人食管癌细胞核基质的研究
作者：陈海滨 邱殷庆 张锦堃 陈玲 任显辉 杨蕾
单位：陈海滨 张锦堃 陈玲(汕头大学医学院组织学胚胎学教研室，汕头 515031)；邱殷庆 任显辉 杨蕾(香港中文大学解剖学系，香港)
关键词：核基质；食管癌细胞；形态学；电泳
解剖学报000116 摘 要：目的 研究人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质形态及蛋白成分。 方法 应用细胞的选择性抽提、DGD包埋-去包埋剂电镜制样观察核基质形态，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳和免疫印迹等分析核基质蛋白成分。 结果 抽提后，两种细胞内均存在精细的核基质-核纤层-中间丝网架。低分化的EC1细胞核基质较高分化的EC18更细密。核基质蛋白电泳显示，两株细胞有数种相同的核基质蛋白成分，也有各自的特异性核基质蛋白。在免疫印迹分析中，使用抗人NuMA单克隆抗体检测到两株食管癌细胞中都存在NuMA蛋白。 结论 在食管癌细胞中，存在特异的核基质蛋白，核基质-核纤层-中间丝形成一个连续的体系，对维持细胞核的完整性和细胞功能起重要作用。
, 百拇医药
分类号：R735.1；Q279 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-65
THE NUCLEAR MATRIX IN HUMAN ESOPHAGEAL
CARCINOMA CELLS
CHEN Hai-bin
(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)
QIU Yin-qing
(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)
, 百拇医药
ZHANG Jin-kun
(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)
CHEN Ling
(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)
REN Xian-hui
(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)
, http://www.100md.com
YANG Lei
(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)
Abstract：Objective To investigate the nuclear matrix in two human esophageal carcinoma cell lines EC1 and EC18. Methods The fine structures of nuclear matrix were observed by DGD(diethylene glycol distearate) embeddment-free sections and the electrophoretic pattern of the nuclear matrix proteins was compared by SDS-PAGE,two-dimensional PAGE and Western blot analysis. Results The nuclear matrix-lamina-intermediate filament fine network remained after selective extraction.The nuclear matrix of the less differentiated EC1 cells was much thinner and denser than that of the more differentiated EC18.Both cell lines shared myriad common nuclear matrix proteins,but cell line specific nuclear matrix proteins was detected.Western blot analysis with anti-NuMA revealed that nuclear mitotic apparatus protein presented in nuclear matrix proteins of two cell lines. Conclusion There are esophageal carcinoma cell specific nuclear matrix proteins and the nuclear matrix-lamina-intermediate filament forms a continuous system which plays an important role in the maintenance of the nuclear integrity and cellular function.
, 百拇医药
Key words：Nuclear matrix; Esophageal carcinoma cells; Morphology; Electrophoresis▲
