肾上腺素对培养的大鼠表皮细胞增殖的影响
作者：霍正浩 樊景禹
单位：霍正浩(宁夏医学院生物学教研室，银川 750004)；樊景禹(北京医科大学生物物理学系，北京 100083)
关键词：表皮细胞；增殖；肾上腺素；核仁组织者区银染法(AgNOR)
解剖学报000110 摘 要：目的 研究大鼠表皮细胞的增殖活性是否随肾上腺素浓度而变化。 方法 利用核仁组织者区银染法(AgNOR)配合图像分析观察了肾上腺素浓度在10-10mol/L～10-6mol/L范围内培养的大鼠表皮细胞增殖活性的变化。 结果 在上述浓度范围内，肾上腺素可明显抑制培养大鼠表皮细胞的增殖活性；分析了单位面积细胞核上染色颗粒的面积(AA)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(NA)，与对照相比，P<0.01。参数AA在肾上腺素浓度为10-8mol/L处为最低值。 结论 肾上腺素在10-10mol/L～10-6mol/L范围内可明显抑制培养大鼠表皮细胞的增殖活性，以10-8mol/L的肾上腺素抑制作用最强。
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分类号：Q253 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-39
EFFECT OF EPINEPHRINE ON PROLIFERATION OF
CULTURED RAT EPIDERMAL CELLS
HUO Zheng-hao
(Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083,China)
FAN Jing-yu
(Department of Biology, Ningxia Medical Colloge,Yinchuan 750004,China)
, 百拇医药
Abstract：Objective To study if variation of epinephrine concentration will result in the alteration in proliferation activity of rat epidermal cells. Methods Using silver-staining technique for nucleolar organizer regions(AgNOR) in conjunction with image to analyse the alteration in proliferation activity of cultured rat epidermal cells in the presence of epinephrine at the concentration between 10-10 mol/L-10-6mol/L Results At the concentrations examined epinephrine inhibited the proliferation activity of rat epidermal cells significantly. Two parameters were estimated, i.e., the area of staining granules per unit area of nucleus profile(AA) and the number of staining granules per unit area of nucleus profile(NA), and both resulted in the same consequence:in comparison with control, P<0.01, as indicated by t-test. The lowest value of AA was observed at 10-8mol/L of epinephrine concentration. Conclusion The epinephrine at the concentration of 10-10mol/L to 10-6mol/L can inhibit the proliferation activity of cultured rat epidermal cells significantly, and the epinephrine of 10-8 mol/L exhibited the highest inhibition effect.
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Key words：Epidermal cell; Proliferation; Epinephrine; AgNOR▲
我们曾报道，大鼠表皮细胞的分裂活性随体表部位而异，并设想皮肤局部肾上腺素浓度不同可能是造成这种差异的一个重要原因[1]。为进一步检验这一设想，我们用核仁组织者区银染法(silver-staining technique for nucleolar organizer regions, AgNOR)研究了肾上腺素在不同浓度下对培养大鼠表皮细胞分裂活性的影响。
材料和方法
1. 材料
1.1 动物：Wistar大鼠，出生24h以内，雌、雄不拘，北京医科大学实验动物部提供。
1.2 试剂：DMEM与新生牛血清(Gibco公司)；肾上腺素(酒石酸氢盐)与明胶(Sigma公司)；胰蛋白酶(华美公司)；其余试剂均为分析纯。鼠尾胶原自制[2]。
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2. 方法
