肿瘤组织中端粒酶活性的研究
作者：郝玉宾 田竟生 李淑婷
单位：郝玉宾 田竟生 李淑婷(首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100054)
关键词：肿瘤；端粒；端粒酶
解剖学报000111 摘 要：目的 了解端粒酶活性高低与肿瘤恶性程度关系。方法 用TRAP-ELISA和我们改进的TRAP银染方法，对肿瘤组织端粒酶活性进行半定量检测。结果 端粒酶阳性率分别为：胶质瘤星形Ⅱ级40%，Ⅲ和Ⅳ级100%，肠癌84.62%，食管癌90%。结论 端粒酶活性与肿瘤恶性程度密切相关，是诊断恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
分类号：Q55 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-43
THE STUDY OF TELOMERASE ACTIVITY IN TUMORS
, http://www.100md.com
HAO Yu-bin
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China)
TIAN Jing-sheng
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China)
LI Shu-ting
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective To investigate the correlation between telomerase activity and pathologic grade of the tumors.Methods We detected telomerase activity in tumors by TRAP-ELISA and TRAP-Ag+ stain methods.Results Telomerase positive rate is 40% for astrocytoma Ⅱ,100% for astrocytoma Ⅲ and Ⅳ,84.62% for intestinal cancer,90% for esophaeal carcinoma.Conclusion There is a significant correlation between telomerase activity and pathologic grade of the tumors.
, http://www.100md.com Key words：Neoplasm; Telomere; Telomerase▲
最近研究表明染色体的端粒丢失和端粒酶的激活与肿瘤的进程有密切关系。自1994年Kim[1]借助PCR技术建立了敏感的端粒酶检测方法(telomerase repeat amplification protocol,TRAP),已检测了大量细胞系、肿瘤和体细胞，结果显示：正常体细胞中端粒酶活性受到限制，但在癌细胞和永生化细胞系中端粒酶被再激活。为了进一步探讨端粒酶在脑肿瘤、肠癌、食管癌中的表达，端粒酶活性高低与肿瘤恶性程度和临床病理特征的关系，我们应用最新建立的TRAP结合ELISA方法，对肿瘤组织端粒酶活性进行了半定量检测，同时，我们改进建立了TRAP银染方法。
材料和方法
1.标本
手术后取下的活体组织，迅速放入RPM1640培养基，送往实验室，液氮保存。细胞系sy5y(人神经母细胞瘤细胞系)
, 百拇医药
细胞系DBTRG-05MG(多型性胶质母细胞瘤)由首都医科大学神经科学研究所提供。
2.实验操作
2.1 端粒酶TRAP-ELISA(Boehringer Mann-heim Kit)
2.1.1 从组织中提取总蛋白：(1)将冷冻组织在恒冷切片机中-23℃切片，厚15μm，取50片放入灭菌离心管或取约30mg组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎；(2)加入200μl裂解液(Tris.HCl,MgCl2,EGTA,CHAPS等)，冰浴30min；(3)4℃16 000g离心20min；(4)小心吸取上清于一新管(确保无细胞碎片)，吸取约150μl。
2.1.2 TRAP反应：(1)对照：取20μl蛋白提取液65℃，10min使端粒酶失活，做阴性对照，阳性对照来自试剂盒；(2)PCR反应：取25μl PCR反应液，加入2μl(约2～15μg)总蛋白提取液，加水至50μl，所有均在冰上操作。PCR循环如下：a.25℃20min，端粒酶引物TS延伸；b.94℃预变性5min，94℃30s→50℃30s→72℃90s 30个循环，72℃延伸10min。
, 百拇医药
2.1.3 杂交和ELISA：(以下操作均在室温)(1)取20μl变性液，加入PCR扩增产物5μl，室温孵育10min。加入225μl杂交液充分混匀；(2)将杂交混合液按100μl/孔，加到已包被好的微量免疫板上，粘性泊纸覆盖，防止蒸发。37℃，300r/min孵育2min。弃杂交液，加250μl洗液，洗3次，每次洗1.5min；(3)弃洗液，加抗-地高辛-过氧化物酶工作液100μl/孔，300r/min振荡30min，洗5次；(4)加底物TMB100μl/孔，泊纸覆盖300r/min振荡，室温孵育20min；(5)加入终止液100μl.测450nm和690nm吸收值，测定须在加入终止液后30min内完成。
2.1.4 结果计算：(1)阳性对照：试剂盒内提供，如：A450-A690>1.5为阳性合格；(2)阴性对照；用加热或RNase消化提取液作阴性对照，如A450-A690<0.25阴性合格；(3)样本：A450-A690-A阴>0.2为阳性，否则为阴性；
, 百拇医药
2.2 PCR银染方法检测端粒酶活性
2.2.1 总蛋白提取(同前)
2.2.2 PCR扩增：(1)引物：合成的端粒酶RNA模板逆转录引物TS：5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’；CX 5’-CCCTTACCCTTAC-CCTTACCCTAA3’；(2)TRAP反应：a.参照Kim每50μlTRAP反应液含20 mmol/L Tris-HCL，1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，0.005% Tween-20，1mmol/L EGTA,50μmol/L dNTP,1μgT4 g32蛋白，0.1g/L牛血清白蛋白，0.1μgTS引物,2μ Taq酶，2μl细胞提取液，0.2～0.4μl α-32p dGTP/dCTA 10IU Ci/μl的方法改进;b.25℃20min，端粒酶引物TS延伸后，加入0.1μg CX引物；c.94℃预变性5min。PCR循环：94℃30s→50℃30s→72℃90s30个循环，72℃延伸10min。