核基质是细胞核内非染色质蛋白的纤维网架，真核细胞在用非离子去垢剂、核酸酶和高盐溶液处理后，核内残留成分的98%以上为蛋白质，此外还有少量RNA和DNA。核基质构成细胞核的三维网架体系，在DNA复制、特异基因转录、RNA修饰、染色质包装、染色体形成和松解以及细胞分裂和分化等细胞生命活动中起重要作用[1]。在肿瘤形成中，特殊基因的活化和表达与核基质蛋白组成的变化息息相关。有研究表明，人体肿瘤的发生、发展过程伴随着核基质蛋白的特异性改变[2～5]，探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变，不仅有利于寻找肿瘤标志物，也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理。本研究应用细胞的选择性抽提二硬脂酸二甘酯(diethylene glycol distearate，DGD)包埋-去包埋剂电镜制样、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳和免疫印迹分析，观察比较了人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质。
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材料和方法
1. 细胞及其培养
人食管癌细胞株EC1和EC18由香港中文大学分别从食管低分化鳞癌和高分化鳞癌手术标本建立。本实验所用EC1是传代至63～67代之间的细胞，EC18是传代至69～72代之间的细胞。两种细胞均培养于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/L链霉素的RPMI 1640中，置5% CO2，37℃培养箱内，传代时用胰蛋白酶消化。
2. 核基质抽提
参照Yang[6]的方法，收获培养的EC1、EC18细胞经DPBS洗涤后，再置于CSK缓冲液(100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,1.2mmol/L苯*****，10mmol/L PIPES pH6.8,300mmol/L Sucrose,0.5% Triton X-100,4mmol/L 氧钒核苷复合物)中4℃处理15min，离心沉淀后，用RSB缓冲液(42.5mmol/L Tris-HCl,8.5mmol/L NaCl,2.6mmol/L MgCl2,1.2mmol/L苯*****，1%Tween 40,0.5%脱氧胆酸钠，2mmol/L氧钒核苷复合物)悬浮沉淀细胞，4℃作用10min，离心后再用DB溶液(基本成分与CSK缓冲液相同，仅以50mmol/L NaCl代替100mml/L KCl)悬浮细胞并加入200mg/L DNaseⅠ室温消化30min，然后加入冷的2mmol/L(NH4)2SO4，使其终浓度为0.25mmol/L,取离心淀淀物，用于电镜样品制备。
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3. DGD包埋-去包埋剂电镜样品制备
抽提后的标本用2.5%戊二醛-CSK溶液4℃固定1h，1%锇酸固定30min，系列乙醇脱水，正丁醇过渡，DGD浸透包埋，切片，厚0.2μm，置镍网上干燥，在室温正丁醇中溶去包埋剂，然后由乙醇经系列Freon 13置换到纯Freon 13中，临界点干燥后，不经染色，直接用HITACHI H-7100型电子显微镜75kV观察。
4. SDS-PAGE及双向电泳分析
肿瘤细胞经选择性抽提后制备的样品溶解在蛋白溶解缓冲液中(8mol/L尿素，20mmol/L吗啉乙烷磺酸，1mmol/L EGTA,0.1mmol/L MgCl2,1mmol/L苯*****，1% β-疏基乙醇)，通过透析缓冲液(150mmol/L KCl,25mmol/L 盐酸咪唑，5mmol/L MgCl2,2mmol/L DDT,0.125mmol/L EGTA,0.2mmol/L苯*****)4℃透析过夜和低温超速离心去除中间纤维，获得的核基质蛋白溶解于样品缓冲液中，按常规方法进行SDS-PAGE。分离胶浓度为10%，150V恒压电泳1.5h。双向电泳时，先用Bio-Rad微型等电聚焦电泳装置进行第1向电泳，等电聚焦的pH梯度为3～10，电泳7 000伏特小时，等电聚焦电泳后的样品按SDS-PAGE的方法进行第2向电泳。上述电泳样品均银染后观察。
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5. 免疫印迹分析
EC1、EC18细胞的核基质蛋白经SDS-PAGE电泳后，在100V，4℃，1h的条件下，电转移至硝酸纤维素膜上，用TBS洗涤后，置含5%脱脂奶粉的TBS中室温封闭1h，加鼠抗入NuMA蛋白(nuclear mitotic apparatus protein)单克隆抗体(1∶1 000稀释，DBS产品)，室温孵育2h;HRP标记的抗鼠IgG室温孵育1h，DAB-H2O2溶液显色。
结果
1. 食管癌细胞核基质-核纤层-中间丝的形态结构
