奥替普拉和反义GST-π对恶性转化细胞凋亡影响的研究
作者：柏华 胡国刚 朱明 魏慧娟 田海梅 罗贤懋
单位：柏华 胡国刚 朱明 魏慧娟 田海梅 罗贤懋(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京 100021)
关键词：奥替普拉；凋亡；谷胱甘肽-硫-转移酶
解剖学报000108 摘 要：目的 探索奥替普拉(oltipraz)和反义GST-π在诱导恶性转化细胞凋亡中的作用。 方法 利用逆转录病毒载体pDORneo构建GST-π重组质粒pDGSTas，用Lipofectin将反义GST-πRNA导入转化的恶性Rat-1细胞(T-Rat-1)，经G418筛选获得反义转染的Rat-1细胞(AT-Rat-1)；再用oltipraz分别作用于正常的Rat-1、T-Rat-1和AT-Rat-1；细胞凋亡状况用流式细胞仪和DNA凝胶电泳分析。 结果 ELISA分析显示AT-Rat-1细胞的GST-π蛋白含量比T-Rat-1细胞降低；筛选多个剂量后发现oltipraz在130～140mg/L，范围能明显诱导AT-Rat-1细胞凋亡。同时用Northern Blot检查发现AT-Rat-1细胞的c-fos mRNA表达水平高于正常Rat-1细胞和T-Rat-1细胞。 结论 oltiprz在适当浓度时能诱导AT-Rat-1细胞凋亡；GST-π的低表达和c-fos基因的高表达与AT-Rat-1细胞凋亡相关。
, 百拇医药
分类号：R979.1 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-29
EFFECT OF OLTIPRAZ AND ANTISENCE GST-π ON
APOPTOSIS OF MALIGNANT TRANSFORMED CELLS
BAI Hua
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
HU Guo-gang
, 百拇医药 (Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
ZHU Ming
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
WEI Hui-juan
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
, 百拇医药
TIAN Hai-mei
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
LUO Xian-mao
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
Abstract：Objective To Study the effect of oltipraz and anti-sence GST-π on apoptosis of malignant transformed Rat-1 cell Methods GST-π cDNA inserted retroviral expression vectors pDORneo were constructed into recombinant pDGSTas and transfected to T-Rat-1 cell by Lipofectin;T-Rat-1 cell containing anti-sense GST-π RNA(AT-Rat-1) was obtained by G418 screening; then Rat-1,T-Rat-1 and AT-Rat-1 cells were treated by oltipraz,The apoptosis of above cells was analyzed by DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry examination. Results GST-π protein content of AT-Rat-1 is lower than that of T-Rat-1 by ELISA.Oltipraz has a obvious effect of inducing AT-Rat-1 cell apoptosis in 130-140mg/L.Meanwhile,it is shown that c-fos mRNA of AT-Rat-1 cell is higher experssion than that of T-Rat-1 by Northern blot analysis. Conclusion The apoptosis of AT-Rat-1 cell can be induced by a effective dose of oltipraz; The high expression of c-fos gene and low expression of GST-π gene are related to AT-Tat-1 cell apoptosis.
, http://www.100md.com
Key words：oltipraz; apoptosis; GST▲
用致癌素香烟凝聚物(cigarette smoking condensate,CSC)处理人胚肺组织，提取DNA转化大鼠成纤维细胞Rat-1，能获得一种介于良性细胞和癌细胞之间的恶性转化Rat-1细胞(transformed Rat-1,T-Rat-1),该细胞处在癌变的早期阶段[1]。谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)是人肺癌变早期的精确标记之一，GST-π基因的异常表达也许能抑制细胞凋亡的启动，而促进细胞癌变[2]。我们推测反义GST-π能够抑制恶性转化细胞的癌变，故此构建了一个带有反义GST-πRNA的重组质粒，导入恶性转化Rat-1细胞，并进行了深入研究。
另一方面，oltipraz是从十字花科绿色植物中提取的巯基类化合物，全称：5-(2-吡嗪基)-4-甲1、2-二羟基-3-硫酮。1993年美国NCI倡仪用它作临床Ⅰ期抗癌药物试验。oltipraz防癌抑癌的作用，与其影响GSTs、醌还原酶、环氧化脱氢酶、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、细胞色素P450、黄曲霉素B1醛还原酶(AFAR)等密切相关[3]。它是否能诱导某些细胞的凋亡是令人感兴趣的问题。我们将oltipraz与反义GST-π、原癌基因之一c-fos联系起来进行研究，试图在细胞增殖、分化、癌变、凋亡之间找出某些规律性。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验材料
