚，即caspase-3由酶原转化为活性 酶。caspase-3等下游caspases具有自催化和它催化的特点，以此形成正反馈环路，使凋亡 信号呈级联式放大。
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凋亡信号通过线粒体的传递途径包括两种因子由线粒体释放入胞浆，一是AIF(apoptosis in itiating factor)，它一种分子量为50kD的蛋白酶，除了能使下游caspases活化外，还参与裂解DNA。另一种促凋亡因子是细胞色素C(也称Apaf 2)，它在胞 浆中作用于Bc1-2/Apaf-1/caspase-9前体复合物，使Apaf-1脱离Bc1-2的抑制 ， 在ATP的辅助下，裂解caspase-9酶原生成有活性的caspase-9，后者进一步激活caspase- 3。
1.3 执行期：活化的下游caspases对靶蛋白进行切割，细胞呈现凋亡的典型形态学改变 。下 游caspases，或称执行caspases一经活化，即作用于细胞内与细胞生存密切相关的多种结构 和功能蛋白质，后者的瓦解或者失活，使细胞表现出一系列特有的形态学变化和生化特征。 (1)参与DNA修复的PARP[Poly(ADP-ribose)polymerase]失活，同时DFF、CAD等核酸内切 酶 的活化，使DNA在核小体连接处被切割，产生成倍于180～200bp大小的DNA片段。(2)细胞骨 架蛋白及相关蛋白如actin、spectrin、PAK2等的降解，使细胞失去正常形态。(3)位于细胞 - 细胞、细胞-细胞外基质接触位点上的VMEKK-1、FAK等蛋白蛋激酶失活，使细胞失去与环 境 之间的联系，进一步加速凋亡进程。(4)涉及染色质结构及染色质与核基质相互作用的蛋白 质，如NuMa的受累，染色质发生凝聚，并沿核周呈块状分布。(5)核中间丝蛋白LaminA和B的 降解，使核囊结构解体。(6)转谷氨酰胺酶被诱导合成，并聚集于近胞膜处，催化微管微丝 蛋白的交联，在胞膜下形成牢固的蛋白分子支架，防止细胞内容物的外泄。
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2.凋亡的标志及其检测方法
所谓凋亡标志，即能够表明凋亡而非其他形式的死亡，在一既定环境中发生的 特有指征。显然，与坏死膜结构肿胀崩解、内容物外泄截然不同的细胞皱缩、染 色体凝聚等 形态学改变，不仅是几十年前凋亡命名的依据，而且至今仍然是判定凋亡发生的金标准，对 新的凋亡标志物的评价也往往以上述形态学改变为参照。然而此标准在实际应用时往往遇到 问题，如形态学特征出现于凋亡过程的后期，凋亡细胞将被周围细胞吞噬清除，因此单纯以 形 态改变为依据往往低估了凋亡在细胞群体中发生的频率。另外，体内一些具有体积小、核质 浓聚等形态特征的细胞如多形核白细胞、少突胶质细胞，以及正处于分裂期的正常细胞，在 光镜下易与凋亡细胞混淆。因此，人们在对凋亡信号传递分子机制进行不断探索的同时，找 到了一系列凋亡的分子标志，其中几种已得到广泛的应用，现分述如下。
2.1 核小体间DNA的切割
内源性核酸内切酶的活化发生于凋亡过程的早期，其作用对象乃染色质内高度螺旋卷曲、并 与核蛋白呈结合状态的DNA分子，因此切割作用只在有限的范围，即核小体间的连接处进行 ，产生一定长度的DNA片段。而细胞坏死时，溶酶体释放的核酸内切酶及外切酶共同作用于 结构松散的染色质DNA，产物为长短不一的DNA片段。就切割性质而言，凋亡DNA的切割类似D NA酶I样作用，缺口处的3羟基末端，是原位标记检测方法建立的基础[3]。
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2.1.1 DNA梯度：凋亡时发生在核小体间的DNA切割，经琼脂糖凝胶电泳，呈现出长度为18 0～200bp多倍体的阶梯样DNA谱带，而细胞坏死时DNA碎片则呈涂布式连续分布。此方法最 大的 缺点是不能对同时存在的凋亡和非凋亡细胞进行甄别，而且只有当凋亡细胞占有一定比例时 ，才能在凝胶上得到易分辨的DNA梯度。电泳前对DNA切割点进行酶促修饰，可以大大提高检 测灵敏度，减少样品用量，但应注意此修饰不应使DNA片段的长度发生明显改变而干扰对梯 度的观察。另外有报道，在某些细胞的凋亡过程中，并无核小体间DNA切割的发生[4] 。因此，DNA梯度的出现特异地提示凋亡发生，但是未见DNA梯度并不能完全排除凋亡。
