8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞抑癌基因表达的效应
作者：邓新国 郭雪 吴景兰 郭希让 庞广仁 田小莉
单位：邓新国 郭希让 庞广仁 田小莉(河南省眼科研究所，郑州 450003)；郭 雪(河南省卫生防疫站，郑州 450003)；吴景兰(河南医科大学组织学胚胎学教研室，郑州 450052)
关键词：视网膜母细胞瘤细胞；抑癌基因；原位杂交；依赖周期素蛋白激酶
解剖学报000115 摘 要：目的 探讨8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤之HXO-Rb44细胞抑癌基因表达的效应及其对细胞生长的影响。 方法 应用原位杂交、RNA斑点印迹技术检测p16INK4 mRNA、p21WAF1 mRNA、wp53 mRNA、mp53 mRNA和Rb mRNA，应用免疫组织化学和蛋白质斑点印迹技术检测PCNA-IR、p21WAF1-IR、p16-IR、pRb-IR、cdk2-IR和cdk4-IR。 结果 在人HXO-Rb44细胞内p16INK4mRNA、p21WAF1 mRNA、wp53 mRNA、mp53 mRNA及Rb mRNA位于胞质，p16-IR，p21WAF1-IR及pRb-IR主要位于胞核。在mRNA和蛋白质斑点印迹标本上，p16INK4 mRNA、p21waf1 mRNA、wp53 mRNA、Rb mRNA和p16-IR、p21WAF1-IR及pRb-IR的相对扫描数值均是实验组(经8-Br-cAMP处理)高于各自的对照组(未经8-Br-cAMP处理)，P<0.05～0.01；然而mp53 mRNA、PCNA-IR、cdk2-IR和cdk4-IR的相对扫描数值均是实验组低于对照组，P<0.05～0.01。 结论 (1)8-Br-cAMP可抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖；(2)8-Br-cAMP可上调抑癌基因的表达，包括p16INK4mRNA、p21WAF1 mRNA、wp53 mRNA、Rb mRNA及p16、p21WAF1、pRb的蛋白表达；(3)8-Br-cAMP可下调mp53 mRNA、PCNA-IR以及cdk2-IR和cdk4-IR的表达；(4)结果提示8-Br-cAMP可通过阻抑细胞周期进展相关基因的表达而抑制人HXO-Rb44细胞的生长增殖。
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分类号：R739.7+ 2 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-61
THE EFFECT OF 8-Br-cAMP ON EXPRESSION OF
ANTIONCOGENES IN HUMAN RETINOBLASTOMA
HXO-Rb44 CELLS IN VITRO
DENG Xin-guo
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
GUO Xue
, 百拇医药
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
WU Jing-lan
(Henan Health and Proventive Station,Zhengzhou 450003,China)
GUO Xi-rang
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
PANG Guang-ren
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
, 百拇医药
TIAN Xiao-li
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
Abstract：Objective To study 8-Br-cAMP effect on cell growth and antioncogene expression in human retinoblastoma HXO-Rb44 cells. Methods The p16INK4mRNA,p21WAF1 mRNA,w(wild type)p53 mRNA,m(mutant type)p53 mRNA and Rb mRNA were detected by in situ hybridization and RNA dot blot technique.The PCNA,p16,p21WAF1,pRb,cdk2 and cdk4 proteins were detected by immunohistochemistry and protein dot blot technique. Results The signals of p21WAF1 mRNA,p16INK4mRNA,wp53 mRNA,mp53 mRNA and Rb mRNA were localized in the cytoplasm of HXO-Rb44 cells.The p16-IR,p21WAF1-IR and pRb-IR were predominently localized in the nuclei.In the dot blot the relative scanning value of p16INK4 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA,Rb mRNA and p16-IR,p21WAF1-IR,pRb-IR of the exprimental groups(EG,treated with 8-Br-cAMP)was higher than that in respective control groups(CG,treated with no 8-Br-cAMP),P<0.05-0.01.However,the scanning value of the mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR of EG was lower than that in respective control groups,P<0.05-0.01. Conclusions (1)8-Br-cAMP could inhibit human HXO-Rb44 cell growth and proliferation.(2)8-Br-cAMP could up-regulate antioncogene expression,including mRNA expression of p16INK4,p21waf1,wp53 and Rb and protein expression of p16,p21WAFl and pRb.(3)8-Br-cAMP could down-regulate expression of mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR expression.(4)The results suggest that 8-Br-cAMP may decrease human HXO-Rb44 cell growth via inhibition of cell cycle progressing related gene expression.