2.1 表皮细胞的原代培养与纯化：取经消毒后的乳鼠皮肤，剪至1mm3大小，均匀贴附于培养瓶底面，翻转培养瓶，加入适量DMEM培养液(内含25%新生牛血清，100IU/ml青霉素和100mg/L链霉素，pH6.8～7.0)，在37℃，5%CO2培养箱内静置3～4h后，轻轻翻转平放，继续培养。当表皮细胞集落之间的成纤维细胞尚未汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化，并在显微镜下观察，至成纤维细胞变圆后，加入含血清的DEME终止消化，轻轻吹打，移除消化液，用PBS洗2次，加入含25%新生牛血清的DMEM继续培养。5～6d后，仍混有部分成纤维细胞的表皮细胞生长成片，再用0.25%胰蛋白酶消化，消化后的细胞悬液接种于未铺胶原的培养瓶中，静止30min，在光镜下观察，见部分细胞贴壁稍加振荡也不浮起时，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起移至铺有鼠尾胶原的培养瓶中继续培养。此步骤可重复，直至将成纤维细胞除净为止。
2.2 生长曲线：纯化后的表皮细胞以5×105/ml，2×105/ml和0.5×105/ml的浓度分别接种于24孔板中，从次日起每天同一时间消化其中4孔，计数细胞，连续7d，作出生长曲线。
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2.3 分裂指数：取对数生长期细胞消化，以2×105/ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中。每日同一时间取3孔中的细胞，连续7d。细胞经10%中性福尔马林固定，常规HE染色，在细胞密度近似区，观察5 000个细胞，记录其中处于中期分裂象的细胞数。
2.4 肾上腺素对表皮细胞增殖活性的影响：取对数生长期细胞，以2×105ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中培养。24h后换为含1%新生牛血清的DMEM，使细胞饥饿24h。之后，移除孔中培养液，加入含不同浓度肾上腺素和20%新生牛血清的DMEM，继续培养。处理的肾上腺素浓度分别为10-10mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L，10-7mol/L和10-6mol/L。肾上腺素各浓度组的细胞均为3孔。对照组不加肾上腺素。培养12h后，取出盖玻片，用95%乙醇固定30min，并进行AgNOR染色。
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2.5 AgNOR染色方法及结果分析：经95%乙醇固定的细胞用双蒸水清洗3～4次，每次10min；进入酸化液，孵育5min；除去酸化液，用双蒸水洗3次，方法同上。在暗室内进入AgNOR染液，于20℃孵育30min。用水充分清洗后，再经显影，定影，按常规进行脱水，透明和封片。某些样品不经定影。酸化液内含冰醋酸和无水乙醇，其体积比为1∶3。AgNOR染液由a,b两种原液配成。a液：0.2g明胶溶于5 ml 2%甲酸中；b液：50%硝酸银水溶液。使用前将a与b液按1∶2的体积比混和，过滤。染色后的细胞在图像分析仪(Leica Q550-IW)上进行分析，分析的参数为单位面积细胞核上染色颗粒的面积(AA)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(NA)。每一肾上腺素浓度分析的细胞来自3个不同的孔，每孔观测最先进入视野的细胞30～40个。观测时，显微镜放大倍数为1 000，监视器上的最终放大为4 000倍。
2.6 扫描电镜方法：生长于盖玻片上的细胞用2%戊二醛在4℃固定2h后，按常规脱水，临界点干燥，镀膜。在Hitachi S-450电镜下观察。
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结 果
1. 表皮细胞的原代培养及纯化与传代
组织培养2d后，有零星成纤维细胞长出，4～5d时，可见组织块周围长出1圈上皮样细胞。细胞呈多边形，鹅卵石路面状排列。其外周为成纤维细胞，呈长梭形，束状或火焰状排列(图1)。为获得纯化的表皮细胞，在组织块间的成纤维细胞尚未长满时，用0.25%胰蛋白酶消化，并按2.1节中所述方法进行纯化。图2是胰蛋白酶消化后成纤维细胞从与表皮细胞集落交界处脱落的情形；图3和图4分别是纯化后的表皮细胞的光镜和电镜照片。可见表皮细胞呈多边形，光镜下细胞核大而圆，常见数个核仁；在扫描电镜下，细胞表面有丰富的突起，边缘伸出短的伪足。纯化的表皮细胞传代后聚集成小岛状集落，然后从其边缘逐渐扩展成片。传至第6～7代后，细胞变大，胞质内颗粒增多，生长缓慢，终至死亡。
图1大鼠表皮细胞的原代培养。虚线右下方为为表皮细胞(↑)左上方为成纤维细胞(↑).标尺示100μm
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Fig.1Primary culture of rat epidermal cells.Right bottom:epidermal cells(↑);Top left:fibroblasts(↑).Bar=100μm
图2经胰蛋白酶消化后的原代培养的大鼠表皮细胞.虚线右下方为表皮细胞(↑),左上方的成纤维细胞已被消化掉.标尺示100μm
Fig.2Primary culture of rat epiderma cells after digestion by trypsin.Right bottom:epidermal cells(↑).The fibroblastsb originally located on the top left were eliminated by trypsin digestion.Bar=100μm
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图3纯化后大鼠表皮细胞(↑)的光镜照片.标尺示100μm
Fig.3Light micrograph of purified rat epidermal cells(↑).Bar=100μm
图4纯化后大鼠表皮细胞的扫描电镜照片.标尺示5μm