2.1.2 DNA切割的原位显示：针对DNA切割后产生的断端，利用酶催化已标记的脱氧单核苷酸或者DNA片段连接其上，通过 标 记物显示切割发生的部位，候选酶类包括，模板非依赖性的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、E .coli DNA聚合酶I或其Klenow片段，以及T4DNA连接酶等，其相应的检测方法分别为TUNEL( TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)、ISEL(in situ end labeling)及标记D N A片段的原位连接，其中以TUNEL最为常用。此类方法能够检测到尚未发生明显形态改变的凋 亡细胞，提高了检出率。
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然而，DNA切割并不是凋亡特有的现象，也见于DNA复制、DNA可修复性损伤、细胞坏死等生 理或病理状态下。从理论上讲，TUNEL对凋亡的特异性高低取决于TdT的底物特异性和凋亡是 否具有特殊的DNA剪切方式。TdT选择性作用于单链DNA和双链DNA的3突出端，而对5突出 端 及钝性末端作用较弱，钴离子可以提高TdT对后两者的催化效率[5]。就凋亡与非凋 亡 细胞DNA的切割方式有无区别，至今尚无定论，一般认为，核小体间DNA的切割方式是单链多 切口[6]，因此推测存在着单链缺口和3种形式的双链断端，即3突出、5突出 及 钝性末端，事实上这些剪切形式均可出现于正常及坏死细胞中，然而据Didenko和Hornsby报 道[7]，凋亡时出现 3单碱基突出末端，而在非凋亡情况下不出现或极少出现， 据 推测此现象与I型DNA酶样作用及凋亡时DNA的有限性剪切有关。显然，TdT对此末端缺乏特异 性。
TUNEL方法简单，敏感性强，尤其可以直接用于组织切片和进行定量检测，因此成为凋亡研 究的常用方法。但是在应用过程中应考虑本法对凋亡的特异性、方法本身的可靠性等因素， TUNEL阳性不能完全排除非凋亡DNA切割的可能性[8]，而且操作处理不当，如蛋白 酶 消化过度、TdT过量、过氧化氢对组织的破坏等均可能导致假阳性出现[9]。为此 ，除 了优化实验条件，设立适当的阳性及阴性对照外，应同时对阳性细胞进行形态学观察，排除 坏死灶，将有助于对凋亡细胞的识别。
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2.2 膜磷脂酰丝氨酸(PS)的翻转
2.2.1 PS翻转与凋亡：如前所述，PS翻转暴露于细胞膜表面，是凋亡早期指征之一。正常 情况下，PS、磷脂酰乙醇胺等氨基磷脂固定分布于膜内侧，而神经磷脂如磷脂酰胆碱则位于 膜 外侧，这种膜质分布的不对称性，最早见于红细胞，后来发现广泛存在于有核细胞的细胞膜 。此分布状态的维持有赖于一种转位酶(translocase)，它将出现于膜外侧的氨基磷脂转运 至膜内侧。凋亡发生时，活化时caspases使转位酶的作用方向发生逆转或失活，或者激活另 一种与之作用相反的酶--Scramblase，与此同时，细胞骨架交联蛋白fodrin的降解使PS失 去膜内侧的固定点，PS遂大量出现于细胞外表面，而此时细胞膜仍保持完整[10]。 暴露 于细胞表面的PS类似分子标签，吞噬细胞通过受体结合方式识别并吞噬表面显示PS的凋亡细 胞 ，如同衰老红细胞的清除过程。PS翻转存在于从启动期末到凋亡细胞或凋亡小体被吞噬之前 的一个相对较长的时间范围内，而且它与启动方式无关，增加Bcl-2的表达或抑制细胞大分 子合成能够阻止凋亡形态学改变的发生，同时也制止了PS在膜表面的出现[11] 。因此，PS翻转是凋亡发生的特异指征。