Rat-1细胞为大鼠成纤维细胞，具有异倍体核型，但无致瘤性，属非恶性细胞，由中国医学科学院肿瘤所李申德教授惠赠。PA317细胞为病毒包装细胞，由中国医学科学院分子免疫室孙宗棠教授惠赠。NIH3T3细胞为小鼠成纤维细胞，由陈秋燕博士提供。
质粒GST-π为全长人GST-π cDNA克隆在PUC18质粒中，经EcoRI酶切后获得的0.75kb的GST-π cDNA,由日本东京大学Muramatsu教授惠赠。质粒pDORneo长6.55kb，包含了M-MuLV5′和3′-LTR，SV40早期启动子驱动NED基因，含有部分PBR322片段，可在E.coli中复制并有Amp抗性，多克隆位点上有3个单一酶切点，由中国医学科学院细胞生物室转赠。
探针c-fos为1.3kb，购自中山生物公司。β-actin 2.0kb，购自天象人公司。试剂盒：Prime-gene Labeling Kit Promega,转染试剂Lipofectin(GIBC-OBRL),G418均购自东方生物公司；同位素[α-32P]-dCTP，购自福瑞公司；oltipraz由美国NIH Bourat博士赠送。
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2.实验方法
2.1 “恶性转化Rat-1细胞”的获得，参见文献[4]，反义GST-πRNA(pDGSTas)重组质粒构建参见文献[5]，将pDORneo用EcoRI单酶切后直接用碱性磷酸酶CIAP处理1h，电泳回收后取60ng处理过的线性载体加25ng GST-π cDNA片断，在10μl反应体系中T4DNA连结酶连接3h，取2μl转染E.coli HB101，快提鉴定。GST-π cDNA计算机读码分析，以确定酶切鉴定用的合适酶切位点。
2.2 GST活性测定：(1)样品制备：PBS洗细胞，刮下，破碎，4℃离心；(2)样品蛋白含量测定：求标准曲线，取样品100μl加入碱铜-酚试剂，测OD750；(3)GSTs活性：取0.2mol/L磷酸缓冲液2ml，加底物20mmol/L CDNB 500μl；20mmol/L GSH 50μl，样品100μl，测OD340;(4)GST-π测定(ELISA法)：用小鼠单抗MAbⅢ，BSA包被，加样品或抗原标准，加多抗，再加驴抗兔IgG-碱性磷酸酶，加PNPP，最后加3 mol/L NaOH，酶联免疫仪测OD410值；计算各样品GST-π含量(μg/L)，以蛋白含量为基准换算成GST-π实际含量(μg/L protein)。
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2.3 细胞转染(Lipofectin介导)：(1)病毒颗粒的制备：PA317细胞在1640中培养。将DNA(空载体或重组质粒)10μg,Lipofectin 25μl分别稀释于1.5ml DMEM中，混合后加入单层细胞上混匀，37℃培养12h，36h后1∶4传代并加G418筛选，12d后挑出克隆，24孔板中扩增，取培养上清按1∶10梯度稀释，再感染NIH3T3，G418筛选后计数克隆数。(2)病毒滴度测定：NIH3T3细胞基本满瓶后1∶5传代，分别取病毒液(1∶10，1∶100，1∶1 000)100μl加到单层细胞上，加G418(800mg/L)筛选10d，计数阳性克隆数，病毒滴度为：细胞集落×稀释倍数×10。细胞感染时用高滴度病毒上清。(3)病毒感染靶细胞：选择高滴度的病毒液稀释后加入polybrene,加入Rat-1细胞或恶性Rat-1细胞中，放入CO2孵箱培养，用G418筛选；收集克隆及生长良好的靶细胞为AT-Rat-1；再作其他处理。
, 百拇医药
2.4 Northern Blot:取对数生长期细胞，按不同实验要求在不同时间常规提取RNA，每组样品含细胞约1×107个。用随机引物法进行c-fos基因探针标记，设定β-actin对照；按Promega提供的程序操作。取RNA 20μg在1.2%甲醛变性凝胶上电泳，用毛细管法将变性的RNA转移至硝酸纤维膜，42℃杂交，X光片显影，-70℃曝光。
2.5 与细胞凋亡相关的实验：(1)流式细胞分析(PI染色法)：胰酶消化制细胞悬液，乙醇固定。离心后加200μl RNaseA，水浴30min，加800μl PI染色液混匀，避光。用FACScan流式细胞仪测定。记录488nm处红色荧光，以Cell FIT软件分析处理数据。(2)DNA凝胶电泳分析：药物处理后按常规法提取细胞DNA，置于含EBr的琼脂糖凝胶中进行电泳。(3)细胞毒理的比色法测定(SRB法)：用96孔板，每孔加0.1ml DMEM(含细胞5 000/孔)，第2d用不同浓度(50、75、100、125、150、200mg/L)的oltipraz处理细胞，再培养24h，48h或72h。每孔加10%三氯醋酸100μl，清水洗，空气干燥，再每孔加入0.4%SRB100μl，1%醋酸洗，最后加入Tris,用酶联免疫仪检测570nmA值。
, 百拇医药
结 果
1.病毒包装及反义重组子转染、筛选
用Lipofectin将pDORneo(空载体)、pDGSTas分别导入病毒包装细胞PA317中，48h后消化细胞并加G418800mg/L筛选，分别挑出阳性克隆命名为pDA(空载体)、pDG(反义GST-π重组)。分别挑pDA、pDG各两个克隆扩大培养后用NIH3T3测滴度(表1)，收获最高滴度的病毒上清，分别感染恶性转化细胞Rat-1细胞。
表1 病毒滴度测定结果(CFU单位/毫升)
Table 1 Determinationof viruses titer(CFU/ml) 质 粒
plasmids
病毒滴度(CFU单位/ml)
, 百拇医药
viruses titer(CFU/ml)
PDORneo
pDA1
2.3×103
PDORneo
pDA2
1.7×103
PDGSTas
pDG1
1.2×104
, http://www.100md.com PDGSTas
pDG2
2.5×103
G418筛选后阳性克隆命名为pDGL,pDGL经扩大培养，获得反义转染的Rat-1细胞(antisence transfected Rat-1 cell,AT-Rat-1)。转染细胞之间、转染与未转染细胞之形态无明显差别(图1)。
图1 通过G418克隆筛选后、反义转染的两类Rat-1细胞形态比较
A:转染pDGSTas的反义转染Rat-1细胞×100 B.转染pDORneo(空载体)的反义转染Rat-1细胞×100
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Fig.1 Morphology of transfected cell cloned by G418 screen.