, 百拇医药
Key words：Retinoblastoma cell; Antioncogene; In situ hybridization; CDKs▲
近年研究表明，cAMP受体可分为RⅠ及RⅡ两型，此两型通过基因调控，一般在细胞中呈正负调节因子调控细胞的生长和分化。RⅠ型促进细胞生长，抑制细胞成熟及分化，而RⅡ型则抑制细胞生长而促进细胞早期分化。关于cAMPRⅡα亚型(α亚型不具组织特异性)的选择性结合位点类似物主要有8-Cl-cAMP和8-Br-cAMP，两者效应相似[1]，前者作用更强，后者无毒性，国外多应用8-Br-cAMP于研究工作。人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞为缺失Rb基因的细胞系，恶性肿瘤的发生主要由于一方面原癌基因激活为癌基因，另一方面则可由于抑癌基因的失活。我们研究8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)HXO-Rb44细胞的有关抑癌基因表达的效应而探讨其对细胞生长的关系，至今未见有关这方面的报道。
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材料和方法
1. HXO-Rb44细胞标本的制备
将体外培养的人HXO-Rb44细胞系(湖南医科大学赠)等分为两组，1组加终浓度为2×10-5mol/L 8-Br-cAMP(Sigma)的实验组(EG)，另1组为不加8-Br-cAMP的对照组(CG)。培养24h后，最后调整细胞浓度为1×107个/ml，分别将两组的细胞悬液滴于硝酸纤维素膜(NCM)和玻片上制备两种标本。
2. NCM完整细胞mRNA斑点印迹
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”[2]介绍的方法，主要步骤依次为：滴膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的RNA，用RNA变性液在NCM下渗透变性，真空烤膜，打孔取样放入96孔板(COSTAR)内(EG和CG各9～10个样本)，预杂交后，分别加各种生物素标记的cDNA探针，包括p16INK4、p21waf1、野生型(w)p53、突变型(m)p53和Rb的cDNA探针(各探针的灵敏度达1.0～0.1pg)，进行杂交，0.1×SSC、4×15min严格洗涤，乙酰化牛血清白蛋白(acetylated BSA)封闭后，加链霉亲和素碱性磷酸酶复合物(Promega)孵育，洗涤，以四唑盐(NBT)与5-溴4-氯3-吲哚磷酸(BCIP)为底物进行显色。以不加探针杂交液和以RNase(Promega)100mg/L预消化作为阴性对照。
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3. 玻片原位杂交
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”[2]的方法，主要步骤依次为：Bouin液固定10min，5mg/L蛋白酶K(Sigma)37℃消化、10min,4%多聚甲醛后固定，乙酸酐/三乙醇胺处理，洗涤，晾干，其余步骤及所检测的mRNA和阴性对照同2。
4. NCM完整细胞蛋白质斑点印迹
应用间接酶标抗体的免疫组织化学方法，主要步骤为：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质，加0.5%吐温-20/TBS(Tris-HCl Buffer,pH7.2)封闭，加各自的第一抗血清，其中包括PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2、cdk4、(Santa、DAKO或Zymed)。0.01%吐温-20/BTS洗两次，加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(Santa)，加NBT/BCIP底物液进行免疫组织化学显色，以不加一抗或不加二抗作为阴性对照。
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5. 玻片免疫组织化学
应用常规间接酶标免疫组织化学方法检测，由于标本经过多聚甲醛固定，首先以微波炉复性组织抗原(0.01mol/L枸橼酸缓冲液pH6.0、98℃、2min)，再进行免疫组织化学反应，其余步骤及所检测的抗原和阴性对照同完整细胞蛋白质斑点印迹。
6. 结果判定
用岛津薄层层析扫描仪(波长为530nm)对基因表达的mRNA和基因表达的蛋白质产物斑点印迹信号进行扫描测定。在油镜下观察原位杂交信号及免疫组织化学反应性的定位。
结果
1. HXO-Rb44细胞内p16INK4、p21waf1、wp53、mp53、Rb的mRNA及其蛋白质表达产物的定位
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应用碱性磷酸酶显色体系全部杂交信号及免疫反应性(IR)均呈紫色细颗粒。mRNA的信号均位于细胞质，p16-IR、p21WAF1-IR及Rb-IR位于胞核及胞质，以胞核为主(图1～8)。
图1～4 人HXO-Rb44细胞p16 mRNA、p21waf1 mRNA、wp53 mRNA及Rb mRNA原位杂交信号，a为实验组(EG)，b为对照组(CG)，信号细颗粒位于细胞质，EG强于CG，×1 000；c为p16 mRNA、p21waf1 mRNA、wp53 mRNA及Rb mRNA斑点印迹信号，EG强于CG