Fig.4Scanning elecrron micrograph of purified rat epidrmal cells.Bar=5μm
2. 生长曲线和分裂指数
细胞以5×105细胞/ml接种后，因密度过大生长迟缓；以0.5×105细胞/ml接种时，细胞密度太小而增殖缓慢；当细胞数为2×105/ml时，可见细胞有明显的对数生长期(图5)。
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以2×105细胞/ml接种，于对数生长期取细胞，并以同样浓度(2×105细胞/ml)接种于24孔板，测定分裂指数。可见细胞于接种后增殖旺盛，分裂指数在第4d达到高峰，以后随细胞密度增加而迅速下降(图6)。
图5 培养的大鼠表皮细胞生长曲线。横坐标，培养时间；单位，天(d)。纵坐标，细胞浓度；单位，105细胞/ml。接种浓度：○.0.5×105/ml；□.2×105/ml；△.5×105/ml
Fig.5 Growth curve of cultured rat epidermal cells. Abscissa, culture time; unit, days. Ordinate, cell concentration; unit, 105 cells/ml. Seeding concentration:○，0.5×105/ml;□，2×105/ml；△，5×105/ml
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图6 在接种浓度为2×105/ml时培养大鼠表皮细胞的分裂指数。横坐标，培养时间；单位，天(d)。纵坐标，有丝分裂细胞比例(‰)。
Fig.6 Index of mitosis of cultured rat epidermal cells in the seeding concentration of 2×105/ml. Abscissa, culture time; unit, days. Ordinate, the fraction of cells in mitosis(‰).
3. 肾上腺素对表皮细胞AgNOR的影响
表皮细胞经硝酸银染色后，在显微镜下，其核仁组织者区显示为大小和形状不一的黑色颗粒(图7)。每个细胞核中AgNOR颗粒数从1个到10几个不等。在测定AA和NA两个参数时，需要以细胞核的投影面积作为参照系。预实验结果表明，只有在样品AgNOR染色后不经定影才能清楚地确认细胞核的轮廓。因此本实验用于下面AgNOR定量分析的样品均未定影。
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图7大鼠表皮细胞AgNOR,细胞核(↑),可见核内黑色的AgNOR颗粒.标尺示10μm
Fig.7AgNOR of rat epidermal cells.Arrow indicates nucleus,in which black granules of AgNOR could be observed.Bar=10μm
图8和图9分别显示经不同浓度肾上腺素作用后大鼠表皮细胞AgNOR的AA和NA。可见，与未加肾上腺素的对照组相比，在所观察的浓度范围内，肾上腺素均可使表皮细胞的AN和NA下降，t检验证实，P值均小于0.01，因而差异非常显著。从图8还可看到，在肾上腺素浓度为10-8mol/L时，对表皮细胞的AgNOR的抑制作用似乎最强，在图上形成一个低谷，随着肾上腺素浓度的增加或降低，对AgNOR的抑制作用都有减弱的趋势，虽然在统计学上只有10-8mol/L和10-10mol/L两浓度间的AA值存在显著差异。
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图8 肾上腺素对大鼠培养表皮细胞AgNOR面密度的影响。横坐标，肾上腺素浓度，数字分别代表10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L和10-10mol/L，c,对照。纵坐标，面密度(AgNOR面积在核面积中的百分比)。
Fig.8 The effect of epinephrine on the area density of AgNOR in cultured rat epidermal cells. Abscissa, concentration of epinephrine, the figures represent 10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L and 10-10mol/L，respectively; c,control. Ordinate, area density(percentage of AgNOR area in nucleus area).
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图9 肾上腺素对大鼠培养表皮细胞AgNOR颗粒数的影响。横坐标，肾上腺素浓度，数字分别代表10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L和10-10mol/L；c.对照。纵坐标，单位面积细胞核中的AgNOR颗粒数。
Fig.9 The effect of epinephrine on the granule number of AgNOR in cultured rat epidermal cells. Abscissa, concentration of epinephrine, the figures represent 10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L and 10-10mol/L，respectively; c, control. Ordinate, the granule number of AgNOR per unit area of nucleus.