A. AT-Rat-1 cell transfected with pDGSTas ×100 B. AT-Rat-1 cell transfected with pDORneo ×100
2.反义重组子导入后对GST活性的影响
测定AT-Rat-1的GSTs活性和GST-π蛋白含量，并与T-Rat-1和Rat-1比较。发现AT-Rat-1两次数值明显低于T-Rat-1(P<0.05)，比Rat-1的稍高，但差别无显著性(表2)。
表2 正常Rat-1细胞、转染的Rat-1细胞和反义
转染的Rat-1细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活性
, 百拇医药
和谷胱甘肽过氧化物酶-pi含量的比较
Table 2 Compared to GSTs activity and GST-π content
of Rat-1 cell,T-Rat-1 cell,and AT-Rat-1 cell 分组
group
GSTs活性
GSTs activity
(nmol/L/min/mg prot)
GST-π含量
GST-π content
, 百拇医药 (ng/mg prot)
±s
Rat-1
35.6±9.3
49.5±10.7
T-Rat-1
60.7±16.9
90.2±24.3
AT-Rat-1
37.1±9.5*
51.2±5.4*
, 百拇医药
上述结果的数据被重复测试3次并计算所得，*P<0.05是与转化的Rat-1细胞比较；
The results are calculatrd as±s of 3 separated experiments.
*P<0.05 versus T-Rat-1
3.Oltipraz诱导各类Rat-1细胞凋亡的作用
3.1用SRB法初筛oltipraz剂量，试用多种浓度的oltipraz均未能诱导Rat-1细胞及转化Rat-1细胞凋亡；
3.2 流式细胞仪分析AT-Rat-1 cell凋亡：oltipraz配成110、120、130、140、150、160mg/L浓度，分别作用于AT-Rat-1细胞，发现130～140mg/L浓度时诱导凋亡细胞的百分比较高。流式细胞仪分析发现亚G1峰判为凋亡；对照未出现。
, 百拇医药
3.3 DNA Ladder:用130mg/L的oltipraz作用AT-Rat-1细胞48h，然后提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，出现特征性的DNA‘Ladder’，表明此浓度的oltipraz确能诱导AT-Rat-1凋亡(图4)。
4.Oltipraz在诱导RT-Rat-1凋亡时对c-fos mRNA的影响
Northern blot实验结果显示(图5)，oltipraz作用RT-Rat-1 cell出现凋亡时，c-fos mRNA较其他对照细胞(未用oltipraz处理的AT-Rat-1，T-Rat-1和用oltipraz作用的T-Rat-1)增高大约3倍、3倍和5倍。用β-actin对照，以防假阳性。
图2 从各种细胞中抽提DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定细胞凋亡
, 百拇医药
第1道：反义转染Rat-1细胞；第2道：分子量标准 λDNA/H Ⅲ； 第3道：用140mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞；第4道：用130mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞。
Fig.2 Analysis of cell apoptosis with agarose gel electrophoresis of DNA extracted from those AT-Rat-1 cells
Lane 1,AT-Rat-1 cell; Lane 2,λDNA/HⅢ;Lane 3,AT-Rat-1 treated with 140 mg/L oltipraz; Lane 4,AT-Rat-1 treated with 130 mg/L oltipraz;
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图3 Northern blot分析c-fos mRNA表达
从经过或不经过oltipraz处理的AT-Rat-1和T-Rat-1细胞中分别提取细胞总RNA 20μg,这些RNA通过1.2%变性的琼脂糖凝胶电泳，然后转移到尼龙膜上并与经过32P标记的c-fos cDNA进行杂交
第1道：用140mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞；第2道：反义转染Rat-1细胞，第3道：用135 mg/L oltipraz处理的转化的Rat-1细胞；第4道：用130mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞；第5道：转化Rat-1细胞。
Fig.3 Northern blot analysis of c-fos mRNA experssion
20μg of total cellular RNAs from AT-Rat-1 and T-Rat-1 cell treated oltipraz,the RNAs were electrophoresed on 1.2% denatured agarose gel and transferred into nylon membrance and hybridized with 32P-labeled by c-fos cDNA.Lane 1,AT-Rat-1 treated with 140mg/L oltipraz; Lane 2,AT-Rat-1；Lane 3,T-Rat-1 treated with 135 mg/L oltipraz; Lane 4,AT-Rat-1 treated with 130 mg/L oltipraz; Lane 5:T-Rat-1。