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2.2.3 电泳：12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，加入10μl PCR产物，2μl 6×Loading buffer。150V恒压电泳4h，电泳缓冲液为1×TBE。
2.2.4 银染：(1)固定：电泳胶在10%冰乙酸300ml中振荡固定10min，洗1次；(2)银染：0.2%AgNO3 300ml加入0.5ml 37%甲醛，染色30min，洗1次；(3)显色：3% Na2CO3 300ml，加入37%甲醛0.5ml，20g/L硫代硫酸钠300μl，显色至清晰带条；(4)终止：10%冰乙酸300ml，终止显色；
结 果
用TRAP-ELISA端粒酶活性检测法分析了45例手术标本，2个细胞系，其结果见表1。用我们自己研究建立的非同位素TRAP-电泳-银染的方法，对15例标本进行了与TRAP-ELISA法对比检测，两种检测方法的结果一致。
, 百拇医药
表1 端粒酶活性检测结果
Table 1 Results of telomeras activity 标本来源
samples
例数
case No
端粒酶阳性
positive
阳性率
positive rate
脑瘤(brain tumors)
17
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12
70.59%
肠癌(intestina cancer)
13
11
84.62%
食管癌(esophagesl cancer)
10
9
90.00%
食管癌旁组织(Adj)*
5
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4
80.00%
细胞系(cell line)
2
2
100%
合计(total)
47
38
80.85%
Adj*：adjancent tissue of esophagesl cancer
表2 脑肿瘤端粒酶活性
, 百拇医药
Table 2 Telomerase activity in brain tumors 序号
No.
性别
sex
临床诊断
diagnosis
病理结果
pathology
端粒酶活性
(activity)
吸收值A*
A*
, http://www.100md.com
结果
result
1
男(M)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.048
-
2
男(M)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.087
, http://www.100md.com
-
3
男(M)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.620
+
4
女(F)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.800
+
, 百拇医药
5
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
0.046
-
6
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
0.053
-
7
, 百拇医药
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
0.046
-
8
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
1.230
++
9
男(M)
, http://www.100md.com
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
1.900
+++
10
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅱ)
1.600
+++
11
男(M)
胶质瘤(Gli)
, 百拇医药
星形细胞瘤Ⅲ(A.Ⅲ)
2.730
+++
12
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅲ(A.Ⅲ)
2.430
+++
13
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
, 百拇医药
1.230
+++
14
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
4.370
++
15
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
0.500
, http://www.100md.com
+
16
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
4.600
+++
17
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
3.326
+++
, 百拇医药
A*按公式计算吸光值(A=absorbance value)A450-690>0.2+,11.5+++.
A.Ⅱ：astrocytomaⅡ,F：female,Gli：glioma,M：male
1.脑瘤
检测17例脑肿瘤标本，其中包括4例脑膜瘤，13例脑胶质瘤，13例脑胶质瘤中10例阳性，按组织病理学肿瘤恶性程度分级，恶性程度低的星形细胞Ⅱ级标本中端粒酶表达阳性率(2/5)40%，恶性程度高的星形细胞瘤Ⅲ级或多形胶质母细胞瘤Ⅳ级，端粒酶阳性率(8/8)100%，x2检验P=0.45，两者有显著差异，见表2。
2.肠癌
分析13例临床诊断为直肠癌和结肠癌的术后活组织标本。11例端粒酶阳性，阳性率84.6%，(11/13)，2例端粒酶阴性标本为未转移、分化程度高的腺癌Ⅰ级。详细临床、病理指征与端粒酶检测结果见表3。
, 百拇医药
表3 肠癌端粒酶检测结果
Table 3 telomerase activity in intestina cancer 病例
No.