电镜下观察，EC1和EC18细胞均存在精细发达的核基质-核纤层-中间丝结构体系。核基质网络基本上由纤维结构和许多附着在纤维上的致密颗粒组成。纤维粗细相似，均匀地遍布于整个细胞核中，致密颗粒大小不一。核纤层连续包绕细胞核，呈片状结构，向内与核基质纤维连接，向外与细胞质内的中间丝连接。中间丝分布于细胞质中，呈索状结构(图1，2)。EC1的核基质与EC18相比，纤维更加细密(图3，4)。此外，有些细胞核内尚可看到核仁基质，也是由纤维样结构和颗粒样结构组成，纤维聚集成团，比核基质更加致密，周围与核基质纤维相连(图5)。
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图1 EC1细胞的核基质(n)-核纤层(l)-中间丝(f)体系透射电镜图，DGD包埋切片。 ×4 000
Fig.1 The muclear matrix(n)-lamina(l)-intermediate filament(f) of EC1 cells under TEM, DGD embedded section. ×4 000
图2 EC1细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。 ×30 000
Fig.2 The nuclear matrix of EC1 cells under TEM,DGD embeded section. ×30 000
, 百拇医药
图3 EC1细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。 ×12 000
Fig.3 The nuclear matrix of EC1 cells under TEM,DGD embeded section. ×12 000
图4 EC18细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。 ×12 000
Fig.4 The nuclear matrix of EC18 cells under TEM,DGD embeded section. ×12 000
图5 EC1细胞的核基质和核仁基质(↑)透射电镜图，DGD包埋切片。 ×12 000
, 百拇医药
Fig.5 The muclear matrix and nucleolar matrix(↑) of EC1 cells under TEM,DGD embeded section. ×12 000
2. 食管癌细胞核基质蛋白成分分析
经选择性抽提后的肿瘤细胞核基质蛋白主要由一些水不溶性蛋白成分组成，SDS-PAGE电泳显示，电泳条带较多，蛋白成分复杂。两株细胞中既有大量共同存在的核基质蛋白(200～150kD,80～50kD)，也有一些仅在一种细胞内存在的蛋白(大于200kD，116～97kD，50～30kD)(图6)。使用免疫印迹分析技术对所研究的细胞核基质蛋白进行分析，两株细胞的核内都有一种基本的核基质蛋白——NuMA，分子量约为240kD(图7)。在SDS-PAGE电泳图谱上显示的这些蛋白很难作进一步分析，而在双向电泳图谱上则能清晰地看出两株细胞各有数10种不同等电点及不同分子量的蛋白点(图8，9)。其中数种，如分子量62kD、等电点5.3的蛋白(图8，9中箭头所指)，是两株细胞共存的核基质蛋白；另有几种，如分子量60kD、等电点5.6的蛋白(图8中双箭头所指)是EC1细胞型特有的，分子量60kD、等电点5.2的蛋白(图9中双箭头所指)是EC18细胞型特有的。
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图6 EC1、EC18细胞核基质蛋白的SDS-PAGE图。1.低分子量标准，2.EC18，3.EC1，4.高分子量标准。
Fig.6 SDS-PAGE graph of nuclear matrix proteins in EC1 and EC18 cells.Lane 1,low molecular weights standard;Lane 2,EC18;Lane 3,EC1;Lane 4,high molecular weights standard.
图7 EC1、EC18细胞核基质蛋白中NuMA免疫印迹分析。1.EC1，2.EC18，3.分子量标准
Fig.7 Western blot analysis indicated NuMA in nuclear matrix proteins of EC1 and EC18 cells.Lane 1,EC1;Lane 2,EC18;Lane3,molecular weights standard.
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图8 EC1细胞核基质蛋白双向电泳图。m.分子量标准
Fig.8 Two-dimensional PAGE analysis of nuclear matrix proteins in EC1 cells.Lane m,molecular weights standard.
图9 EC18细胞核基质蛋白双向电泳图。m.分子量标准
Fig.9 Two-dimensional PAGE analysis of nuclear matrix proteins in EC18 cells.Lane m,molecular weights standard.