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Fig1.1～4 p16 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA and Rb mRNA in situ hybridization signal in human HXO-Rb44 cells(Fig.a, experimental group,EG;Fig.b, control group,CG).The signal as violet-colored fine granules localizaed in the cytoplasm,EG stronger than CG,×1 000;Fig.c, p16 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA and Rb mRNA dot blot singal,EG stronger than CG
图5 人HXO-Rb44细胞mp53 mRNA原位杂交信号，a为实验组(EG)，b为对照组(CG)，信号细颗粒位于细胞质，EG弱于CG，×1 000;c为mp53 mRNA斑点印迹信号，EG弱于CG
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Fig.5 mp53 mRNA in situ hybridization signal in human HXO-Rb44 cells(Fig.a, experimental group,EG;Fig.b, control group,CG).The signal as violet-colored fine granules localized in the cytoplasm,EG weaker than CG,×1 000;Fig.c, mp53 mRNA dot blot signal,EG weaker than CG
图6～8 人HXO-Rb44细胞p16、p21WAF1及Rb免疫组织化学反应性，a为实验组(EG)，b为对照组(CG)，免疫反应细颗粒位于细胞核和细胞质，EG强于CG，×1 000;c为Rb、p21WAF1及p16蛋白斑点印迹免疫反应性(IR)，EG强于CG.
, 百拇医药
Fig.6～8 p16-IR,p21WAF1-IR and Rb-IR in human HXO-Rb44 cells(Fig.a, experimental group,EG;Fig.b, control group,CG).The IR as violet-colored fine granules localized in the nuclei and cytoplasm,EG stronger than CG,×1 000;Fig.c,p16,p21WAF1 and Rb proteins dot blot immunoreactivity(IR),EG stronger than CG
2. 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞p16INK4、p21waf1、wp53、mp53及Rb基因表达的效应(表1)
3. 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2及cdk4蛋白表达的效应(表2)
, 百拇医药
表1 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞p16INK4、p21waf1、wp53、mp53及Rb基因表达的效应(
±s,n=9)
Table 1 Effect of 8-Br-cAMP on gene expression of p16INK4,p21waf1,wp53,mp53,and Rb in human HXO-Rb44 cells(±s,n=9) mRNA
p16INK4
p21WAF1
, 百拇医药
wp53
mp53
Rb
实验组
EG*
2.69±0.91
2.43±0.57
3.47±1.12
3.27±1.69
2.89±1.01
对照组
CG*
, 百拇医药
1.63±0.72
1.44±0.87
1.45±0.64
5.28±2.02
2.18±0.72
P值
P value
<0.05
<0.05
<0.01
<0.05
<0.05
, 百拇医药
*EG:experimental group;CG:control group
表2 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2及cdk4蛋白表达的效应(±s,n=9)
Table 2 Effect of 8-Br-cAMP on protein expression of PCNA,p16,p21WAF1,Rb,cdk2 and cdk4 in human HXO-Rb44 cells(±s,n=9) 蛋白(protein)
PCNA
, 百拇医药 p16
p21waf1
Rb
cdk2
cdk4
实验组
EG*
1.28±0.48
2.27±0.60
2.86±0.75
2.84±0.59
2.51±1.52
, 百拇医药
1.81±1.00
对照组
CG*
2.53±0.91
1.59±0.84
1.90±0.68
2.21±0.71
5.64±1.12
4.76±1.45
P值
P value
<0.01
, 百拇医药
<0.05
<0.05
<0.05
<0.01
<0.01
*EG:experimental group;CG:control group
讨论
本实验以PCNA作为细胞增殖的标志，结果可见8-Br-cAMP显著降低PCNA蛋白的表达，表明8-Br-cAMP可明显抑制人HXO-Rb44细胞的生长繁殖。近年报道多肿瘤抑癌基因(multiple tumor suppressor，MTS)主要编码的p16蛋白是细胞周期进展的抑制物，主要通过抑制cdk4与周期素D1等结合，阻止细胞生长增殖[3]。本实验观察到8-Br-cAMP可上调p16INK4 mRNA的表达和p16蛋白的表达，并下调cdk4蛋白的表达，这提示8-Br-cAMP可通过MTS基因表达的p16蛋白对细胞周期进展的阻遏而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。