性别
sex
临床诊断
diagnosis
病理结果
pathology
瘤大小
size
端粒酶活性
, 百拇医药
(activity)
A*
A*
结果
result
1
女(F)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
4×3.5×1.5
1.998
+++
2
, 百拇医药
女(F)
结肠癌(CC)
结肠息肉(CP)
15×10×8
1.300
++
3
男(M)
直肠癌(RC)
0.900
+
4
男(M)
, 百拇医药
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
6×4×2
0.350
+
5
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
5×4×3
1.537
+++
6
, 百拇医药
男(M)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
13×11×4
0.222
+
7
男(M)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
3×3×1
0.145
-
, 百拇医药
8
女(F)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
0.936
+
9
女(F)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
3×2.7×1.7
1.187
++
, 百拇医药
10
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
6×5×1
1.118
++
11
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
0.094
-
, http://www.100md.com
12
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
6×3.5×1.5
0.820
+
13
男(M)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
1.032
++
, 百拇医药
A*：按公式计算吸光值(A=absorbance value)A>0.2+,11.5+++
Adn Ⅰ：adenocarcinoma Ⅰ,CC：colonic cancer,F：female,M：male,RC：rectal cancer
3.食管癌
分析10例临床诊断为食管癌及5例癌旁组织标本，10例食管癌中9例端粒酶阳性，阳性率90%，癌旁标本阳性率80%(4/5)，10例食管癌病理学分级9例鳞癌Ⅱ级，8例淋巴结转移检测，发现2例有贲门、隆突下、食管旁转移，为端粒酶阳性。
表4 食管癌及癌旁端粒酶活性
Table 4 Telomerase activity of esophagesl
, 百拇医药
cancer and adjancent tissue
病例
No.
性别
sex
临床诊断
diagnosis
病理分级
pathology
转移
metastasis
端粒酶检测
, 百拇医药
(activity)
A值
A
结果
results
1
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
转移(Y)
1.133
++
2
, http://www.100md.com
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
1.487
++
3
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
0.650
+
, 百拇医药
4
男(F)
食管癌(EC)
腺癌Ⅱ级(Ade Ⅱ)
无(N)
1.275
++
5
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
1.324
, 百拇医药
++
6
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
0.745
+
7
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
转移(Y)
, 百拇医药
0.249
+
8
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌(Squ)
无(N)
0.018
-
9
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
, http://www.100md.com
无(N)
+
10
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
+
11
男(F)
4号癌旁组织(Adj)
1.187
++
, 百拇医药
12
男(F)
5号癌旁组织(Adj)
0.575
+
13
男(F)
7号癌旁组织(Adj)
0.290
+
14
男(F)
9号癌旁组织(Adj)
, http://www.100md.com
-
15
男(F)
10号癌旁组织(Adj)
+
A*：按公式计算吸光值(A=absorbance value)A>0.2+，11.5+++
Adj：adjancent tissue of cancer,Adn Ⅰ：adenocarcinoma Ⅰ,EC：esophagesl care noma,F：female,N：no,Squ：squamous carcinoma,Y：yes.
讨 论