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2.2.2 Annexin V: Annexin V是一种具有抗凝作用的蛋白质，最初从脐带动脉组织中分离 获得，后经cDNA克隆及测序被确定为 Annexin 超家族中的一员。 Annexin V在毫摩尔浓度C a+2的存在下，与PS发生特异且强烈的结合[12]，后者可以通过与 Annexin V偶联 的标记物，如biotin、FITC 原位显示出来。 Annexin V不能穿过细胞膜，无法与膜内侧的P S结合，因此正常细胞不显示 Annexin V结合信号。为了排除细胞坏死或自溶时 Annexin V 漏入而造成的 Annexin V与膜内侧PS结合，可同时使用不能穿透胞膜的核酸染料PI(propidi um iodide)。
2.2.3 Annexin V结合法在凋亡研究中的应用：由于利用 Annexin V对PS在细胞膜上分布 状态的观察有赖于完整细胞膜的存在，故 Annexin V结合法主要用于对悬浮细胞凋亡的研究 ，若用于贴附生长的细胞，应注意刮取细胞时有可能破坏细胞膜，产生类似坏死细胞的强 结合信号，Annexin V与某些细胞染料同用则有助于判断。
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最近几项研究结构初步证明体内应用 Annexin V是可行的，从而可以在组织切片上原位观察 被 Annexin V标记的凋亡细胞。Van den Eijnde等[13]曾将生物素标记的Annexin V注入胎鼠心脏 ，以此在整体水平上观察发育过程的某一阶段凋亡细胞的空间分布情况。另外，用99m锝标 记的 Annexin V可以通过同位素扫描进行无创性检测，被诱导发生凋亡的组织呈现出数倍于 正常组织的放射性信号[14]。然而 Annexin V用于体内尚有不少问题有待解决，首 先 与体外应用一样， Annexin V本身不能分辨可能同时存在的凋亡和坏死，而PI等染料对生物 体有毒，不能用于体内；其次，Annexin V是机体产生的具有多种生物学功能的蛋白质，外 源Annexin V进入体内可能会干扰凝血等生理过程；另外，对标记 Annexin V在体内的分布 状况、代谢动力学等研究较少。尽管如此， Annexin V为在体定位观察组织细胞凋亡的动态 过程、探讨干预措施的有效性和作用机理带来希望。
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2.3 Caspase-3
回顾细胞凋亡分子机理研究的历史，有两个关键性问题的相继突破引人注目，一是找到了控 制 美丽线虫早期发育过程中细胞凋亡的3个基因--ced-3、ced-4和ced-9，提示凋亡是 由 细胞内在机制操纵的主动过程；二是在此基础上发现哺乳动物细胞存在一组与ced-3编码 产 物结构相似的蛋白质，即ICE家族，对后者结构、功能及不同成员间相互关系的进一步揭示 ，大大加快了凋亡分子机理研究的步伐。ICE家族是一类半胱氨酸蛋白酶，其切割点位于门 冬氨酸之后故也称作caspases(cystein-dependent aspartate specific protease)。目前 为止已发现多达14种的caspases ,根据结构相似程度把研究的比较清楚的前10种caspases划分为ICE样(caspase-1,4,5)、C PP32样。(caspase-3,6～10)及ICH-1样(casppase-2)3个亚群。大量研究结果表明，CPP3 2 亚群是构成凋亡信号传递通路的基本要素，其中caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇 聚 点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志，并且活化的caspase-3将作用于包括细胞结构和 功能蛋白、酶类及其他caspases,如caspase-2,3,6,7,9在内的多种蛋白质，最终使细胞 呈现典型的凋亡形态学改变[15]。为此，越来越多的研究者将caspase-3活化作 为凋亡发生的分子标志。