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野生型wp53抑癌基因抑制细胞周期的进展是间接的，wp53基因表达的p53蛋白作为DNA结合蛋白的转录因子可激活p21WAF1基因的表达，此21KD蛋白抑制cdk2主要与周期素E的结合，阻抑细胞从G1期进入S期而抑制细胞生长增殖[4，5]。本实验结果表明8-Br-cAMP可上调wp53 mRNA、p21WAF1蛋白的表达，并下调mp53 mRNA和cdk2蛋白的表达，这提示8-Br-cAMP可通过wp53激活p21WAF1间接对细胞周期进展的阻遏而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。
Rb抑癌基因编码的pRb通过cdks对其磷酸化或去磷酸化的方式在细胞周期中起调控作用，磷酸化的pRb丧失对G1期的停滞作用，而去磷酸化的pRb则有此活性。p21WAF1、p16与周期素竞争性结合cdks如cdk2、cdk4，使周期素不能激活cdks,Rb不被磷酸化，去磷酸化的pRb使细胞起始点受阻不能从G1期进入S期[6]。人视网膜母细胞瘤由于Rb基因缺失可能成为癌变的主要原因之一。本实验观察到人HXO-Rb44细胞的对照组呈很弱的Rb mRNA信号和很弱的pRb免疫反应性(图3，6)，与实验组对比8-Br-cAMP均可上调Rb mRNA及pRb的表达，提示8-Br-cAMP可通过Rb抑癌基因对细胞周期的阻抑作用而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。
, 百拇医药
抑癌基因(包括p53、p16、Rb)，在肿瘤中常因突变缺失等而失活，尤其是wp53的突变失活更为广泛。由于wp53蛋白半衰期很短，免疫组织化学显示的p53-IR多为突变形mp53蛋白-IR[7]，因此本实验应用wp53及mp53的探针分别显示了wp53 mRNA和mp53 mRNA，并未进行免疫组织化学的蛋白表达检测。p16和pRb皆为可与DNA结合的蛋白主要位于细胞核。根据本室工作经验，变性的组织抗原可反映在细胞内定位的改变，例如，由细胞核内定位改变为细胞质定位或呈阴性等。本实验在组织抗原复性处理过的免疫组织化学标本上所观察到p16和pRb蛋白的免疫反应性主要位于胞核，此外在原位杂交技术中应用42℃下0.1×SSC严格洗涤60min而控制p16及pRb野生型cDNA探针的同源性杂交，这提示本实验所显示的p16-IR及pRb-IR主要可能是呈现cdks抑制效应的野生型，但对HXO-Rb44细胞的p16及pRb基因的改变有待进一步研究。
Lukas及Shapiro报道[8，9]pRb与p16的表达两者之间呈负相关。低水平pRb可激活p16的蛋白转录，在周期素D1、cdk4、p16和pRb之间可能存在着一个反馈调节环路[10]。本实验见到虽然8-Br-cAMP均可上调3种抑癌基因的表达，但在人HXO-Rb44细胞对照组的免疫组织化学标本上对比pRb,p16免疫组织化学反应强度时，可见p16-IR最强，而pRb-IR最弱，在对照组mRNA标本上与免疫组织化学反应的结果相似(图1，3，6，8)。由于抑癌基因是通过其表达的蛋白产物尤其是蛋白质与蛋白质之间相互作用，而发挥生物学效应。因此，本实验不但在基因表达的mRNA水平上，而且也在蛋白质表达水平上进行检测，结果见到基因表达和蛋白质表达两者的变动有一致性。以上结果提示8-Br-cAMP可能通过3种抑癌基因表达(包括抑癌基因的mRNA及蛋白的表达)的上调，阻抑细胞周期的进展而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。■
, 百拇医药
基金项目：河南省科委资助项目(971200261)
作者简介：邓新国(1961—)，男，河南开封市人，医学硕士，副研究员
参考文献：
[1]Cho-chung YS,Clair T,Tortora G,et al.Supression of malignancy targeting the intracellar signal transducing proteins of cAMP:the use of site-selective cAMP analogs,antisense strategy,and gene transfer[J].Life Sci,1991,48(12):1123-1132.
[2]吴景兰，丁一.实用非放射性分子生物学实验技术[M].第1版.郑州：河南医科大学出版社，1997：56～63，88～93.
, 百拇医药
[3]Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potenliatly involved in genesis of many tumor types[J].Science,1994,264(5157):436-440.
[4]Elledge RM,Lee WH.Life and death by p53[J].Bioessays,1995,17(11):923-930.
[5]Harper JW,Adaml GR,Wei N,et al.The p21 cdk-interacting protein cip I is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases[J].Cell,1993,75(19):805-816.
[6]徐斌.RB在细胞周期调控中的作用[J].国外医学(分子生物学分册)，1995，17(5)：211～216.