由多拷贝串联的6核苷酸5’TTAGGG3’重复序列和特异蛋白质(即非组蛋白)结合构成的染色体端粒，具有维持染色体末端稳定和保持遗传信息不丢失的功能[2]。按照WatsonDNA复制模型，DNA多聚酶不能从头合成DNA，只能从已有链的3’OH端继续延伸，通常需要RNA作引物引导合成，合成后引物被降解，新复制的DNA链5’端将有一个缺失无法填补。随细胞的分裂，DNA每复制1次，母链5’端就有一段DNA无法拷贝到子链中去，将造成DNA链愈来愈短，遗传信息丢失。原核生物如细菌，通过将自己DNA环化来解决这一问题。真核生物线性DNA分子端粒的存在有效的解决了这个问题，靠末端6核苷酸多拷贝序列和端粒酶的激活保证了遗传信息复制时的完全性。正常体细胞生命周期是有限的染色体端粒随细胞的分裂不断丢失而变短，皮肤生发层细胞和外周血细胞[3]端粒缩短率为15～40bp/年，体外培养的成纤维细胞、T细胞、胚肾细胞等每增加1倍端粒丢失50～200bp，当端粒长度减小到一定临界值(2～4kb)时，细胞即趋向衰老、死亡。端粒被认为[4]是细胞有丝分裂的“生物钟”，它计数着有丝分裂的次数。大量研究报道[5，6]，癌细胞和培养的永生化细胞有较短的端粒长度和较强的端粒酶活性，正常体细胞检测不到端粒酶活性，而生殖细胞，胚胎细胞有端粒酶表达，可见端粒酶催化合成端粒的重复片段，不断添加到端粒，对维持细胞端粒的动态平衡、抵抗衰老与死亡，保证细胞的分裂能力起重要作用。Cheng[7]Bette[8]等报道了脑肿瘤的端粒酶活性表达，肠道肿瘤相关端粒酶活性的检测等也有报道[1]。但端粒酶活性程度与临床及病理指征间的关系未见研究报道。我们首先应用TRAP-ELISA方法对几种肿瘤中端粒酶表达进行了半定量的分析，较精确的研究了端粒酶活性高低与肿瘤组织病理学分级、肿瘤淋巴结转移与否、肿瘤体积之间的关系。检测13例脑胶质瘤，10例端粒酶阳性，其中恶性程度低的星形细胞瘤Ⅱ标本中端粒酶阳性率(2/5)40%，而低分化的恶性星形细胞瘤Ⅲ和Ⅳ级(多形性胶质母细胞瘤)，端粒酶阳性率(8/8)100%，x2检验P=0.045两者有显著差异。良性肿瘤脑膜瘤的阳性率(2/4)50%，这说明随脑瘤恶性程度升高，其端粒酶活性表达率升高与Bette[8]结果相符。分析的13例肠癌标本中直肠癌5例，结肠癌8例，病理结果高分化腺癌Ⅰ级5例，阳性3例(60%)，低分化腺癌Ⅱ级6例，阳性6例(100%)，4例有淋巴结转移的皆腺癌Ⅱ级，且端粒酶阳性；4例无淋巴结转移的皆腺癌Ⅰ级，端粒酶阳性2例，阴性2例。同样表现出随肿瘤恶性程度升高，端粒酶阳性率升高的趋势。
, 百拇医药
TRAP-ELSA技术是德国保灵曼公司(Boeh-ring mannheim)推出，在Kim方法基础上将PCR与ELISA方法结合起来，使检测的灵敏度比以前有了很大提高，基本原理如下：
第一步：端粒延伸 端粒酶催化添加重复序列TTAGGG到生物素标记好的与模板RNA互补的逆转录引物P1-TS上。
第二步：PCR扩增 以上逆转录得到的DNA，在试剂内含有的PCR引物P2和P1-TS及Taqase存在下PCR扩增循环30个周期，产生大量长短不一的6个核苷酸多重复序列。
第三步：ELISA检测 扩增后的RCR产物，变性后与已被地高辛标记的端粒重复序列探针杂交，杂交后加到由链抗生物素包被的微量免疫板上，生物素标记的引物与抗生素蛋白特异结合，这样PCR产物5’端通过生物素标记引物被牢牢固定在免疫板上，3’端与地高辛标记6个核苷酸重复序列杂交。再加入交联有过氧化物酶的抗地高辛抗体和底物TMB，过氧化物酶催化底物反应产生蓝色沉淀，在酸性环境下蓝色变成棕黄色，测450nm和690nm其吸光值，可半定量确定端粒酶活性高低。
, 百拇医药
我们用该方法共检测了45例手术标本，2个细胞系，按照TRAP-ELISA检测原理；端粒酶活性强，催化合成6核苷酸重复序列多则杂交时需DIG标记寡核苷酸分子探针多，显色反应加入连接过氧化物酶抗DIG抗体多，产物沉淀颜色深，吸光值高。可见吸光值大小间接反应端粒酶活性高低。恶性程度不同的肿瘤组织，测得吸光值不同(表2～4)。
附图 端粒酶电泳结果1空白，2～4脑瘤端粒酶阳性，5～6肠癌端粒酶阳性
Fig.Results of telomerase:1 blank,2-4 brain tumors telomerase positive,5-6 intestinal cancer telomerase positive
目前，端粒酶活性检测常用Kim发明的TRAP法，在PCR过程中掺入同位素标记，c-[32]pdGTP/dCTP，PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过放射自显影显示相差6个核苷酸的DNA ladder条带，判断端粒酶活性。这方法敏感，已被国际上多家实验室采用，但由于应用同位素，造成检测周期长，污染环境，使方法的广泛应用受到限制，实验过程中我们对Kim的TRAP法加以改进，不需加入同位素，直接RT-PCR扩增，扩增产物在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(19∶1)上电泳然后硝酸银染色，可见到清晰的DNA梯状电泳条带(附图)。用自己改进的方法与保灵曼公司的TRAP-ELISA法对照做了15例标本，两方法结果一致。说明我们的方法同样敏感、准确，且比其他方法经济省时间，无需同位素和放射自显影，6～8h即可出结果，简便易推广。■
, 百拇医药
作者简介：郝玉宾(1966—)，女，医学硕士，副教授
参考文献：
[1]Kim NW.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266(5193)：2011-2015.
[2]Feng J.The RNA component of human telomerase[J].Science,1995,269(5228):1236-1241.
[3]Harley CB,Kim NW,Provvse KR,et al.Telomerase cells immortality and cancer[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1994,59()：307-315.
, http://www.100md.com
[4]Harley CB.Telomere loss:mitotic clock or genetic time bom[J]? Mutat Res,1996,256:271-282.
[5]Leber B,Bacchetti S.Telomeras and telomerase in normal and malignant haenatologic cell[J].Leuk Lymphoma,1996,24(1-2)：1-9.
[6]Nuawaz S.Tanyal H.Telomerase expression in human breast cancer with and without lymphnocle metastases[J].Am J Clin Pathol.1997,107(5)：542-547.
[7]Cheng AJ,Liao SK,Chow SE.Differential inhibition of telomerase activity during induction of hematopoietic melanoma,and glioma cells unculture[J].Bioch Bioph Res Comm.1997,237(2)：438-444.