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讨 论
大多数抗癌药物，如拓扑异构酶制剂、烷化剂、抗代谢药物和激素拮抗剂等，都可诱导不同类型肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞对凋亡的反应是决定化疗效果的关键因素之一，如何在治疗中提高肿瘤细胞死亡/增殖比已成为新的化疗目标和筛选抗癌新药的标准。最初发现oltipraz仅有预防癌症作用，后来发现它对消化系统肿瘤也有一定治疗作用[6]。这种治疗作用是否属于偶然性呢?我们试验了oltipraz诱导恶性转化细胞凋亡的可能性，并对oltipraz诱导凋亡的机理作了探讨。
将反义GST-π RNA导入上述T-Rat-1细胞中，经过G418筛选获得AT-Rat-1细胞；进一步我们用oltipraz处理了正常Rat-1、AT-Rat-1和T-Rat-1细胞，发现oltipraz未能诱导恶性T-Rat-1和良性Rat-1细胞凋亡而诱导了AT-Rat-1细胞凋亡；同时就上述3类细胞分别提取RNA作c-fos基因表达的NorthernBlot分析，发现AT-Rat-1组的c-fos mRNA表达较另两组细胞明显增高；这些结果为oltipraz能通过诱导凋亡而抗癌抑癌提供了一定的依据，也为探讨oltipraz影响凋亡的机理提供了线索。
, 百拇医药
GST-π能通过亲电子化合物的灭活、还原活性氧及参与DNA损伤修复等而阻止细胞凋亡发生，GST-π的异常表达是细胞凋亡发生的不利因素，启动细胞可能正是在GST-π的“保护”作用下，安全跨过细胞程序性死亡途径；因此，抑制GST-π在启动细胞中异常表达对阻止或延缓细胞癌变过程具有较大意义[5]。反义GST-π导入恶性转化细胞能下调GST-π活性，与oltipraz能诱导凋亡抑制增殖作用具有协同性，它们共同作用诱导了AT-Rat-1细胞凋亡。那么增大oltipraz浓度或剂量是否能诱导恶性Rat-1细胞或正常Rat-1细胞凋亡呢?从GST-π单一因素考虑情况也许如此，但有机体是一个精细的调节系统，还有许多其他基因调控着细胞凋亡。
已有GST与凋亡相关的研究报道，如Flomerfelt等用类固醇激素诱导人淋巴细胞凋亡时，GST-Yam RNA(μ类)表达明显增高；而GST-π与凋亡直接相关的证据很少。本实验发现伴随oltipraz诱导AT-Rat-1细胞凋亡，在GST-π降低的同时出现了c-fos基因表达的升高；我们推论c-fos基因的高表达可促进细胞凋亡，并设想GST-π也许是通过调节c-fos基因表达而影响凋亡的发生。在转基因小鼠胚胎形成的研究中，c-fos调控元件驱动的LacZ报告基因的局部表达提示：有c-fos持续表达的区域与行将走向细胞凋亡的区域一致[7]。目前尚不清楚c-fos基因的表达是细胞自杀程序的一部分，还是由于某些外部诱导凋亡的信号(如TNF或Fas等)对靶细胞的刺激作用所致；而GST-π 通过哪些环节来调节c-fos基因表达也是有待探索的问题。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570798)
作者简介：柏华(1964—)，男，湖南人，医学博士，副教授
参考文献：
[1]Weinberg RA.Oncogenes,antioncogenes and the molecular.bases of multistep Carcinogenesis.Cancer Res.,1989,49(14)：3713-3721.
[2]Egner PA,Kensler TW,Prestera T,et al.Regulation of phase 2 enzyme induction by oltipraz and dithiolethione[J].Carcinogenesis,1994,15(2):177-181.
, 百拇医药
[3]Davidson NE,Egner PA,Kensler TW.Transcriptional control of glutathiones-S-transferase gene by the chemoprotective agent oltipraz in rat liver[J].Cancer Res,1990,50(4):2251-2255.
[4]柏华，罗贤懋，魏慧娟，等.Oltipraz对细胞恶性转化抑制作用的研究[J].中国实验动物学报，1997，5(1)：41～45.
[5]周中军，金顺钱，罗贤懋，等.谷胱甘肽-S-转移酶在肺癌细胞耐药中的作用[J].生物化学杂志，1996，12(2)：196～199.
[6]Primiao T,Egner PA,Sutter TR,et al.Intermittent dosing with oltipraz:relationship between chemoprevention of aflatoxin-induced tumorigenesis and induction of glutathione-S-transferase.Cancer Res,1995，55(19)：4319-4324.
[7]Semeyne RJ,Vendrell M,Hayward M,et al.Continous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo[J].Nature,1993,363(6425)：166-169.