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Caspase-3活化的直接检测是利用抗活化形式caspase-3的特异抗体，对组织切片进行免疫 组织化学染色，以确定发生凋亡的细胞个体[16]。另外应用比较多的是生化检测法 ， 如Western blot 和 caspase-3酶活性测定。前者使用能同时识别caspase-3酶原和亚单 位 的抗体，显示出支持膜上的活性亚单位，后者与酶原的分子量不同，故易分辨[17] 。 酶活性测定则是以人工合成的荧光标记短肽DEVD-AFC为底物，caspase-3在连接处进行切 割，游离下来的AFC发光，其强度与活性caspase-3的量成正比[18]，但该法测得 的是 caspase-3样作用，而非专一反映caspase-3活性。最近，Komoriya等[19]以能穿 过 细胞膜的标记底物为探针，观察活细胞凋亡过程中caspase-3的活化。此外利用caspase-3 的 特异抑制物可以间接证明细胞是通过凋亡方式死亡，或者在凋亡已被明确的前提下，应用ca spase抑制物反过来判断某种caspase是否参与了凋亡过程。
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2.4 Caspase切割产物
据统计，至少有40种蛋白是caspase的切割目标，其中数种与凋亡表征及细胞死亡之间 的关系已得到阐明，有的已被看作凋亡发生的标志。
PARP参与DNA损伤修复过程，对DNA结构完整性的维持起着重要作用。PARP是多种casppases 作用的靶点，116kD的功能单体被水解为89kD和25kD长短两部份，据称这一切割方式不同于 坏死时的PARP降解。Kim[20]等进一步研究发现，25kD短链牢固结合在DNA缺口处， 而89kD长链则 与其他单体分子发生聚合，进一步使PARP失活，阻止DNA修复机制发挥作用。对PARP切割产 物的检测主要通过Western blot，也有使用抗89kD特异抗体的报道[21]。另外 细胞骨架蛋白或核基质蛋白的瓦解是一系列细胞形态学变化发生的分子基础。利用特异抗体 检测原有抗原决定簇的改变或者新的抗原性状的出现，均可以判断这些蛋白的存在状态，如 cytokeratin 18、 actin和fractin等[22]。
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3.结束语
细胞凋亡作为一种独特的生命现象，其发生和调控的分子机理几年来始终是生物学领域的研 究热点。尽管尚有许多细节问题有待进一步阐明，但是已经建立的对凋亡信号传递通路上诸 多元素的地位和作用、凋亡表现特征出现的分子基础等关键问题的认识，为新的凋亡标志 物的确立拓宽了视野，但遗憾的是，至今仍无一个公认的、可以独立指示凋亡且不受应用 范围限制的凋亡特异标志。有研究结果显示[23]，凋亡与坏死之间并无绝对严格的 界 限，两者可以共用同一条信号传递路径，尤其是刺激作用的早期；或者由于某种原因凋亡信 号传递中断，代之以坏死告终，此时细胞可兼有两种死亡特征，因此推测面向凋亡特异 性标志的窗口已很窄。另外凋亡的动态特征及在细胞群体中发生的不平衡性，决定了很难以 单一指标描述细胞凋亡发生的全貌。
鉴于上述原因，目前凋亡相关研究采用两个以上指标的联合应用(如分子标志物与形态学、caspase-3与其作用产物)，旨在提高特异性和灵敏度。尽管形态学观察和DNA切割产物的检 测(如TUNEL)仍然被广泛应用，但是caspase-3活化特异指示凋 亡进入不可逆阶段，加之检测方法的简单和多样，已成为极有应用价值的凋亡标志。Annexi n V不仅可以用于体外细胞凋亡的观察，而且对其体内应用的初步尝试，为疾病状态下凋亡 的在体定位监测提供了新思路。总之，随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，对凋亡标志 的认识将会逐步更新和完善。
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【作者简介】张爱群(1963-)，女(汉族)，江苏东海人，在读博士参考文献
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【收稿日期】2000-06-15 【修回日期】2000-07-26
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