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[8]Bette KK,Demasters.Differential telomerase expression in human primary intracranial tumors[J].Am J Clin Pathol,1997,107(5)：548-554.
[9]Wright WE,Shay JW,Piatyszek MA.Moelification of a telomeric repeat amplification protocal results in increased reliability,linearity and sensitivity[J].Nucleic Acid Res,1995,23(18):3794-3795.
收稿日期：1999-01-08
修回日期：1999-08-13, http://www.100md.com
单位：郝玉宾 田竟生 李淑婷(首都医科大学北京神经科学研究所，北京 100054)
关键词：肿瘤；端粒；端粒酶
解剖学报000111 摘 要：目的 了解端粒酶活性高低与肿瘤恶性程度关系。方法 用TRAP-ELISA和我们改进的TRAP银染方法，对肿瘤组织端粒酶活性进行半定量检测。结果 端粒酶阳性率分别为：胶质瘤星形Ⅱ级40%，Ⅲ和Ⅳ级100%，肠癌84.62%，食管癌90%。结论 端粒酶活性与肿瘤恶性程度密切相关，是诊断恶性肿瘤、判断愈后的良好指标。
分类号：Q55 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-43
THE STUDY OF TELOMERASE ACTIVITY IN TUMORS
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HAO Yu-bin
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China)
TIAN Jing-sheng
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China)
LI Shu-ting
(Beijing Institute for Neuroscience,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054,China)
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Abstract：Objective To investigate the correlation between telomerase activity and pathologic grade of the tumors.Methods We detected telomerase activity in tumors by TRAP-ELISA and TRAP-Ag+ stain methods.Results Telomerase positive rate is 40% for astrocytoma Ⅱ,100% for astrocytoma Ⅲ and Ⅳ,84.62% for intestinal cancer,90% for esophaeal carcinoma.Conclusion There is a significant correlation between telomerase activity and pathologic grade of the tumors.
, http://www.100md.com Key words：Neoplasm; Telomere; Telomerase▲
最近研究表明染色体的端粒丢失和端粒酶的激活与肿瘤的进程有密切关系。自1994年Kim[1]借助PCR技术建立了敏感的端粒酶检测方法(telomerase repeat amplification protocol,TRAP),已检测了大量细胞系、肿瘤和体细胞，结果显示：正常体细胞中端粒酶活性受到限制，但在癌细胞和永生化细胞系中端粒酶被再激活。为了进一步探讨端粒酶在脑肿瘤、肠癌、食管癌中的表达，端粒酶活性高低与肿瘤恶性程度和临床病理特征的关系，我们应用最新建立的TRAP结合ELISA方法，对肿瘤组织端粒酶活性进行了半定量检测，同时，我们改进建立了TRAP银染方法。
材料和方法
1.标本
手术后取下的活体组织，迅速放入RPM1640培养基，送往实验室，液氮保存。细胞系sy5y(人神经母细胞瘤细胞系)
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细胞系DBTRG-05MG(多型性胶质母细胞瘤)由首都医科大学神经科学研究所提供。
2.实验操作
2.1 端粒酶TRAP-ELISA(Boehringer Mann-heim Kit)
2.1.1 从组织中提取总蛋白：(1)将冷冻组织在恒冷切片机中-23℃切片，厚15μm，取50片放入灭菌离心管或取约30mg组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎；(2)加入200μl裂解液(Tris.HCl,MgCl2,EGTA,CHAPS等)，冰浴30min；(3)4℃16 000g离心20min；(4)小心吸取上清于一新管(确保无细胞碎片)，吸取约150μl。
2.1.2 TRAP反应：(1)对照：取20μl蛋白提取液65℃，10min使端粒酶失活，做阴性对照，阳性对照来自试剂盒；(2)PCR反应：取25μl PCR反应液，加入2μl(约2～15μg)总蛋白提取液，加水至50μl，所有均在冰上操作。PCR循环如下：a.25℃20min，端粒酶引物TS延伸；b.94℃预变性5min，94℃30s→50℃30s→72℃90s 30个循环，72℃延伸10min。
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2.1.3 杂交和ELISA：(以下操作均在室温)(1)取20μl变性液，加入PCR扩增产物5μl，室温孵育10min。加入225μl杂交液充分混匀；(2)将杂交混合液按100μl/孔，加到已包被好的微量免疫板上，粘性泊纸覆盖，防止蒸发。37℃，300r/min孵育2min。弃杂交液，加250μl洗液，洗3次，每次洗1.5min；(3)弃洗液，加抗-地高辛-过氧化物酶工作液100μl/孔，300r/min振荡30min，洗5次；(4)加底物TMB100μl/孔，泊纸覆盖300r/min振荡，室温孵育20min；(5)加入终止液100μl.测450nm和690nm吸收值，测定须在加入终止液后30min内完成。
2.1.4 结果计算：(1)阳性对照：试剂盒内提供，如：A450-A690>1.5为阳性合格；(2)阴性对照；用加热或RNase消化提取液作阴性对照，如A450-A690<0.25阴性合格；(3)样本：A450-A690-A阴>0.2为阳性，否则为阴性；
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2.2 PCR银染方法检测端粒酶活性
2.2.1 总蛋白提取(同前)