收稿日期：1998-11-03
修回日期：1999-05-14, 百拇医药
单位：柏华 胡国刚 朱明 魏慧娟 田海梅 罗贤懋(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京 100021)
关键词：奥替普拉；凋亡；谷胱甘肽-硫-转移酶
解剖学报000108 摘 要：目的 探索奥替普拉(oltipraz)和反义GST-π在诱导恶性转化细胞凋亡中的作用。 方法 利用逆转录病毒载体pDORneo构建GST-π重组质粒pDGSTas，用Lipofectin将反义GST-πRNA导入转化的恶性Rat-1细胞(T-Rat-1)，经G418筛选获得反义转染的Rat-1细胞(AT-Rat-1)；再用oltipraz分别作用于正常的Rat-1、T-Rat-1和AT-Rat-1；细胞凋亡状况用流式细胞仪和DNA凝胶电泳分析。 结果 ELISA分析显示AT-Rat-1细胞的GST-π蛋白含量比T-Rat-1细胞降低；筛选多个剂量后发现oltipraz在130～140mg/L，范围能明显诱导AT-Rat-1细胞凋亡。同时用Northern Blot检查发现AT-Rat-1细胞的c-fos mRNA表达水平高于正常Rat-1细胞和T-Rat-1细胞。 结论 oltiprz在适当浓度时能诱导AT-Rat-1细胞凋亡；GST-π的低表达和c-fos基因的高表达与AT-Rat-1细胞凋亡相关。
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分类号：R979.1 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-29
EFFECT OF OLTIPRAZ AND ANTISENCE GST-π ON
APOPTOSIS OF MALIGNANT TRANSFORMED CELLS
BAI Hua
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
HU Guo-gang
, 百拇医药 (Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
ZHU Ming
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
WEI Hui-juan
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
, 百拇医药
TIAN Hai-mei
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
LUO Xian-mao
(Cancer Institute,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China)
Abstract：Objective To Study the effect of oltipraz and anti-sence GST-π on apoptosis of malignant transformed Rat-1 cell Methods GST-π cDNA inserted retroviral expression vectors pDORneo were constructed into recombinant pDGSTas and transfected to T-Rat-1 cell by Lipofectin;T-Rat-1 cell containing anti-sense GST-π RNA(AT-Rat-1) was obtained by G418 screening; then Rat-1,T-Rat-1 and AT-Rat-1 cells were treated by oltipraz,The apoptosis of above cells was analyzed by DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry examination. Results GST-π protein content of AT-Rat-1 is lower than that of T-Rat-1 by ELISA.Oltipraz has a obvious effect of inducing AT-Rat-1 cell apoptosis in 130-140mg/L.Meanwhile,it is shown that c-fos mRNA of AT-Rat-1 cell is higher experssion than that of T-Rat-1 by Northern blot analysis. Conclusion The apoptosis of AT-Rat-1 cell can be induced by a effective dose of oltipraz; The high expression of c-fos gene and low expression of GST-π gene are related to AT-Tat-1 cell apoptosis.
, http://www.100md.com
Key words：oltipraz; apoptosis; GST▲
用致癌素香烟凝聚物(cigarette smoking condensate,CSC)处理人胚肺组织，提取DNA转化大鼠成纤维细胞Rat-1，能获得一种介于良性细胞和癌细胞之间的恶性转化Rat-1细胞(transformed Rat-1,T-Rat-1),该细胞处在癌变的早期阶段[1]。谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)是人肺癌变早期的精确标记之一，GST-π基因的异常表达也许能抑制细胞凋亡的启动，而促进细胞癌变[2]。我们推测反义GST-π能够抑制恶性转化细胞的癌变，故此构建了一个带有反义GST-πRNA的重组质粒，导入恶性转化Rat-1细胞，并进行了深入研究。
另一方面，oltipraz是从十字花科绿色植物中提取的巯基类化合物，全称：5-(2-吡嗪基)-4-甲1、2-二羟基-3-硫酮。1993年美国NCI倡仪用它作临床Ⅰ期抗癌药物试验。oltipraz防癌抑癌的作用，与其影响GSTs、醌还原酶、环氧化脱氢酶、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、细胞色素P450、黄曲霉素B1醛还原酶(AFAR)等密切相关[3]。它是否能诱导某些细胞的凋亡是令人感兴趣的问题。我们将oltipraz与反义GST-π、原癌基因之一c-fos联系起来进行研究，试图在细胞增殖、分化、癌变、凋亡之间找出某些规律性。
, 百拇医药
材料和方法