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讨 论
表皮细胞培养方法较多，主要有组织块培养法，细胞悬液培养法和3T3饲养层培养法[3]。其中3T3饲养层培养法成功率高，但方法繁琐，而且3T3细胞对表皮细胞生长的影响尚不清楚。目前采用较多的是细胞悬液法，这种方法对培养条件要求较高，而成功率较低。组织块培养法最简单，但由于皮肤含有真皮成分，故成纤维细胞的污染常使研究者困扰。本实验采用组织块培养，并通过胰蛋白酶消化和反复差异贴壁相结合的方法，有效的除去了成纤维细胞。这一作法的依据是：(1)成纤维细胞和表皮细胞对胰蛋白酶的耐受性不同。在消化条件相同时，成纤维细胞常先脱壁，这种区别在原代培养时更明显[3]。只要掌握好消化时间，利用这一方法可在原代培养时除去大部分成纤维细胞；(2)成纤维细胞和表皮细胞贴壁的动力学过程不同。成纤维细胞可在10～30min内完成贴壁，而在同样时间内表皮细胞则不能贴壁或贴壁不牢[4]。这种差别在未铺胶原的培养瓶中尤为突出。因此，可用反复差异贴壁的方法将污染的成纤维细胞进一步除去。
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我们利用以上方法分离和纯化的大鼠表皮细胞，研究了肾上腺素对细胞增殖活性的影响。肾上腺素可抑制表皮细胞的有丝分裂，在体小鼠皮肤上已早有报道[5]，在培养的大鼠皮肤和人表皮细胞上也进行过较系统的观察[6，7]。这些研究中，作为判断细胞增殖活性的指标，或者是用形态学上处于M期的细胞的百分比，或者是通过3H-TdR参入实验测定S期细胞的比例。我们在研究这一问题时，选择了AgNOR法作为衡量表皮细胞增殖活性的指标。NOR蛋白是一组与核糖体RNA转录、转录后修饰、以及核糖体组装相关的蛋白质，定位于核仁上。已经证明，NOR蛋白含量与细胞增殖活性成正相关。因而，将AgNOR与图像分析相结合对NOR蛋白进行定量分析的方法已广泛用于肿瘤的诊断[8]。我们用AA和NA作为定量的参数研究了肾上腺素对培养的大鼠表皮细胞NOR蛋白含量的影响，发现，肾上腺素浓度在10-10～10-6mol/L的范围内，均可使NOR蛋白含量明显下降，提示，此时表皮细胞增殖活性受到明显抑制。曾有报道，在培养的成年大鼠皮肤样品上，能抑制表皮细胞增殖的肾上腺素浓度是10-6mol/L[7]。这一浓度是本实验观察到的能抑制细胞增殖的肾上腺素浓度的上限。观察对象和观察指标的不同都可能造成上述结果的差异，其具体原因有待进一步研究。
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本研究用AA和NA这两个参数得到了大体相同的结果，但也存在区别。这主要表现在10-9～10-7mol/L的浓度范围内两参数的变化趋势上。如方法中所述，AA所测量的是单位面积细胞核上染色颗粒的面积，根据体视学原理，两种结构在二维图像上的面积百分比(即AA)等于其在空间的体积百分比[9]，因此，AA实际上所代表的是细胞核单位体积中所含的NOR蛋白的体积，因而与NOR蛋白含量的变化成正相关；而NA则并不总是与NOR蛋白含量的变化成正相关。因为，如果NOR蛋白含量减少但变得分散，则NA不仅不会减少反而可能增加。所以，用AA来表示NOR蛋白含量并进而作为细胞增殖活性的量度似乎更为合理。基于这一分析，本实验结果进一步提示，在所观察的范围内，不同的肾上腺素浓度对培养的大鼠表皮细胞增殖的抑制作用也不相同，而以10-8mol/L的作用最强。
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常昕同志参与了本文实验AgNOR法的建立，实验中的图像分析工作得到本校医药卫生分析中心细胞分析室帮助，谨致谢意。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770895)，CMB基金资助
作者简介：霍正浩(1958—)，男，山西孝义人，医学学士，副教授
参考文献：
[1]郑静怡,樊景禹,董志忠.大鼠表皮角化细胞分裂活性的拓扑学特征[J].解剖学报,1998,29(4):414～417.
[2]鄂征,陈泉光,徐新来,等.组织培养技术[M].北京:人民卫生出版社,1988:63～64.
[3]王文正,王韦,刘俊龙,等.表皮细胞培养与移植研究Ⅰ、人角化细胞在三种培养法中生长的观察[J].第二军医大学报,1985,6(6):339～341.
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[4]欧阳镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司,1996:77～79.
[5]Vincent NH.Antimitotic effect of catecholamines in mouse pinnal epidermis[J].Fed Proc,1970,29(2):742.
[6]Flaxman BA, Harper RA. In vitro analysis of the control of keratinocyte proliferation in human epidermis by physiologic and pharmacologic agents[J].Invest Dermatol,1975,65(1):52-59.