2.2.2 PCR扩增：(1)引物：合成的端粒酶RNA模板逆转录引物TS：5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’；CX 5’-CCCTTACCCTTAC-CCTTACCCTAA3’；(2)TRAP反应：a.参照Kim每50μlTRAP反应液含20 mmol/L Tris-HCL，1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，0.005% Tween-20，1mmol/L EGTA,50μmol/L dNTP,1μgT4 g32蛋白，0.1g/L牛血清白蛋白，0.1μgTS引物,2μ Taq酶，2μl细胞提取液，0.2～0.4μl α-32p dGTP/dCTA 10IU Ci/μl的方法改进;b.25℃20min，端粒酶引物TS延伸后，加入0.1μg CX引物；c.94℃预变性5min。PCR循环：94℃30s→50℃30s→72℃90s30个循环，72℃延伸10min。
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2.2.3 电泳：12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，加入10μl PCR产物，2μl 6×Loading buffer。150V恒压电泳4h，电泳缓冲液为1×TBE。
2.2.4 银染：(1)固定：电泳胶在10%冰乙酸300ml中振荡固定10min，洗1次；(2)银染：0.2%AgNO3 300ml加入0.5ml 37%甲醛，染色30min，洗1次；(3)显色：3% Na2CO3 300ml，加入37%甲醛0.5ml，20g/L硫代硫酸钠300μl，显色至清晰带条；(4)终止：10%冰乙酸300ml，终止显色；
结 果
用TRAP-ELISA端粒酶活性检测法分析了45例手术标本，2个细胞系，其结果见表1。用我们自己研究建立的非同位素TRAP-电泳-银染的方法，对15例标本进行了与TRAP-ELISA法对比检测，两种检测方法的结果一致。
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表1 端粒酶活性检测结果
Table 1 Results of telomeras activity 标本来源
samples
例数
case No
端粒酶阳性
positive
阳性率
positive rate
脑瘤(brain tumors)
17
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12
70.59%
肠癌(intestina cancer)
13
11
84.62%
食管癌(esophagesl cancer)
10
9
90.00%
食管癌旁组织(Adj)*
5
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4
80.00%
细胞系(cell line)
2
2
100%
合计(total)
47
38
80.85%
Adj*：adjancent tissue of esophagesl cancer
表2 脑肿瘤端粒酶活性
, 百拇医药
Table 2 Telomerase activity in brain tumors 序号
No.
性别
sex
临床诊断
diagnosis
病理结果
pathology
端粒酶活性
(activity)
吸收值A*
A*
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结果
result
1
男(M)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.048
-
2
男(M)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.087
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-
3
男(M)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.620
+
4
女(F)
脑膜瘤(Men)
脑膜瘤(Men)
0.800
+
, 百拇医药
5
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
0.046
-
6
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
0.053
-
7
, 百拇医药
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
0.046
-
8
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
1.230
++
9
男(M)
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胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅱ(A.Ⅱ)
1.900
+++
10
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅱ)
1.600
+++
11
男(M)
胶质瘤(Gli)
, 百拇医药
星形细胞瘤Ⅲ(A.Ⅲ)
2.730
+++
12
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅲ(A.Ⅲ)
2.430
+++
13
女(F)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
, 百拇医药
1.230
+++
14
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
4.370
++
15
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
0.500
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+
16
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
4.600
+++
17
男(M)
胶质瘤(Gli)
星形细胞瘤Ⅳ(A.Ⅳ)
3.326
+++
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A*按公式计算吸光值(A=absorbance value)A450-690>0.2+,1
A.Ⅱ：astrocytomaⅡ,F：female,Gli：glioma,M：male
1.脑瘤
检测17例脑肿瘤标本，其中包括4例脑膜瘤，13例脑胶质瘤，13例脑胶质瘤中10例阳性，按组织病理学肿瘤恶性程度分级，恶性程度低的星形细胞Ⅱ级标本中端粒酶表达阳性率(2/5)40%，恶性程度高的星形细胞瘤Ⅲ级或多形胶质母细胞瘤Ⅳ级，端粒酶阳性率(8/8)100%，x2检验P=0.45，两者有显著差异，见表2。
2.肠癌
分析13例临床诊断为直肠癌和结肠癌的术后活组织标本。11例端粒酶阳性，阳性率84.6%，(11/13)，2例端粒酶阴性标本为未转移、分化程度高的腺癌Ⅰ级。详细临床、病理指征与端粒酶检测结果见表3。
, 百拇医药
表3 肠癌端粒酶检测结果
Table 3 telomerase activity in intestina cancer 病例
No.