讨论
, 百拇医药 食管癌细胞株EC1、EC18，经CSK缓冲液处理，细胞内大部分可溶性蛋白和全部脂质被抽提；继之用RSB缓冲液进一步抽提胞质内的微丝、微管等成分；DNase和(NH4)2SO4分别除去染色质中的DNA和核内的组蛋白成分，再结合DGD包埋去包埋剂电镜技术，在细胞中显示出清晰、对比良好的核基质-核纤层-中间丝，它们形成一个相互联系的结构体系。在常规的树脂包埋、超薄切片，通过电子染色仅能显示切片表面的结构，包埋介质可以湮没生物标本内部细胞质和细胞核内精细的蛋白纤维网架[7]，将不能显示该结构体系。核基质纤维上附着的许多大小不等的致密颗粒，可能是核内不均一核糖核蛋白(HnRNP)颗粒。若核基质经RNase作用，HnRNP中的RNA被消化，核基质结构就会崩解或聚集[8]。本研究在核基质抽提过程中，加入了RNase抑制剂(氧钒核苷复合物)，防止内源性RNase和DNase中混杂的RNase对RNA的消化，使致密颗粒保存良好，结构清晰。在电镜制样、切片过程中，仍有部分中间丝结构的丢失，若结合整装电镜制样观察，更易获得完整的中间丝结构。
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核基质与细胞分化，DNA复制，基因表达等细胞的生命活动密切相关，核基质的稳定性是判断细胞在不同功能状态下核活动的参数之一[6]。在未分化细胞、幼稚或胚胎细胞及肿瘤细胞，与细胞分化有关的特异基因活化，细胞增殖活跃，核内不断进行DNA复制和基因转录等，核基质蛋白与新合成的DNA，RNA和相关蛋白相互紧密结合，不易被去垢剂和核酸酶抽提，具有较高的稳定性。与此相反，分化较成熟或终末分化的细胞已处于细胞生长的最后阶段，细胞分裂停止，核活动减弱，没有大量的结合物质连接核基质，松散的核基质在抽提过程中容易去除。我们的实验结果显示，分化程度较低的EC1细胞具有比高分化的EC18更为致密的核基质结构，也支持这种结论。核仁是细胞内非常重要的一个细胞结构，去包埋剂超薄切片技术清晰地显示出核仁内部的精细核仁骨架体系，但有关核仁骨架的形态结构，组成成分和功能都不太清楚，有待进一步研究。
恶性肿瘤的发生发展是多因素、多阶段与多基因作用的结果，主要与癌基因和抑癌基因的改变有关。由于活化的基因和许多基因调控因子结合在核基质蛋白上，核基质蛋白的改变与基因调控的改变直接相关，细胞行为的改变必然在核基质蛋白的改变上有所反映。国外最近报道在膀胱癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]等肿瘤的手术标本和细胞株中，应用双向电泳分析，发现了6种肿瘤特异的核基质蛋白。Yanagisawa等[5]应用DNA亲和纯化的方法，从乳腺癌细胞株获得1种114kD的核基质蛋白与43例乳腺癌标本核基质结合区DNA特异结合。本研究发现EC1、EC18细胞中分子量62kD、等电点5.3的核基质蛋白与Chew等[9]在肝细胞癌核基质蛋白双向电泳中确定的1种标志蛋白相同，此蛋白也可作为食管癌标志，用于病理诊断并为治疗提供新的工具。而各自的特异性核基质蛋白，又可为食管癌的分型提供基础。
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在诸多不同细胞的核基质蛋白中，除了反映细胞特异性者以外，也存在1种或多种共有蛋白，维持细胞生命活动的基本功能，肿瘤细胞也不例外。在人体正常细胞、PtK2细胞和EC1、EC18细胞等均出现NuMA及其在细胞凋亡过程中的断裂[10]，说明NuMA是细胞核基质蛋白的基本结构成分之一。■
基金项目：李嘉诚先生人才基金和广东省医学科研基金资助项目(B1997083，B1998083)
作者简介：陈海滨(1963—)，男，安徽霍山县人，医学硕士，副教授
参考文献：
[1]Baskin Y.Mapping the cell's nucleus[J].Science,1995,268(5217):1564-1565.
[2]Getzenberg RH,Konety BR,Oeler TA,et al.Bladder cancer-associated nuclear matrix proteins[J].Cancer Res,1996,56(7):1690-1694.
, 百拇医药
[3]Partin AW,Getzenberg RH,CarMichael MJ,et al.Nuclear matrix protein patterns in human benign prostatic hyperplasia and prostate cancer[J].Cancer Res,1993,53(4):744-746.
[4]Keesee SK,Meneghini MD,Szaro RP,et al.Nuclear matrix proteins in human colon cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(5):1913-1916.
[5]Yanagisawa J,Ando J,Nakayama J,et al.A matrix attachment region(MAR)-binding activity due to a p114 kilodalton protein is found only in human breast carcinomas and not in normal and benign breast disease tissues[J].Cancer Res,1996,56(3):457-462.
, 百拇医药
[6]Yang L,Yam HF,Chew-Cheng SB,et al.A morphometric study on the nuclear matrix of tumor cells in vitro[J].Int J Oncol,1996,8(5):977-981.