[7]Voorhees JJ,Kelsey W,Stawiski M,et al.Increased cyclic GMP and decreased cyclic AMP levels in the rapidly proliferating epithelium of psoriasis[M].In Schultz J,Grantzner HG(eds).Role of Cyclic Nucleotides in Carcinogenesis,Vol 6.New York:Academic Press,1973:325-373.
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[8]Hofstädter F, Knüchel R,Rüschoff J.Cell proliferation assessment in oncology[J]. Virchows Arch,A Pathological Anatomy and Histopathology,1995,427(1):323-341.
[9]Howard V.Stereological techniques in biological electron microscopy[M].In Hawkes PW,Valdre U(eds).Biophysical Electron Microscopy,Basic Concepts and Modern Techniques.New York:Academic Press,1990:483-508.
收稿日期：1999-12-11
修回日期：1999-04-22, 百拇医药
单位：霍正浩(宁夏医学院生物学教研室，银川 750004)；樊景禹(北京医科大学生物物理学系，北京 100083)
关键词：表皮细胞；增殖；肾上腺素；核仁组织者区银染法(AgNOR)
解剖学报000110 摘 要：目的 研究大鼠表皮细胞的增殖活性是否随肾上腺素浓度而变化。 方法 利用核仁组织者区银染法(AgNOR)配合图像分析观察了肾上腺素浓度在10-10mol/L～10-6mol/L范围内培养的大鼠表皮细胞增殖活性的变化。 结果 在上述浓度范围内，肾上腺素可明显抑制培养大鼠表皮细胞的增殖活性；分析了单位面积细胞核上染色颗粒的面积(AA)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(NA)，与对照相比，P<0.01。参数AA在肾上腺素浓度为10-8mol/L处为最低值。 结论 肾上腺素在10-10mol/L～10-6mol/L范围内可明显抑制培养大鼠表皮细胞的增殖活性，以10-8mol/L的肾上腺素抑制作用最强。
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分类号：Q253 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-39
EFFECT OF EPINEPHRINE ON PROLIFERATION OF
CULTURED RAT EPIDERMAL CELLS
HUO Zheng-hao
(Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing 100083,China)
FAN Jing-yu
(Department of Biology, Ningxia Medical Colloge,Yinchuan 750004,China)
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Abstract：Objective To study if variation of epinephrine concentration will result in the alteration in proliferation activity of rat epidermal cells. Methods Using silver-staining technique for nucleolar organizer regions(AgNOR) in conjunction with image to analyse the alteration in proliferation activity of cultured rat epidermal cells in the presence of epinephrine at the concentration between 10-10 mol/L-10-6mol/L Results At the concentrations examined epinephrine inhibited the proliferation activity of rat epidermal cells significantly. Two parameters were estimated, i.e., the area of staining granules per unit area of nucleus profile(AA) and the number of staining granules per unit area of nucleus profile(NA), and both resulted in the same consequence:in comparison with control, P<0.01, as indicated by t-test. The lowest value of AA was observed at 10-8mol/L of epinephrine concentration. Conclusion The epinephrine at the concentration of 10-10mol/L to 10-6mol/L can inhibit the proliferation activity of cultured rat epidermal cells significantly, and the epinephrine of 10-8 mol/L exhibited the highest inhibition effect.