1.实验材料
Rat-1细胞为大鼠成纤维细胞，具有异倍体核型，但无致瘤性，属非恶性细胞，由中国医学科学院肿瘤所李申德教授惠赠。PA317细胞为病毒包装细胞，由中国医学科学院分子免疫室孙宗棠教授惠赠。NIH3T3细胞为小鼠成纤维细胞，由陈秋燕博士提供。
质粒GST-π为全长人GST-π cDNA克隆在PUC18质粒中，经EcoRI酶切后获得的0.75kb的GST-π cDNA,由日本东京大学Muramatsu教授惠赠。质粒pDORneo长6.55kb，包含了M-MuLV5′和3′-LTR，SV40早期启动子驱动NED基因，含有部分PBR322片段，可在E.coli中复制并有Amp抗性，多克隆位点上有3个单一酶切点，由中国医学科学院细胞生物室转赠。
探针c-fos为1.3kb，购自中山生物公司。β-actin 2.0kb，购自天象人公司。试剂盒：Prime-gene Labeling Kit Promega,转染试剂Lipofectin(GIBC-OBRL),G418均购自东方生物公司；同位素[α-32P]-dCTP，购自福瑞公司；oltipraz由美国NIH Bourat博士赠送。
, 百拇医药
2.实验方法
2.1 “恶性转化Rat-1细胞”的获得，参见文献[4]，反义GST-πRNA(pDGSTas)重组质粒构建参见文献[5]，将pDORneo用EcoRI单酶切后直接用碱性磷酸酶CIAP处理1h，电泳回收后取60ng处理过的线性载体加25ng GST-π cDNA片断，在10μl反应体系中T4DNA连结酶连接3h，取2μl转染E.coli HB101，快提鉴定。GST-π cDNA计算机读码分析，以确定酶切鉴定用的合适酶切位点。
2.2 GST活性测定：(1)样品制备：PBS洗细胞，刮下，破碎，4℃离心；(2)样品蛋白含量测定：求标准曲线，取样品100μl加入碱铜-酚试剂，测OD750；(3)GSTs活性：取0.2mol/L磷酸缓冲液2ml，加底物20mmol/L CDNB 500μl；20mmol/L GSH 50μl，样品100μl，测OD340;(4)GST-π测定(ELISA法)：用小鼠单抗MAbⅢ，BSA包被，加样品或抗原标准，加多抗，再加驴抗兔IgG-碱性磷酸酶，加PNPP，最后加3 mol/L NaOH，酶联免疫仪测OD410值；计算各样品GST-π含量(μg/L)，以蛋白含量为基准换算成GST-π实际含量(μg/L protein)。
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2.3 细胞转染(Lipofectin介导)：(1)病毒颗粒的制备：PA317细胞在1640中培养。将DNA(空载体或重组质粒)10μg,Lipofectin 25μl分别稀释于1.5ml DMEM中，混合后加入单层细胞上混匀，37℃培养12h，36h后1∶4传代并加G418筛选，12d后挑出克隆，24孔板中扩增，取培养上清按1∶10梯度稀释，再感染NIH3T3，G418筛选后计数克隆数。(2)病毒滴度测定：NIH3T3细胞基本满瓶后1∶5传代，分别取病毒液(1∶10，1∶100，1∶1 000)100μl加到单层细胞上，加G418(800mg/L)筛选10d，计数阳性克隆数，病毒滴度为：细胞集落×稀释倍数×10。细胞感染时用高滴度病毒上清。(3)病毒感染靶细胞：选择高滴度的病毒液稀释后加入polybrene,加入Rat-1细胞或恶性Rat-1细胞中，放入CO2孵箱培养，用G418筛选；收集克隆及生长良好的靶细胞为AT-Rat-1；再作其他处理。
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2.4 Northern Blot:取对数生长期细胞，按不同实验要求在不同时间常规提取RNA，每组样品含细胞约1×107个。用随机引物法进行c-fos基因探针标记，设定β-actin对照；按Promega提供的程序操作。取RNA 20μg在1.2%甲醛变性凝胶上电泳，用毛细管法将变性的RNA转移至硝酸纤维膜，42℃杂交，X光片显影，-70℃曝光。
2.5 与细胞凋亡相关的实验：(1)流式细胞分析(PI染色法)：胰酶消化制细胞悬液，乙醇固定。离心后加200μl RNaseA，水浴30min，加800μl PI染色液混匀，避光。用FACScan流式细胞仪测定。记录488nm处红色荧光，以Cell FIT软件分析处理数据。(2)DNA凝胶电泳分析：药物处理后按常规法提取细胞DNA，置于含EBr的琼脂糖凝胶中进行电泳。(3)细胞毒理的比色法测定(SRB法)：用96孔板，每孔加0.1ml DMEM(含细胞5 000/孔)，第2d用不同浓度(50、75、100、125、150、200mg/L)的oltipraz处理细胞，再培养24h，48h或72h。每孔加10%三氯醋酸100μl，清水洗，空气干燥，再每孔加入0.4%SRB100μl，1%醋酸洗，最后加入Tris,用酶联免疫仪检测570nmA值。
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结 果
1.病毒包装及反义重组子转染、筛选
用Lipofectin将pDORneo(空载体)、pDGSTas分别导入病毒包装细胞PA317中，48h后消化细胞并加G418800mg/L筛选，分别挑出阳性克隆命名为pDA(空载体)、pDG(反义GST-π重组)。分别挑pDA、pDG各两个克隆扩大培养后用NIH3T3测滴度(表1)，收获最高滴度的病毒上清，分别感染恶性转化细胞Rat-1细胞。
表1 病毒滴度测定结果(CFU单位/毫升)
Table 1 Determinationof viruses titer(CFU/ml) 质 粒
plasmids
病毒滴度(CFU单位/ml)
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viruses titer(CFU/ml)
PDORneo
pDA1
2.3×103
PDORneo
pDA2
1.7×103
PDGSTas
pDG1
1.2×104
, http://www.100md.com PDGSTas
pDG2
2.5×103
G418筛选后阳性克隆命名为pDGL,pDGL经扩大培养，获得反义转染的Rat-1细胞(antisence transfected Rat-1 cell,AT-Rat-1)。转染细胞之间、转染与未转染细胞之形态无明显差别(图1)。
图1 通过G418克隆筛选后、反义转染的两类Rat-1细胞形态比较
A:转染pDGSTas的反义转染Rat-1细胞×100 B.转染pDORneo(空载体)的反义转染Rat-1细胞×100
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Fig.1 Morphology of transfected cell cloned by G418 screen.