性别
sex
临床诊断
diagnosis
病理结果
pathology
瘤大小
size
端粒酶活性
, 百拇医药
(activity)
A*
A*
结果
result
1
女(F)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
4×3.5×1.5
1.998
+++
2
, 百拇医药
女(F)
结肠癌(CC)
结肠息肉(CP)
15×10×8
1.300
++
3
男(M)
直肠癌(RC)
0.900
+
4
男(M)
, 百拇医药
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
6×4×2
0.350
+
5
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
5×4×3
1.537
+++
6
, 百拇医药
男(M)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
13×11×4
0.222
+
7
男(M)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
3×3×1
0.145
-
, 百拇医药
8
女(F)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
0.936
+
9
女(F)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
3×2.7×1.7
1.187
++
, 百拇医药
10
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
6×5×1
1.118
++
11
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅰ(Ade Ⅰ)
0.094
-
, http://www.100md.com
12
女(F)
结肠癌(CC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
6×3.5×1.5
0.820
+
13
男(M)
直肠癌(RC)
腺癌Ⅱ(Ade Ⅱ)
1.032
++
, 百拇医药
A*：按公式计算吸光值(A=absorbance value)A>0.2+,1
Adn Ⅰ：adenocarcinoma Ⅰ,CC：colonic cancer,F：female,M：male,RC：rectal cancer
3.食管癌
分析10例临床诊断为食管癌及5例癌旁组织标本，10例食管癌中9例端粒酶阳性，阳性率90%，癌旁标本阳性率80%(4/5)，10例食管癌病理学分级9例鳞癌Ⅱ级，8例淋巴结转移检测，发现2例有贲门、隆突下、食管旁转移，为端粒酶阳性。
表4 食管癌及癌旁端粒酶活性
Table 4 Telomerase activity of esophagesl
, 百拇医药
cancer and adjancent tissue
病例
No.
性别
sex
临床诊断
diagnosis
病理分级
pathology
转移
metastasis
端粒酶检测
, 百拇医药
(activity)
A值
A
结果
results
1
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
转移(Y)
1.133
++
2
, http://www.100md.com
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
1.487
++
3
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
0.650
+
, 百拇医药
4
男(F)
食管癌(EC)
腺癌Ⅱ级(Ade Ⅱ)
无(N)
1.275
++
5
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
1.324
, 百拇医药
++
6
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
0.745
+
7
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
转移(Y)
, 百拇医药
0.249
+
8
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌(Squ)
无(N)
0.018
-
9
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
, http://www.100md.com
无(N)
+
10
男(F)
食管癌(EC)
鳞癌Ⅱ级(Squ Ⅱ)
无(N)
+
11
男(F)
4号癌旁组织(Adj)
1.187
++
, 百拇医药
12
男(F)
5号癌旁组织(Adj)
0.575
+
13
男(F)
7号癌旁组织(Adj)
0.290
+
14
男(F)
9号癌旁组织(Adj)
, http://www.100md.com
-
15
男(F)
10号癌旁组织(Adj)
+
A*：按公式计算吸光值(A=absorbance value)A>0.2+，1
Adj：adjancent tissue of cancer,Adn Ⅰ：adenocarcinoma Ⅰ,EC：esophagesl care noma,F：female,N：no,Squ：squamous carcinoma,Y：yes.
讨 论