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Key words：Epidermal cell; Proliferation; Epinephrine; AgNOR▲
我们曾报道，大鼠表皮细胞的分裂活性随体表部位而异，并设想皮肤局部肾上腺素浓度不同可能是造成这种差异的一个重要原因[1]。为进一步检验这一设想，我们用核仁组织者区银染法(silver-staining technique for nucleolar organizer regions, AgNOR)研究了肾上腺素在不同浓度下对培养大鼠表皮细胞分裂活性的影响。
材料和方法
1. 材料
1.1 动物：Wistar大鼠，出生24h以内，雌、雄不拘，北京医科大学实验动物部提供。
1.2 试剂：DMEM与新生牛血清(Gibco公司)；肾上腺素(酒石酸氢盐)与明胶(Sigma公司)；胰蛋白酶(华美公司)；其余试剂均为分析纯。鼠尾胶原自制[2]。
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2. 方法
2.1 表皮细胞的原代培养与纯化：取经消毒后的乳鼠皮肤，剪至1mm3大小，均匀贴附于培养瓶底面，翻转培养瓶，加入适量DMEM培养液(内含25%新生牛血清，100IU/ml青霉素和100mg/L链霉素，pH6.8～7.0)，在37℃，5%CO2培养箱内静置3～4h后，轻轻翻转平放，继续培养。当表皮细胞集落之间的成纤维细胞尚未汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化，并在显微镜下观察，至成纤维细胞变圆后，加入含血清的DEME终止消化，轻轻吹打，移除消化液，用PBS洗2次，加入含25%新生牛血清的DMEM继续培养。5～6d后，仍混有部分成纤维细胞的表皮细胞生长成片，再用0.25%胰蛋白酶消化，消化后的细胞悬液接种于未铺胶原的培养瓶中，静止30min，在光镜下观察，见部分细胞贴壁稍加振荡也不浮起时，将培养液连同尚未贴壁的细胞一起移至铺有鼠尾胶原的培养瓶中继续培养。此步骤可重复，直至将成纤维细胞除净为止。
2.2 生长曲线：纯化后的表皮细胞以5×105/ml，2×105/ml和0.5×105/ml的浓度分别接种于24孔板中，从次日起每天同一时间消化其中4孔，计数细胞，连续7d，作出生长曲线。
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2.3 分裂指数：取对数生长期细胞消化，以2×105/ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中。每日同一时间取3孔中的细胞，连续7d。细胞经10%中性福尔马林固定，常规HE染色，在细胞密度近似区，观察5 000个细胞，记录其中处于中期分裂象的细胞数。
2.4 肾上腺素对表皮细胞增殖活性的影响：取对数生长期细胞，以2×105ml浓度接种于放有盖玻片的24孔板中培养。24h后换为含1%新生牛血清的DMEM，使细胞饥饿24h。之后，移除孔中培养液，加入含不同浓度肾上腺素和20%新生牛血清的DMEM，继续培养。处理的肾上腺素浓度分别为10-10mol/L，10-9mol/L，10-8mol/L，10-7mol/L和10-6mol/L。肾上腺素各浓度组的细胞均为3孔。对照组不加肾上腺素。培养12h后，取出盖玻片，用95%乙醇固定30min，并进行AgNOR染色。
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2.5 AgNOR染色方法及结果分析：经95%乙醇固定的细胞用双蒸水清洗3～4次，每次10min；进入酸化液，孵育5min；除去酸化液，用双蒸水洗3次，方法同上。在暗室内进入AgNOR染液，于20℃孵育30min。用水充分清洗后，再经显影，定影，按常规进行脱水，透明和封片。某些样品不经定影。酸化液内含冰醋酸和无水乙醇，其体积比为1∶3。AgNOR染液由a,b两种原液配成。a液：0.2g明胶溶于5 ml 2%甲酸中；b液：50%硝酸银水溶液。使用前将a与b液按1∶2的体积比混和，过滤。染色后的细胞在图像分析仪(Leica Q550-IW)上进行分析，分析的参数为单位面积细胞核上染色颗粒的面积(AA)和单位面积细胞核上染色颗粒的数目(NA)。每一肾上腺素浓度分析的细胞来自3个不同的孔，每孔观测最先进入视野的细胞30～40个。观测时，显微镜放大倍数为1 000，监视器上的最终放大为4 000倍。
2.6 扫描电镜方法：生长于盖玻片上的细胞用2%戊二醛在4℃固定2h后，按常规脱水，临界点干燥，镀膜。在Hitachi S-450电镜下观察。
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结 果
1. 表皮细胞的原代培养及纯化与传代
组织培养2d后，有零星成纤维细胞长出，4～5d时，可见组织块周围长出1圈上皮样细胞。细胞呈多边形，鹅卵石路面状排列。其外周为成纤维细胞，呈长梭形，束状或火焰状排列(图1)。为获得纯化的表皮细胞，在组织块间的成纤维细胞尚未长满时，用0.25%胰蛋白酶消化，并按2.1节中所述方法进行纯化。图2是胰蛋白酶消化后成纤维细胞从与表皮细胞集落交界处脱落的情形；图3和图4分别是纯化后的表皮细胞的光镜和电镜照片。可见表皮细胞呈多边形，光镜下细胞核大而圆，常见数个核仁；在扫描电镜下，细胞表面有丰富的突起，边缘伸出短的伪足。纯化的表皮细胞传代后聚集成小岛状集落，然后从其边缘逐渐扩展成片。传至第6～7代后，细胞变大，胞质内颗粒增多，生长缓慢，终至死亡。
图1大鼠表皮细胞的原代培养。虚线右下方为为表皮细胞(↑)左上方为成纤维细胞(↑).标尺示100μm
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Fig.1Primary culture of rat epidermal cells.Right bottom:epidermal cells(↑);Top left:fibroblasts(↑).Bar=100μm