[7]Penman S.Rethinking cell structure[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(12):5251-5257.
[8]He DC,Nickerson JA,Penman S.Core filaments of nuclear matrix[J].J Cell Biol,1990,110(3):569-580.
[9]Chew EC,Liew CT,Wu S,et al.Electrophoretic analysis of nuclear matrix proteins in human hepatocellular carcinoma[J].Anticancer Res,1997,17(5A):3581-3585.
[10]Gueth HC,Weber K,Osborn M.Cleavage of the nuclear matrix protein NuMA during apoptosis[J].Exp Cell Res,1997,233(1):21-24.
收稿日期：1999-01-09
修回日期：1999-07-09, 百拇医药
单位：陈海滨 张锦堃 陈玲(汕头大学医学院组织学胚胎学教研室，汕头 515031)；邱殷庆 任显辉 杨蕾(香港中文大学解剖学系，香港)
关键词：核基质；食管癌细胞；形态学；电泳
解剖学报000116 摘 要：目的 研究人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质形态及蛋白成分。 方法 应用细胞的选择性抽提、DGD包埋-去包埋剂电镜制样观察核基质形态，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳和免疫印迹等分析核基质蛋白成分。 结果 抽提后，两种细胞内均存在精细的核基质-核纤层-中间丝网架。低分化的EC1细胞核基质较高分化的EC18更细密。核基质蛋白电泳显示，两株细胞有数种相同的核基质蛋白成分，也有各自的特异性核基质蛋白。在免疫印迹分析中，使用抗人NuMA单克隆抗体检测到两株食管癌细胞中都存在NuMA蛋白。 结论 在食管癌细胞中，存在特异的核基质蛋白，核基质-核纤层-中间丝形成一个连续的体系，对维持细胞核的完整性和细胞功能起重要作用。
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分类号：R735.1；Q279 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-65
THE NUCLEAR MATRIX IN HUMAN ESOPHAGEAL
CARCINOMA CELLS
CHEN Hai-bin
(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)
QIU Yin-qing
(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)
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ZHANG Jin-kun
(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)
CHEN Ling
(Department of Histology and Embryology,Shantou University Medical College,Shantou 515031,China)
REN Xian-hui
(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)
, http://www.100md.com
YANG Lei
(Department of Anatomy,The Chinese University of Hong Kong,HongKong)
Abstract：Objective To investigate the nuclear matrix in two human esophageal carcinoma cell lines EC1 and EC18. Methods The fine structures of nuclear matrix were observed by DGD(diethylene glycol distearate) embeddment-free sections and the electrophoretic pattern of the nuclear matrix proteins was compared by SDS-PAGE,two-dimensional PAGE and Western blot analysis. Results The nuclear matrix-lamina-intermediate filament fine network remained after selective extraction.The nuclear matrix of the less differentiated EC1 cells was much thinner and denser than that of the more differentiated EC18.Both cell lines shared myriad common nuclear matrix proteins,but cell line specific nuclear matrix proteins was detected.Western blot analysis with anti-NuMA revealed that nuclear mitotic apparatus protein presented in nuclear matrix proteins of two cell lines. Conclusion There are esophageal carcinoma cell specific nuclear matrix proteins and the nuclear matrix-lamina-intermediate filament forms a continuous system which plays an important role in the maintenance of the nuclear integrity and cellular function.