A. AT-Rat-1 cell transfected with pDGSTas ×100 B. AT-Rat-1 cell transfected with pDORneo ×100
2.反义重组子导入后对GST活性的影响
测定AT-Rat-1的GSTs活性和GST-π蛋白含量，并与T-Rat-1和Rat-1比较。发现AT-Rat-1两次数值明显低于T-Rat-1(P<0.05)，比Rat-1的稍高，但差别无显著性(表2)。
表2 正常Rat-1细胞、转染的Rat-1细胞和反义
转染的Rat-1细胞的谷胱甘肽过氧化物酶活性
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和谷胱甘肽过氧化物酶-pi含量的比较
Table 2 Compared to GSTs activity and GST-π content
of Rat-1 cell,T-Rat-1 cell,and AT-Rat-1 cell 分组
group
GSTs活性
GSTs activity
(nmol/L/min/mg prot)
GST-π含量
GST-π content
, 百拇医药 (ng/mg prot)
±sRat-1
35.6±9.3
49.5±10.7
T-Rat-1
60.7±16.9
90.2±24.3
AT-Rat-1
37.1±9.5*
51.2±5.4*
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上述结果的数据被重复测试3次并计算所得，*P<0.05是与转化的Rat-1细胞比较；
The results are calculatrd as
±s of 3 separated experiments.*P<0.05 versus T-Rat-1
3.Oltipraz诱导各类Rat-1细胞凋亡的作用
3.1用SRB法初筛oltipraz剂量，试用多种浓度的oltipraz均未能诱导Rat-1细胞及转化Rat-1细胞凋亡；
3.2 流式细胞仪分析AT-Rat-1 cell凋亡：oltipraz配成110、120、130、140、150、160mg/L浓度，分别作用于AT-Rat-1细胞，发现130～140mg/L浓度时诱导凋亡细胞的百分比较高。流式细胞仪分析发现亚G1峰判为凋亡；对照未出现。
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3.3 DNA Ladder:用130mg/L的oltipraz作用AT-Rat-1细胞48h，然后提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳，出现特征性的DNA‘Ladder’，表明此浓度的oltipraz确能诱导AT-Rat-1凋亡(图4)。
4.Oltipraz在诱导RT-Rat-1凋亡时对c-fos mRNA的影响
Northern blot实验结果显示(图5)，oltipraz作用RT-Rat-1 cell出现凋亡时，c-fos mRNA较其他对照细胞(未用oltipraz处理的AT-Rat-1，T-Rat-1和用oltipraz作用的T-Rat-1)增高大约3倍、3倍和5倍。用β-actin对照，以防假阳性。
图2 从各种细胞中抽提DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定细胞凋亡
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第1道：反义转染Rat-1细胞；第2道：分子量标准 λDNA/H Ⅲ； 第3道：用140mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞；第4道：用130mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞。
Fig.2 Analysis of cell apoptosis with agarose gel electrophoresis of DNA extracted from those AT-Rat-1 cells
Lane 1,AT-Rat-1 cell; Lane 2,λDNA/HⅢ;Lane 3,AT-Rat-1 treated with 140 mg/L oltipraz; Lane 4,AT-Rat-1 treated with 130 mg/L oltipraz;
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图3 Northern blot分析c-fos mRNA表达
从经过或不经过oltipraz处理的AT-Rat-1和T-Rat-1细胞中分别提取细胞总RNA 20μg,这些RNA通过1.2%变性的琼脂糖凝胶电泳，然后转移到尼龙膜上并与经过32P标记的c-fos cDNA进行杂交
第1道：用140mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞；第2道：反义转染Rat-1细胞，第3道：用135 mg/L oltipraz处理的转化的Rat-1细胞；第4道：用130mg/L oltipraz处理的反义转染的Rat-1细胞；第5道：转化Rat-1细胞。
Fig.3 Northern blot analysis of c-fos mRNA experssion
20μg of total cellular RNAs from AT-Rat-1 and T-Rat-1 cell treated oltipraz,the RNAs were electrophoresed on 1.2% denatured agarose gel and transferred into nylon membrance and hybridized with 32P-labeled by c-fos cDNA.Lane 1,AT-Rat-1 treated with 140mg/L oltipraz; Lane 2,AT-Rat-1；Lane 3,T-Rat-1 treated with 135 mg/L oltipraz; Lane 4,AT-Rat-1 treated with 130 mg/L oltipraz; Lane 5:T-Rat-1。