, 百拇医药
[7]李家良，杨光华，李甘地.银染PCR-SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤p53基因点突变[J].中华肿瘤杂志，1996，18(1)：13～15.
[8]Lukas J,Parry D,Agaard L,et al.Retinoblastoma-protein dependent cell-cycle inhibition by the tumor supressor p16 [J].Nature,1995,375(6531):503-506.
[9]Shapiro GI,Edwards CD,Kobzik L,et al.Reciprocal Rb inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines[J].Cancer Res,1995,55(3):505-509.
[10]Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J].Nature,1993,366(6456):704-707.
收稿日期：1998-10-24
修回日期：1999-05-14, 百拇医药
单位：邓新国 郭希让 庞广仁 田小莉(河南省眼科研究所，郑州 450003)；郭 雪(河南省卫生防疫站，郑州 450003)；吴景兰(河南医科大学组织学胚胎学教研室，郑州 450052)
关键词：视网膜母细胞瘤细胞；抑癌基因；原位杂交；依赖周期素蛋白激酶
解剖学报000115 摘 要：目的 探讨8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤之HXO-Rb44细胞抑癌基因表达的效应及其对细胞生长的影响。 方法 应用原位杂交、RNA斑点印迹技术检测p16INK4 mRNA、p21WAF1 mRNA、wp53 mRNA、mp53 mRNA和Rb mRNA，应用免疫组织化学和蛋白质斑点印迹技术检测PCNA-IR、p21WAF1-IR、p16-IR、pRb-IR、cdk2-IR和cdk4-IR。 结果 在人HXO-Rb44细胞内p16INK4mRNA、p21WAF1 mRNA、wp53 mRNA、mp53 mRNA及Rb mRNA位于胞质，p16-IR，p21WAF1-IR及pRb-IR主要位于胞核。在mRNA和蛋白质斑点印迹标本上，p16INK4 mRNA、p21waf1 mRNA、wp53 mRNA、Rb mRNA和p16-IR、p21WAF1-IR及pRb-IR的相对扫描数值均是实验组(经8-Br-cAMP处理)高于各自的对照组(未经8-Br-cAMP处理)，P<0.05～0.01；然而mp53 mRNA、PCNA-IR、cdk2-IR和cdk4-IR的相对扫描数值均是实验组低于对照组，P<0.05～0.01。 结论 (1)8-Br-cAMP可抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖；(2)8-Br-cAMP可上调抑癌基因的表达，包括p16INK4mRNA、p21WAF1 mRNA、wp53 mRNA、Rb mRNA及p16、p21WAF1、pRb的蛋白表达；(3)8-Br-cAMP可下调mp53 mRNA、PCNA-IR以及cdk2-IR和cdk4-IR的表达；(4)结果提示8-Br-cAMP可通过阻抑细胞周期进展相关基因的表达而抑制人HXO-Rb44细胞的生长增殖。
, http://www.100md.com
分类号：R739.7+ 2 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-61
THE EFFECT OF 8-Br-cAMP ON EXPRESSION OF
ANTIONCOGENES IN HUMAN RETINOBLASTOMA
HXO-Rb44 CELLS IN VITRO
DENG Xin-guo
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
GUO Xue
, 百拇医药
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
WU Jing-lan
(Henan Health and Proventive Station,Zhengzhou 450003,China)
GUO Xi-rang
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
PANG Guang-ren
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
, 百拇医药
TIAN Xiao-li
(Henan Institute of Ophthalmology,Zhengzhou 450003,China)
Abstract：Objective To study 8-Br-cAMP effect on cell growth and antioncogene expression in human retinoblastoma HXO-Rb44 cells. Methods The p16INK4mRNA,p21WAF1 mRNA,w(wild type)p53 mRNA,m(mutant type)p53 mRNA and Rb mRNA were detected by in situ hybridization and RNA dot blot technique.The PCNA,p16,p21WAF1,pRb,cdk2 and cdk4 proteins were detected by immunohistochemistry and protein dot blot technique. Results The signals of p21WAF1 mRNA,p16INK4mRNA,wp53 mRNA,mp53 mRNA and Rb mRNA were localized in the cytoplasm of HXO-Rb44 cells.The p16-IR,p21WAF1-IR and pRb-IR were predominently localized in the nuclei.In the dot blot the relative scanning value of p16INK4 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA,Rb mRNA and p16-IR,p21WAF1-IR,pRb-IR of the exprimental groups(EG,treated with 8-Br-cAMP)was higher than that in respective control groups(CG,treated with no 8-Br-cAMP),P<0.05-0.01.However,the scanning value of the mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR of EG was lower than that in respective control groups,P<0.05-0.01. Conclusions (1)8-Br-cAMP could inhibit human HXO-Rb44 cell growth and proliferation.(2)8-Br-cAMP could up-regulate antioncogene expression,including mRNA expression of p16INK4,p21waf1,wp53 and Rb and protein expression of p16,p21WAFl and pRb.(3)8-Br-cAMP could down-regulate expression of mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR expression.(4)The results suggest that 8-Br-cAMP may decrease human HXO-Rb44 cell growth via inhibition of cell cycle progressing related gene expression.