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Key words：Nuclear matrix; Esophageal carcinoma cells; Morphology; Electrophoresis▲
核基质是细胞核内非染色质蛋白的纤维网架，真核细胞在用非离子去垢剂、核酸酶和高盐溶液处理后，核内残留成分的98%以上为蛋白质，此外还有少量RNA和DNA。核基质构成细胞核的三维网架体系，在DNA复制、特异基因转录、RNA修饰、染色质包装、染色体形成和松解以及细胞分裂和分化等细胞生命活动中起重要作用[1]。在肿瘤形成中，特殊基因的活化和表达与核基质蛋白组成的变化息息相关。有研究表明，人体肿瘤的发生、发展过程伴随着核基质蛋白的特异性改变[2～5]，探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变，不仅有利于寻找肿瘤标志物，也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理。本研究应用细胞的选择性抽提二硬脂酸二甘酯(diethylene glycol distearate，DGD)包埋-去包埋剂电镜制样、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳和免疫印迹分析，观察比较了人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质。
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材料和方法
1. 细胞及其培养
人食管癌细胞株EC1和EC18由香港中文大学分别从食管低分化鳞癌和高分化鳞癌手术标本建立。本实验所用EC1是传代至63～67代之间的细胞，EC18是传代至69～72代之间的细胞。两种细胞均培养于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/L链霉素的RPMI 1640中，置5% CO2，37℃培养箱内，传代时用胰蛋白酶消化。
2. 核基质抽提
参照Yang[6]的方法，收获培养的EC1、EC18细胞经DPBS洗涤后，再置于CSK缓冲液(100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,1.2mmol/L苯*****，10mmol/L PIPES pH6.8,300mmol/L Sucrose,0.5% Triton X-100,4mmol/L 氧钒核苷复合物)中4℃处理15min，离心沉淀后，用RSB缓冲液(42.5mmol/L Tris-HCl,8.5mmol/L NaCl,2.6mmol/L MgCl2,1.2mmol/L苯*****，1%Tween 40,0.5%脱氧胆酸钠，2mmol/L氧钒核苷复合物)悬浮沉淀细胞，4℃作用10min，离心后再用DB溶液(基本成分与CSK缓冲液相同，仅以50mmol/L NaCl代替100mml/L KCl)悬浮细胞并加入200mg/L DNaseⅠ室温消化30min，然后加入冷的2mmol/L(NH4)2SO4，使其终浓度为0.25mmol/L,取离心淀淀物，用于电镜样品制备。
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3. DGD包埋-去包埋剂电镜样品制备
抽提后的标本用2.5%戊二醛-CSK溶液4℃固定1h，1%锇酸固定30min，系列乙醇脱水，正丁醇过渡，DGD浸透包埋，切片，厚0.2μm，置镍网上干燥，在室温正丁醇中溶去包埋剂，然后由乙醇经系列Freon 13置换到纯Freon 13中，临界点干燥后，不经染色，直接用HITACHI H-7100型电子显微镜75kV观察。
4. SDS-PAGE及双向电泳分析
肿瘤细胞经选择性抽提后制备的样品溶解在蛋白溶解缓冲液中(8mol/L尿素，20mmol/L吗啉乙烷磺酸，1mmol/L EGTA,0.1mmol/L MgCl2,1mmol/L苯*****，1% β-疏基乙醇)，通过透析缓冲液(150mmol/L KCl,25mmol/L 盐酸咪唑，5mmol/L MgCl2,2mmol/L DDT,0.125mmol/L EGTA,0.2mmol/L苯*****)4℃透析过夜和低温超速离心去除中间纤维，获得的核基质蛋白溶解于样品缓冲液中，按常规方法进行SDS-PAGE。分离胶浓度为10%，150V恒压电泳1.5h。双向电泳时，先用Bio-Rad微型等电聚焦电泳装置进行第1向电泳，等电聚焦的pH梯度为3～10，电泳7 000伏特小时，等电聚焦电泳后的样品按SDS-PAGE的方法进行第2向电泳。上述电泳样品均银染后观察。
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5. 免疫印迹分析
EC1、EC18细胞的核基质蛋白经SDS-PAGE电泳后，在100V，4℃，1h的条件下，电转移至硝酸纤维素膜上，用TBS洗涤后，置含5%脱脂奶粉的TBS中室温封闭1h，加鼠抗入NuMA蛋白(nuclear mitotic apparatus protein)单克隆抗体(1∶1 000稀释，DBS产品)，室温孵育2h;HRP标记的抗鼠IgG室温孵育1h，DAB-H2O2溶液显色。
结果
1. 食管癌细胞核基质-核纤层-中间丝的形态结构