由多拷贝串联的6核苷酸5’TTAGGG3’重复序列和特异蛋白质(即非组蛋白)结合构成的染色体端粒，具有维持染色体末端稳定和保持遗传信息不丢失的功能[2]。按照WatsonDNA复制模型，DNA多聚酶不能从头合成DNA，只能从已有链的3’OH端继续延伸，通常需要RNA作引物引导合成，合成后引物被降解，新复制的DNA链5’端将有一个缺失无法填补。随细胞的分裂，DNA每复制1次，母链5’端就有一段DNA无法拷贝到子链中去，将造成DNA链愈来愈短，遗传信息丢失。原核生物如细菌，通过将自己DNA环化来解决这一问题。真核生物线性DNA分子端粒的存在有效的解决了这个问题，靠末端6核苷酸多拷贝序列和端粒酶的激活保证了遗传信息复制时的完全性。正常体细胞生命周期是有限的染色体端粒随细胞的分裂不断丢失而变短，皮肤生发层细胞和外周血细胞[3]端粒缩短率为15～40bp/年，体外培养的成纤维细胞、T细胞、胚肾细胞等每增加1倍端粒丢失50～200bp，当端粒长度减小到一定临界值(2～4kb)时，细胞即趋向衰老、死亡。端粒被认为[4]是细胞有丝分裂的“生物钟”，它计数着有丝分裂的次数。大量研究报道[5，6]，癌细胞和培养的永生化细胞有较短的端粒长度和较强的端粒酶活性，正常体细胞检测不到端粒酶活性，而生殖细胞，胚胎细胞有端粒酶表达，可见端粒酶催化合成端粒的重复片段，不断添加到端粒，对维持细胞端粒的动态平衡、抵抗衰老与死亡，保证细胞的分裂能力起重要作用。Cheng[7]Bette[8]等报道了脑肿瘤的端粒酶活性表达，肠道肿瘤相关端粒酶活性的检测等也有报道[1]。但端粒酶活性程度与临床及病理指征间的关系未见研究报道。我们首先应用TRAP-ELISA方法对几种肿瘤中端粒酶表达进行了半定量的分析，较精确的研究了端粒酶活性高低与肿瘤组织病理学分级、肿瘤淋巴结转移与否、肿瘤体积之间的关系。检测13例脑胶质瘤，10例端粒酶阳性，其中恶性程度低的星形细胞瘤Ⅱ标本中端粒酶阳性率(2/5)40%，而低分化的恶性星形细胞瘤Ⅲ和Ⅳ级(多形性胶质母细胞瘤)，端粒酶阳性率(8/8)100%，x2检验P=0.045两者有显著差异。良性肿瘤脑膜瘤的阳性率(2/4)50%，这说明随脑瘤恶性程度升高，其端粒酶活性表达率升高与Bette[8]结果相符。分析的13例肠癌标本中直肠癌5例，结肠癌8例，病理结果高分化腺癌Ⅰ级5例，阳性3例(60%)，低分化腺癌Ⅱ级6例，阳性6例(100%)，4例有淋巴结转移的皆腺癌Ⅱ级，且端粒酶阳性；4例无淋巴结转移的皆腺癌Ⅰ级，端粒酶阳性2例，阴性2例。同样表现出随肿瘤恶性程度升高，端粒酶阳性率升高的趋势。
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TRAP-ELSA技术是德国保灵曼公司(Boeh-ring mannheim)推出，在Kim方法基础上将PCR与ELISA方法结合起来，使检测的灵敏度比以前有了很大提高，基本原理如下：
第一步：端粒延伸 端粒酶催化添加重复序列TTAGGG到生物素标记好的与模板RNA互补的逆转录引物P1-TS上。
第二步：PCR扩增 以上逆转录得到的DNA，在试剂内含有的PCR引物P2和P1-TS及Taqase存在下PCR扩增循环30个周期，产生大量长短不一的6个核苷酸多重复序列。
第三步：ELISA检测 扩增后的RCR产物，变性后与已被地高辛标记的端粒重复序列探针杂交，杂交后加到由链抗生物素包被的微量免疫板上，生物素标记的引物与抗生素蛋白特异结合，这样PCR产物5’端通过生物素标记引物被牢牢固定在免疫板上，3’端与地高辛标记6个核苷酸重复序列杂交。再加入交联有过氧化物酶的抗地高辛抗体和底物TMB，过氧化物酶催化底物反应产生蓝色沉淀，在酸性环境下蓝色变成棕黄色，测450nm和690nm其吸光值，可半定量确定端粒酶活性高低。
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我们用该方法共检测了45例手术标本，2个细胞系，按照TRAP-ELISA检测原理；端粒酶活性强，催化合成6核苷酸重复序列多则杂交时需DIG标记寡核苷酸分子探针多，显色反应加入连接过氧化物酶抗DIG抗体多，产物沉淀颜色深，吸光值高。可见吸光值大小间接反应端粒酶活性高低。恶性程度不同的肿瘤组织，测得吸光值不同(表2～4)。
附图 端粒酶电泳结果1空白，2～4脑瘤端粒酶阳性，5～6肠癌端粒酶阳性
Fig.Results of telomerase:1 blank,2-4 brain tumors telomerase positive,5-6 intestinal cancer telomerase positive
目前，端粒酶活性检测常用Kim发明的TRAP法，在PCR过程中掺入同位素标记，c-[32]pdGTP/dCTP，PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过放射自显影显示相差6个核苷酸的DNA ladder条带，判断端粒酶活性。这方法敏感，已被国际上多家实验室采用，但由于应用同位素，造成检测周期长，污染环境，使方法的广泛应用受到限制，实验过程中我们对Kim的TRAP法加以改进，不需加入同位素，直接RT-PCR扩增，扩增产物在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(19∶1)上电泳然后硝酸银染色，可见到清晰的DNA梯状电泳条带(附图)。用自己改进的方法与保灵曼公司的TRAP-ELISA法对照做了15例标本，两方法结果一致。说明我们的方法同样敏感、准确，且比其他方法经济省时间，无需同位素和放射自显影，6～8h即可出结果，简便易推广。■
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作者简介：郝玉宾(1966—)，女，医学硕士，副教授
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[3]Harley CB,Kim NW,Provvse KR,et al.Telomerase cells immortality and cancer[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1994,59()：307-315.
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收稿日期：1999-01-08
修回日期：1999-08-13, http://www.100md.com