, 百拇医药
Key words：Retinoblastoma cell; Antioncogene; In situ hybridization; CDKs▲
近年研究表明，cAMP受体可分为RⅠ及RⅡ两型，此两型通过基因调控，一般在细胞中呈正负调节因子调控细胞的生长和分化。RⅠ型促进细胞生长，抑制细胞成熟及分化，而RⅡ型则抑制细胞生长而促进细胞早期分化。关于cAMPRⅡα亚型(α亚型不具组织特异性)的选择性结合位点类似物主要有8-Cl-cAMP和8-Br-cAMP，两者效应相似[1]，前者作用更强，后者无毒性，国外多应用8-Br-cAMP于研究工作。人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞为缺失Rb基因的细胞系，恶性肿瘤的发生主要由于一方面原癌基因激活为癌基因，另一方面则可由于抑癌基因的失活。我们研究8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)HXO-Rb44细胞的有关抑癌基因表达的效应而探讨其对细胞生长的关系，至今未见有关这方面的报道。
, 百拇医药
材料和方法
1. HXO-Rb44细胞标本的制备
将体外培养的人HXO-Rb44细胞系(湖南医科大学赠)等分为两组，1组加终浓度为2×10-5mol/L 8-Br-cAMP(Sigma)的实验组(EG)，另1组为不加8-Br-cAMP的对照组(CG)。培养24h后，最后调整细胞浓度为1×107个/ml，分别将两组的细胞悬液滴于硝酸纤维素膜(NCM)和玻片上制备两种标本。
2. NCM完整细胞mRNA斑点印迹
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”[2]介绍的方法，主要步骤依次为：滴膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的RNA，用RNA变性液在NCM下渗透变性，真空烤膜，打孔取样放入96孔板(COSTAR)内(EG和CG各9～10个样本)，预杂交后，分别加各种生物素标记的cDNA探针，包括p16INK4、p21waf1、野生型(w)p53、突变型(m)p53和Rb的cDNA探针(各探针的灵敏度达1.0～0.1pg)，进行杂交，0.1×SSC、4×15min严格洗涤，乙酰化牛血清白蛋白(acetylated BSA)封闭后，加链霉亲和素碱性磷酸酶复合物(Promega)孵育，洗涤，以四唑盐(NBT)与5-溴4-氯3-吲哚磷酸(BCIP)为底物进行显色。以不加探针杂交液和以RNase(Promega)100mg/L预消化作为阴性对照。
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3. 玻片原位杂交
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”[2]的方法，主要步骤依次为：Bouin液固定10min，5mg/L蛋白酶K(Sigma)37℃消化、10min,4%多聚甲醛后固定，乙酸酐/三乙醇胺处理，洗涤，晾干，其余步骤及所检测的mRNA和阴性对照同2。
4. NCM完整细胞蛋白质斑点印迹
应用间接酶标抗体的免疫组织化学方法，主要步骤为：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质，加0.5%吐温-20/TBS(Tris-HCl Buffer,pH7.2)封闭，加各自的第一抗血清，其中包括PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2、cdk4、(Santa、DAKO或Zymed)。0.01%吐温-20/BTS洗两次，加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(Santa)，加NBT/BCIP底物液进行免疫组织化学显色，以不加一抗或不加二抗作为阴性对照。
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5. 玻片免疫组织化学
应用常规间接酶标免疫组织化学方法检测，由于标本经过多聚甲醛固定，首先以微波炉复性组织抗原(0.01mol/L枸橼酸缓冲液pH6.0、98℃、2min)，再进行免疫组织化学反应，其余步骤及所检测的抗原和阴性对照同完整细胞蛋白质斑点印迹。
6. 结果判定
用岛津薄层层析扫描仪(波长为530nm)对基因表达的mRNA和基因表达的蛋白质产物斑点印迹信号进行扫描测定。在油镜下观察原位杂交信号及免疫组织化学反应性的定位。
结果
1. HXO-Rb44细胞内p16INK4、p21waf1、wp53、mp53、Rb的mRNA及其蛋白质表达产物的定位
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应用碱性磷酸酶显色体系全部杂交信号及免疫反应性(IR)均呈紫色细颗粒。mRNA的信号均位于细胞质，p16-IR、p21WAF1-IR及Rb-IR位于胞核及胞质，以胞核为主(图1～8)。
图1～4 人HXO-Rb44细胞p16 mRNA、p21waf1 mRNA、wp53 mRNA及Rb mRNA原位杂交信号，a为实验组(EG)，b为对照组(CG)，信号细颗粒位于细胞质，EG强于CG，×1 000；c为p16 mRNA、p21waf1 mRNA、wp53 mRNA及Rb mRNA斑点印迹信号，EG强于CG