电镜下观察，EC1和EC18细胞均存在精细发达的核基质-核纤层-中间丝结构体系。核基质网络基本上由纤维结构和许多附着在纤维上的致密颗粒组成。纤维粗细相似，均匀地遍布于整个细胞核中，致密颗粒大小不一。核纤层连续包绕细胞核，呈片状结构，向内与核基质纤维连接，向外与细胞质内的中间丝连接。中间丝分布于细胞质中，呈索状结构(图1，2)。EC1的核基质与EC18相比，纤维更加细密(图3，4)。此外，有些细胞核内尚可看到核仁基质，也是由纤维样结构和颗粒样结构组成，纤维聚集成团，比核基质更加致密，周围与核基质纤维相连(图5)。
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图1 EC1细胞的核基质(n)-核纤层(l)-中间丝(f)体系透射电镜图，DGD包埋切片。 ×4 000
Fig.1 The muclear matrix(n)-lamina(l)-intermediate filament(f) of EC1 cells under TEM, DGD embedded section. ×4 000
图2 EC1细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。 ×30 000
Fig.2 The nuclear matrix of EC1 cells under TEM,DGD embeded section. ×30 000
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图3 EC1细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。 ×12 000
Fig.3 The nuclear matrix of EC1 cells under TEM,DGD embeded section. ×12 000
图4 EC18细胞的核基质透射电镜图，DGD包埋切片。 ×12 000
Fig.4 The nuclear matrix of EC18 cells under TEM,DGD embeded section. ×12 000
图5 EC1细胞的核基质和核仁基质(↑)透射电镜图，DGD包埋切片。 ×12 000
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Fig.5 The muclear matrix and nucleolar matrix(↑) of EC1 cells under TEM,DGD embeded section. ×12 000
2. 食管癌细胞核基质蛋白成分分析
经选择性抽提后的肿瘤细胞核基质蛋白主要由一些水不溶性蛋白成分组成，SDS-PAGE电泳显示，电泳条带较多，蛋白成分复杂。两株细胞中既有大量共同存在的核基质蛋白(200～150kD,80～50kD)，也有一些仅在一种细胞内存在的蛋白(大于200kD，116～97kD，50～30kD)(图6)。使用免疫印迹分析技术对所研究的细胞核基质蛋白进行分析，两株细胞的核内都有一种基本的核基质蛋白——NuMA，分子量约为240kD(图7)。在SDS-PAGE电泳图谱上显示的这些蛋白很难作进一步分析，而在双向电泳图谱上则能清晰地看出两株细胞各有数10种不同等电点及不同分子量的蛋白点(图8，9)。其中数种，如分子量62kD、等电点5.3的蛋白(图8，9中箭头所指)，是两株细胞共存的核基质蛋白；另有几种，如分子量60kD、等电点5.6的蛋白(图8中双箭头所指)是EC1细胞型特有的，分子量60kD、等电点5.2的蛋白(图9中双箭头所指)是EC18细胞型特有的。
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图6 EC1、EC18细胞核基质蛋白的SDS-PAGE图。1.低分子量标准，2.EC18，3.EC1，4.高分子量标准。
Fig.6 SDS-PAGE graph of nuclear matrix proteins in EC1 and EC18 cells.Lane 1,low molecular weights standard;Lane 2,EC18;Lane 3,EC1;Lane 4,high molecular weights standard.
图7 EC1、EC18细胞核基质蛋白中NuMA免疫印迹分析。1.EC1，2.EC18，3.分子量标准
Fig.7 Western blot analysis indicated NuMA in nuclear matrix proteins of EC1 and EC18 cells.Lane 1,EC1;Lane 2,EC18;Lane3,molecular weights standard.
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图8 EC1细胞核基质蛋白双向电泳图。m.分子量标准
Fig.8 Two-dimensional PAGE analysis of nuclear matrix proteins in EC1 cells.Lane m,molecular weights standard.
图9 EC18细胞核基质蛋白双向电泳图。m.分子量标准
Fig.9 Two-dimensional PAGE analysis of nuclear matrix proteins in EC18 cells.Lane m,molecular weights standard.