图2经胰蛋白酶消化后的原代培养的大鼠表皮细胞.虚线右下方为表皮细胞(↑),左上方的成纤维细胞已被消化掉.标尺示100μm
Fig.2Primary culture of rat epiderma cells after digestion by trypsin.Right bottom:epidermal cells(↑).The fibroblastsb originally located on the top left were eliminated by trypsin digestion.Bar=100μm
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图3纯化后大鼠表皮细胞(↑)的光镜照片.标尺示100μm
Fig.3Light micrograph of purified rat epidermal cells(↑).Bar=100μm
图4纯化后大鼠表皮细胞的扫描电镜照片.标尺示5μm
Fig.4Scanning elecrron micrograph of purified rat epidrmal cells.Bar=5μm
2. 生长曲线和分裂指数
细胞以5×105细胞/ml接种后，因密度过大生长迟缓；以0.5×105细胞/ml接种时，细胞密度太小而增殖缓慢；当细胞数为2×105/ml时，可见细胞有明显的对数生长期(图5)。
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以2×105细胞/ml接种，于对数生长期取细胞，并以同样浓度(2×105细胞/ml)接种于24孔板，测定分裂指数。可见细胞于接种后增殖旺盛，分裂指数在第4d达到高峰，以后随细胞密度增加而迅速下降(图6)。
图5 培养的大鼠表皮细胞生长曲线。横坐标，培养时间；单位，天(d)。纵坐标，细胞浓度；单位，105细胞/ml。接种浓度：○.0.5×105/ml；□.2×105/ml；△.5×105/ml
Fig.5 Growth curve of cultured rat epidermal cells. Abscissa, culture time; unit, days. Ordinate, cell concentration; unit, 105 cells/ml. Seeding concentration:○，0.5×105/ml;□，2×105/ml；△，5×105/ml
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图6 在接种浓度为2×105/ml时培养大鼠表皮细胞的分裂指数。横坐标，培养时间；单位，天(d)。纵坐标，有丝分裂细胞比例(‰)。
Fig.6 Index of mitosis of cultured rat epidermal cells in the seeding concentration of 2×105/ml. Abscissa, culture time; unit, days. Ordinate, the fraction of cells in mitosis(‰).
3. 肾上腺素对表皮细胞AgNOR的影响
表皮细胞经硝酸银染色后，在显微镜下，其核仁组织者区显示为大小和形状不一的黑色颗粒(图7)。每个细胞核中AgNOR颗粒数从1个到10几个不等。在测定AA和NA两个参数时，需要以细胞核的投影面积作为参照系。预实验结果表明，只有在样品AgNOR染色后不经定影才能清楚地确认细胞核的轮廓。因此本实验用于下面AgNOR定量分析的样品均未定影。
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图7大鼠表皮细胞AgNOR,细胞核(↑),可见核内黑色的AgNOR颗粒.标尺示10μm
Fig.7AgNOR of rat epidermal cells.Arrow indicates nucleus,in which black granules of AgNOR could be observed.Bar=10μm
图8和图9分别显示经不同浓度肾上腺素作用后大鼠表皮细胞AgNOR的AA和NA。可见，与未加肾上腺素的对照组相比，在所观察的浓度范围内，肾上腺素均可使表皮细胞的AN和NA下降，t检验证实，P值均小于0.01，因而差异非常显著。从图8还可看到，在肾上腺素浓度为10-8mol/L时，对表皮细胞的AgNOR的抑制作用似乎最强，在图上形成一个低谷，随着肾上腺素浓度的增加或降低，对AgNOR的抑制作用都有减弱的趋势，虽然在统计学上只有10-8mol/L和10-10mol/L两浓度间的AA值存在显著差异。
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图8 肾上腺素对大鼠培养表皮细胞AgNOR面密度的影响。横坐标，肾上腺素浓度，数字分别代表10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L和10-10mol/L，c,对照。纵坐标，面密度(AgNOR面积在核面积中的百分比)。
Fig.8 The effect of epinephrine on the area density of AgNOR in cultured rat epidermal cells. Abscissa, concentration of epinephrine, the figures represent 10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L and 10-10mol/L，respectively; c,control. Ordinate, area density(percentage of AgNOR area in nucleus area).