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讨 论
大多数抗癌药物，如拓扑异构酶制剂、烷化剂、抗代谢药物和激素拮抗剂等，都可诱导不同类型肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞对凋亡的反应是决定化疗效果的关键因素之一，如何在治疗中提高肿瘤细胞死亡/增殖比已成为新的化疗目标和筛选抗癌新药的标准。最初发现oltipraz仅有预防癌症作用，后来发现它对消化系统肿瘤也有一定治疗作用[6]。这种治疗作用是否属于偶然性呢?我们试验了oltipraz诱导恶性转化细胞凋亡的可能性，并对oltipraz诱导凋亡的机理作了探讨。
将反义GST-π RNA导入上述T-Rat-1细胞中，经过G418筛选获得AT-Rat-1细胞；进一步我们用oltipraz处理了正常Rat-1、AT-Rat-1和T-Rat-1细胞，发现oltipraz未能诱导恶性T-Rat-1和良性Rat-1细胞凋亡而诱导了AT-Rat-1细胞凋亡；同时就上述3类细胞分别提取RNA作c-fos基因表达的NorthernBlot分析，发现AT-Rat-1组的c-fos mRNA表达较另两组细胞明显增高；这些结果为oltipraz能通过诱导凋亡而抗癌抑癌提供了一定的依据，也为探讨oltipraz影响凋亡的机理提供了线索。
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GST-π能通过亲电子化合物的灭活、还原活性氧及参与DNA损伤修复等而阻止细胞凋亡发生，GST-π的异常表达是细胞凋亡发生的不利因素，启动细胞可能正是在GST-π的“保护”作用下，安全跨过细胞程序性死亡途径；因此，抑制GST-π在启动细胞中异常表达对阻止或延缓细胞癌变过程具有较大意义[5]。反义GST-π导入恶性转化细胞能下调GST-π活性，与oltipraz能诱导凋亡抑制增殖作用具有协同性，它们共同作用诱导了AT-Rat-1细胞凋亡。那么增大oltipraz浓度或剂量是否能诱导恶性Rat-1细胞或正常Rat-1细胞凋亡呢?从GST-π单一因素考虑情况也许如此，但有机体是一个精细的调节系统，还有许多其他基因调控着细胞凋亡。
已有GST与凋亡相关的研究报道，如Flomerfelt等用类固醇激素诱导人淋巴细胞凋亡时，GST-Yam RNA(μ类)表达明显增高；而GST-π与凋亡直接相关的证据很少。本实验发现伴随oltipraz诱导AT-Rat-1细胞凋亡，在GST-π降低的同时出现了c-fos基因表达的升高；我们推论c-fos基因的高表达可促进细胞凋亡，并设想GST-π也许是通过调节c-fos基因表达而影响凋亡的发生。在转基因小鼠胚胎形成的研究中，c-fos调控元件驱动的LacZ报告基因的局部表达提示：有c-fos持续表达的区域与行将走向细胞凋亡的区域一致[7]。目前尚不清楚c-fos基因的表达是细胞自杀程序的一部分，还是由于某些外部诱导凋亡的信号(如TNF或Fas等)对靶细胞的刺激作用所致；而GST-π 通过哪些环节来调节c-fos基因表达也是有待探索的问题。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570798)
作者简介：柏华(1964—)，男，湖南人，医学博士，副教授
参考文献：
[1]Weinberg RA.Oncogenes,antioncogenes and the molecular.bases of multistep Carcinogenesis.Cancer Res.,1989,49(14)：3713-3721.
[2]Egner PA,Kensler TW,Prestera T,et al.Regulation of phase 2 enzyme induction by oltipraz and dithiolethione[J].Carcinogenesis,1994,15(2):177-181.
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[3]Davidson NE,Egner PA,Kensler TW.Transcriptional control of glutathiones-S-transferase gene by the chemoprotective agent oltipraz in rat liver[J].Cancer Res,1990,50(4):2251-2255.
[4]柏华，罗贤懋，魏慧娟，等.Oltipraz对细胞恶性转化抑制作用的研究[J].中国实验动物学报，1997，5(1)：41～45.
[5]周中军，金顺钱，罗贤懋，等.谷胱甘肽-S-转移酶在肺癌细胞耐药中的作用[J].生物化学杂志，1996，12(2)：196～199.
[6]Primiao T,Egner PA,Sutter TR,et al.Intermittent dosing with oltipraz:relationship between chemoprevention of aflatoxin-induced tumorigenesis and induction of glutathione-S-transferase.Cancer Res,1995，55(19)：4319-4324.
[7]Semeyne RJ,Vendrell M,Hayward M,et al.Continous c-fos expression precedes programmed cell death in vivo[J].Nature,1993,363(6425)：166-169.
收稿日期：1998-11-03
修回日期：1999-05-14, 百拇医药