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Fig1.1～4 p16 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA and Rb mRNA in situ hybridization signal in human HXO-Rb44 cells(Fig.a, experimental group,EG;Fig.b, control group,CG).The signal as violet-colored fine granules localizaed in the cytoplasm,EG stronger than CG,×1 000;Fig.c, p16 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA and Rb mRNA dot blot singal,EG stronger than CG
图5 人HXO-Rb44细胞mp53 mRNA原位杂交信号，a为实验组(EG)，b为对照组(CG)，信号细颗粒位于细胞质，EG弱于CG，×1 000;c为mp53 mRNA斑点印迹信号，EG弱于CG
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Fig.5 mp53 mRNA in situ hybridization signal in human HXO-Rb44 cells(Fig.a, experimental group,EG;Fig.b, control group,CG).The signal as violet-colored fine granules localized in the cytoplasm,EG weaker than CG,×1 000;Fig.c, mp53 mRNA dot blot signal,EG weaker than CG
图6～8 人HXO-Rb44细胞p16、p21WAF1及Rb免疫组织化学反应性，a为实验组(EG)，b为对照组(CG)，免疫反应细颗粒位于细胞核和细胞质，EG强于CG，×1 000;c为Rb、p21WAF1及p16蛋白斑点印迹免疫反应性(IR)，EG强于CG.
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Fig.6～8 p16-IR,p21WAF1-IR and Rb-IR in human HXO-Rb44 cells(Fig.a, experimental group,EG;Fig.b, control group,CG).The IR as violet-colored fine granules localized in the nuclei and cytoplasm,EG stronger than CG,×1 000;Fig.c,p16,p21WAF1 and Rb proteins dot blot immunoreactivity(IR),EG stronger than CG
2. 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞p16INK4、p21waf1、wp53、mp53及Rb基因表达的效应(表1)
3. 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2及cdk4蛋白表达的效应(表2)
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表1 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞p16INK4、p21waf1、wp53、mp53及Rb基因表达的效应(
±s,n=9)Table 1 Effect of 8-Br-cAMP on gene expression of p16INK4,p21waf1,wp53,mp53,and Rb in human HXO-Rb44 cells(
±s,n=9) mRNAp16INK4
p21WAF1
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wp53
mp53
Rb
实验组
EG*
2.69±0.91
2.43±0.57
3.47±1.12
3.27±1.69
2.89±1.01
对照组
CG*
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1.63±0.72
1.44±0.87
1.45±0.64
5.28±2.02
2.18±0.72
P值
P value
<0.05
<0.05
<0.01
<0.05
<0.05
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*EG:experimental group;CG:control group
表2 8-Br-cAMP对人HXO-Rb44细胞PCNA、p16、p21WAF1、Rb、cdk2及cdk4蛋白表达的效应(
±s,n=9)Table 2 Effect of 8-Br-cAMP on protein expression of PCNA,p16,p21WAF1,Rb,cdk2 and cdk4 in human HXO-Rb44 cells(
±s,n=9) 蛋白(protein)PCNA
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p21waf1
Rb
cdk2
cdk4
实验组
EG*
1.28±0.48
2.27±0.60
2.86±0.75
2.84±0.59
2.51±1.52