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图9 肾上腺素对大鼠培养表皮细胞AgNOR颗粒数的影响。横坐标，肾上腺素浓度，数字分别代表10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L和10-10mol/L；c.对照。纵坐标，单位面积细胞核中的AgNOR颗粒数。
Fig.9 The effect of epinephrine on the granule number of AgNOR in cultured rat epidermal cells. Abscissa, concentration of epinephrine, the figures represent 10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L and 10-10mol/L，respectively; c, control. Ordinate, the granule number of AgNOR per unit area of nucleus.
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讨 论
表皮细胞培养方法较多，主要有组织块培养法，细胞悬液培养法和3T3饲养层培养法[3]。其中3T3饲养层培养法成功率高，但方法繁琐，而且3T3细胞对表皮细胞生长的影响尚不清楚。目前采用较多的是细胞悬液法，这种方法对培养条件要求较高，而成功率较低。组织块培养法最简单，但由于皮肤含有真皮成分，故成纤维细胞的污染常使研究者困扰。本实验采用组织块培养，并通过胰蛋白酶消化和反复差异贴壁相结合的方法，有效的除去了成纤维细胞。这一作法的依据是：(1)成纤维细胞和表皮细胞对胰蛋白酶的耐受性不同。在消化条件相同时，成纤维细胞常先脱壁，这种区别在原代培养时更明显[3]。只要掌握好消化时间，利用这一方法可在原代培养时除去大部分成纤维细胞；(2)成纤维细胞和表皮细胞贴壁的动力学过程不同。成纤维细胞可在10～30min内完成贴壁，而在同样时间内表皮细胞则不能贴壁或贴壁不牢[4]。这种差别在未铺胶原的培养瓶中尤为突出。因此，可用反复差异贴壁的方法将污染的成纤维细胞进一步除去。
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我们利用以上方法分离和纯化的大鼠表皮细胞，研究了肾上腺素对细胞增殖活性的影响。肾上腺素可抑制表皮细胞的有丝分裂，在体小鼠皮肤上已早有报道[5]，在培养的大鼠皮肤和人表皮细胞上也进行过较系统的观察[6，7]。这些研究中，作为判断细胞增殖活性的指标，或者是用形态学上处于M期的细胞的百分比，或者是通过3H-TdR参入实验测定S期细胞的比例。我们在研究这一问题时，选择了AgNOR法作为衡量表皮细胞增殖活性的指标。NOR蛋白是一组与核糖体RNA转录、转录后修饰、以及核糖体组装相关的蛋白质，定位于核仁上。已经证明，NOR蛋白含量与细胞增殖活性成正相关。因而，将AgNOR与图像分析相结合对NOR蛋白进行定量分析的方法已广泛用于肿瘤的诊断[8]。我们用AA和NA作为定量的参数研究了肾上腺素对培养的大鼠表皮细胞NOR蛋白含量的影响，发现，肾上腺素浓度在10-10～10-6mol/L的范围内，均可使NOR蛋白含量明显下降，提示，此时表皮细胞增殖活性受到明显抑制。曾有报道，在培养的成年大鼠皮肤样品上，能抑制表皮细胞增殖的肾上腺素浓度是10-6mol/L[7]。这一浓度是本实验观察到的能抑制细胞增殖的肾上腺素浓度的上限。观察对象和观察指标的不同都可能造成上述结果的差异，其具体原因有待进一步研究。
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本研究用AA和NA这两个参数得到了大体相同的结果，但也存在区别。这主要表现在10-9～10-7mol/L的浓度范围内两参数的变化趋势上。如方法中所述，AA所测量的是单位面积细胞核上染色颗粒的面积，根据体视学原理，两种结构在二维图像上的面积百分比(即AA)等于其在空间的体积百分比[9]，因此，AA实际上所代表的是细胞核单位体积中所含的NOR蛋白的体积，因而与NOR蛋白含量的变化成正相关；而NA则并不总是与NOR蛋白含量的变化成正相关。因为，如果NOR蛋白含量减少但变得分散，则NA不仅不会减少反而可能增加。所以，用AA来表示NOR蛋白含量并进而作为细胞增殖活性的量度似乎更为合理。基于这一分析，本实验结果进一步提示，在所观察的范围内，不同的肾上腺素浓度对培养的大鼠表皮细胞增殖的抑制作用也不相同，而以10-8mol/L的作用最强。
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常昕同志参与了本文实验AgNOR法的建立，实验中的图像分析工作得到本校医药卫生分析中心细胞分析室帮助，谨致谢意。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770895)，CMB基金资助
作者简介：霍正浩(1958—)，男，山西孝义人，医学学士，副教授
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收稿日期：1999-12-11
修回日期：1999-04-22, 百拇医药