讨论
, 百拇医药 食管癌细胞株EC1、EC18，经CSK缓冲液处理，细胞内大部分可溶性蛋白和全部脂质被抽提；继之用RSB缓冲液进一步抽提胞质内的微丝、微管等成分；DNase和(NH4)2SO4分别除去染色质中的DNA和核内的组蛋白成分，再结合DGD包埋去包埋剂电镜技术，在细胞中显示出清晰、对比良好的核基质-核纤层-中间丝，它们形成一个相互联系的结构体系。在常规的树脂包埋、超薄切片，通过电子染色仅能显示切片表面的结构，包埋介质可以湮没生物标本内部细胞质和细胞核内精细的蛋白纤维网架[7]，将不能显示该结构体系。核基质纤维上附着的许多大小不等的致密颗粒，可能是核内不均一核糖核蛋白(HnRNP)颗粒。若核基质经RNase作用，HnRNP中的RNA被消化，核基质结构就会崩解或聚集[8]。本研究在核基质抽提过程中，加入了RNase抑制剂(氧钒核苷复合物)，防止内源性RNase和DNase中混杂的RNase对RNA的消化，使致密颗粒保存良好，结构清晰。在电镜制样、切片过程中，仍有部分中间丝结构的丢失，若结合整装电镜制样观察，更易获得完整的中间丝结构。
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核基质与细胞分化，DNA复制，基因表达等细胞的生命活动密切相关，核基质的稳定性是判断细胞在不同功能状态下核活动的参数之一[6]。在未分化细胞、幼稚或胚胎细胞及肿瘤细胞，与细胞分化有关的特异基因活化，细胞增殖活跃，核内不断进行DNA复制和基因转录等，核基质蛋白与新合成的DNA，RNA和相关蛋白相互紧密结合，不易被去垢剂和核酸酶抽提，具有较高的稳定性。与此相反，分化较成熟或终末分化的细胞已处于细胞生长的最后阶段，细胞分裂停止，核活动减弱，没有大量的结合物质连接核基质，松散的核基质在抽提过程中容易去除。我们的实验结果显示，分化程度较低的EC1细胞具有比高分化的EC18更为致密的核基质结构，也支持这种结论。核仁是细胞内非常重要的一个细胞结构，去包埋剂超薄切片技术清晰地显示出核仁内部的精细核仁骨架体系，但有关核仁骨架的形态结构，组成成分和功能都不太清楚，有待进一步研究。
恶性肿瘤的发生发展是多因素、多阶段与多基因作用的结果，主要与癌基因和抑癌基因的改变有关。由于活化的基因和许多基因调控因子结合在核基质蛋白上，核基质蛋白的改变与基因调控的改变直接相关，细胞行为的改变必然在核基质蛋白的改变上有所反映。国外最近报道在膀胱癌[2]、前列腺癌[3]、结肠癌[4]等肿瘤的手术标本和细胞株中，应用双向电泳分析，发现了6种肿瘤特异的核基质蛋白。Yanagisawa等[5]应用DNA亲和纯化的方法，从乳腺癌细胞株获得1种114kD的核基质蛋白与43例乳腺癌标本核基质结合区DNA特异结合。本研究发现EC1、EC18细胞中分子量62kD、等电点5.3的核基质蛋白与Chew等[9]在肝细胞癌核基质蛋白双向电泳中确定的1种标志蛋白相同，此蛋白也可作为食管癌标志，用于病理诊断并为治疗提供新的工具。而各自的特异性核基质蛋白，又可为食管癌的分型提供基础。
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在诸多不同细胞的核基质蛋白中，除了反映细胞特异性者以外，也存在1种或多种共有蛋白，维持细胞生命活动的基本功能，肿瘤细胞也不例外。在人体正常细胞、PtK2细胞和EC1、EC18细胞等均出现NuMA及其在细胞凋亡过程中的断裂[10]，说明NuMA是细胞核基质蛋白的基本结构成分之一。■
基金项目：李嘉诚先生人才基金和广东省医学科研基金资助项目(B1997083，B1998083)
作者简介：陈海滨(1963—)，男，安徽霍山县人，医学硕士，副教授
参考文献：
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[5]Yanagisawa J,Ando J,Nakayama J,et al.A matrix attachment region(MAR)-binding activity due to a p114 kilodalton protein is found only in human breast carcinomas and not in normal and benign breast disease tissues[J].Cancer Res,1996,56(3):457-462.
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收稿日期：1999-01-09
修回日期：1999-07-09, 百拇医药