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1.81±1.00
对照组
CG*
2.53±0.91
1.59±0.84
1.90±0.68
2.21±0.71
5.64±1.12
4.76±1.45
P值
P value
<0.01
, 百拇医药
<0.05
<0.05
<0.05
<0.01
<0.01
*EG:experimental group;CG:control group
讨论
本实验以PCNA作为细胞增殖的标志，结果可见8-Br-cAMP显著降低PCNA蛋白的表达，表明8-Br-cAMP可明显抑制人HXO-Rb44细胞的生长繁殖。近年报道多肿瘤抑癌基因(multiple tumor suppressor，MTS)主要编码的p16蛋白是细胞周期进展的抑制物，主要通过抑制cdk4与周期素D1等结合，阻止细胞生长增殖[3]。本实验观察到8-Br-cAMP可上调p16INK4 mRNA的表达和p16蛋白的表达，并下调cdk4蛋白的表达，这提示8-Br-cAMP可通过MTS基因表达的p16蛋白对细胞周期进展的阻遏而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。
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野生型wp53抑癌基因抑制细胞周期的进展是间接的，wp53基因表达的p53蛋白作为DNA结合蛋白的转录因子可激活p21WAF1基因的表达，此21KD蛋白抑制cdk2主要与周期素E的结合，阻抑细胞从G1期进入S期而抑制细胞生长增殖[4，5]。本实验结果表明8-Br-cAMP可上调wp53 mRNA、p21WAF1蛋白的表达，并下调mp53 mRNA和cdk2蛋白的表达，这提示8-Br-cAMP可通过wp53激活p21WAF1间接对细胞周期进展的阻遏而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。
Rb抑癌基因编码的pRb通过cdks对其磷酸化或去磷酸化的方式在细胞周期中起调控作用，磷酸化的pRb丧失对G1期的停滞作用，而去磷酸化的pRb则有此活性。p21WAF1、p16与周期素竞争性结合cdks如cdk2、cdk4，使周期素不能激活cdks,Rb不被磷酸化，去磷酸化的pRb使细胞起始点受阻不能从G1期进入S期[6]。人视网膜母细胞瘤由于Rb基因缺失可能成为癌变的主要原因之一。本实验观察到人HXO-Rb44细胞的对照组呈很弱的Rb mRNA信号和很弱的pRb免疫反应性(图3，6)，与实验组对比8-Br-cAMP均可上调Rb mRNA及pRb的表达，提示8-Br-cAMP可通过Rb抑癌基因对细胞周期的阻抑作用而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。
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抑癌基因(包括p53、p16、Rb)，在肿瘤中常因突变缺失等而失活，尤其是wp53的突变失活更为广泛。由于wp53蛋白半衰期很短，免疫组织化学显示的p53-IR多为突变形mp53蛋白-IR[7]，因此本实验应用wp53及mp53的探针分别显示了wp53 mRNA和mp53 mRNA，并未进行免疫组织化学的蛋白表达检测。p16和pRb皆为可与DNA结合的蛋白主要位于细胞核。根据本室工作经验，变性的组织抗原可反映在细胞内定位的改变，例如，由细胞核内定位改变为细胞质定位或呈阴性等。本实验在组织抗原复性处理过的免疫组织化学标本上所观察到p16和pRb蛋白的免疫反应性主要位于胞核，此外在原位杂交技术中应用42℃下0.1×SSC严格洗涤60min而控制p16及pRb野生型cDNA探针的同源性杂交，这提示本实验所显示的p16-IR及pRb-IR主要可能是呈现cdks抑制效应的野生型，但对HXO-Rb44细胞的p16及pRb基因的改变有待进一步研究。
Lukas及Shapiro报道[8，9]pRb与p16的表达两者之间呈负相关。低水平pRb可激活p16的蛋白转录，在周期素D1、cdk4、p16和pRb之间可能存在着一个反馈调节环路[10]。本实验见到虽然8-Br-cAMP均可上调3种抑癌基因的表达，但在人HXO-Rb44细胞对照组的免疫组织化学标本上对比pRb,p16免疫组织化学反应强度时，可见p16-IR最强，而pRb-IR最弱，在对照组mRNA标本上与免疫组织化学反应的结果相似(图1，3，6，8)。由于抑癌基因是通过其表达的蛋白产物尤其是蛋白质与蛋白质之间相互作用，而发挥生物学效应。因此，本实验不但在基因表达的mRNA水平上，而且也在蛋白质表达水平上进行检测，结果见到基因表达和蛋白质表达两者的变动有一致性。以上结果提示8-Br-cAMP可能通过3种抑癌基因表达(包括抑癌基因的mRNA及蛋白的表达)的上调，阻抑细胞周期的进展而抑制HXO-Rb44细胞的生长增殖。■
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基金项目：河南省科委资助项目(971200261)
作者简介：邓新国(1961—)，男，河南开封市人，医学硕士，副研究员
参考文献：
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[2]吴景兰，丁一.实用非放射性分子生物学实验技术[M].第1版.郑州：河南医科大学出版社，1997：56～63，88～93.
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收稿日期：1998-10-24
修回日期：1999-05-14, 百拇医药