伽玛刀不同剂量照射正常大鼠一侧尾壳核后延髓内Fos蛋白的表达及变化
作者：饶志仁 吴声伶 邱建勇 徐欣 段晓勤 鞠躬
单位：饶志仁 邱建勇 段晓勤 鞠 躬(第四军医大学全军神经科学研究所，西安 710032)；吴声伶 徐 欣(广东微侵袭神经外科治疗中心，广州 510010)
关键词：γ-刀；延髓；Fos；延髓内脏带；免疫组织化学
解剖学报000106 摘 要：目的 观察γ-刀不同剂量照射正常大鼠一侧尾壳核后3个月，远离靶区的延髓中尾段内Fos的表达和变化及与剂量的关系。 方法 分别用10Gy至100Gy 10个级别剂量照射大鼠一侧尾壳核，3个月后，用ABC法对延髓中尾段切片进行抗Fos蛋白的免疫组织化学反应。 结果 在延髓内脏带、三叉神经尾侧亚核、三叉神经间质核、延髓背侧网状核和下橄榄核等处出现多少不等的Fos阳性胞核，随着剂量的增加Fos阳性胞核的数量增加，范围扩大。在高剂量组的延髓腹外侧区出现3种Fos阳性细胞：胞核阳性、胞浆阴性；胞浆阳性、胞核阴性；胞核胞浆均为阳性。 结论 γ-刀照射前脑一个局部，在远离靶区的延髓中尾段出现Fos阳性反应，并与剂量成正相关。
, 百拇医药
分类号：R8 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-21
EXPRESSION AND CHANGE OF Fos IN THE MEDULLA
OBLONGATA OF RAT FOLLOWING EXPOSURE TO
VARIOUS DOSE OF GAMMA KNIFE
RAO Zhi-ren
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
WU Sheng-ling
, 百拇医药
(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)
QIU Jian-yong
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
XU Xin
(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)
DUAN Xiao-qin
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
, 百拇医药
JU Gong
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
Abstract：Objective To observe alterations in Fos protein expression in middle-caudal segment of the normal rat medulla oblongata after the unilateral caudate putamen nucleus was irradiated with different dosage of gamma knife.Methods The caudate putamen nucleus was irradiated with various dosage from 10Gy to 100Gy of gamma knife.The rats were sacrificed 3 months after irradiation and fixed and cut with cryostat.The sections of the medulla oblongata were reacted with anti-Fos protein immunohistochemical ABC method.Results At low dosage,Fos positive nucleus was observed in medullary visceral zone,caudal subnucleus of trigeminal nerve,intertrigeminal nucleus of trigeminal nerve,dorsal medullary reticular nucleus and inferior olive nucleus.With the dosage increasing,both the number and distribution scope of positive nucleus was increased.In the high dosage group,three types of Fos positive expression appeared in ventrolateral medulla oblongata nucleus.The three types were:only the nucleus was stained;only cytoplasm was stained;both nucleus and cytoplasm were stained.Conclusion Though a local nucleus in the forebrain was exposed to gamma knife,the distant area of middle-caudal segment of the medulla oblongata showed Fos positive reaction and the reaction was positively related with dosage.
, 百拇医药
Key words：Gamma knife;Medulla oblongata;Fos;Medullary visceral zone;Immunohistochemistry▲
γ-刀定位照射是某些颅内疾病(脑血管畸形、脑肿瘤及脑功能性疾病)的非手术治疗方法之一。有关γ-刀的放射神经生物学的基础研究虽有一些报告，但仍比较薄弱，Kandziolka等[1～3]曾做过比较系统的观察，他曾用γ-刀(30、40、50、60、70、80、100、150、200Gy)定位照射一侧尾状核头部，动物成活90d后靶区的组织学变化，结果照射剂量少于70Gy，在光镜下未见到组织学的改变；在70～100Gy发现神经元的大小与形态有变化，小动脉壁增厚，血红细胞或蛋白渗出血管外，并有点状坏死；150～200Gy照射后1～7d脑未出现病理学改变，14d出现靶区的脑水肿，21d后靶区出现一直径为4mm的坏死。这一结果初步提示了靶区脑组织的变化与剂量及成活时间的关系，由于他们只是用组织学方法仅观察了靶区组织的变化，说明的问题很局限，因此有必要对γ-刀照射正常大鼠脑部后，脑组织的变化进行更深入的研究。为此我们进行了两方面的工作，第1用100Gy剂量的γ-刀照射正常大鼠一侧尾状核头部，动物分别成活0.5、1、3、6、12h及1、3、7、14、30和90d后，采用组织学方法(HE染色)，组织化学方法(NADPH-diaphorase染色)，抗Fos蛋白，抗GFAP，抗0x42，和抗HSP70等免疫组织化学技术，观察全脑(包括靶区和非靶区)血管内皮，神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞的变化及其与时间的效应关系。第2用10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy的γ-刀照射正常大鼠一侧尾状核头部，动物均成活90d，采用上述方法观察全脑组织的变化及其剂量的效应关系。
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我们仅就用10Gy至100Gy不同剂量的γ-刀照射后延髓内Fos蛋白的表达及变化作一报告，其他结果另行报告(请参阅“全国首届微侵袭神经外科学术会议论文汇编”，广州，1998：66～119)。
材料和方法
共用SD成年雄性大鼠(体重200g)34只，其中实验组30只，对照组4只。
1.实验组
1.1 γ-刀照射：在戊巴比妥钠(40mg/kg,腹腔注射)麻醉下，大鼠被固定于γ-刀专用固定架上(自己设计)，用磁共振成像(MRI)进行脑冠状面的连续扫描，扫描图像传至γ-刀控制计算机，确定将照射靶区定于尾状核前部的X.Y.Z的座标。然后将大鼠固定架按确定座标安放在γ-刀定位架上，用4mm准直器，对脑组织实施照射，中心部位剂量分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy等10个剂量级，每一剂量级3只大鼠。
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1.2 组织材料的处理：照射后动物饲养在避光、温暖、水和食物充分的环境，均存活3个月，动物在戊巴比妥钠深麻下，按常规灌流固定。用恒冷箱切片机切制大脑的连续冠状切片(片厚30μm)，切片收集于冷PBS中。
1.3 免疫组织化学染色：切片在0.01mol/L KPBS中漂洗后，入含0.3% Triton X-100的KPBS浸泡300min(室温)，然后移至兔抗Fos抗体稀释液(1：1 000，Santa Cruz)孵育48h(4℃)。再入生物素结合的羊抗兔IgG(1:200,Vector),放置4h(温室)，最后入生物素-卵白素-HRP复合物(ABC：1∶500，Sigma)浸泡2～4h(室温)，放入显色剂(含0.05%DAB，2.5%硫酸镍铵，0.2%葡萄糖，0.04%氯化铵和0.0019%葡萄糖氧化酶的0.1mol/L醋酸缓冲液)中反应20min(室温)。以上步骤之间均用KPBS漂洗10min×3，常规贴片、干燥、脱水、透明、封片。
2.对照组和对照实验
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2.1 正常对照组：2只正常大鼠未经MRI和γ-刀处理，在深麻下按实验组方法对动物进行灌流固定、切片和免疫组织化学反应。
2.2 对照实验：大鼠2只在麻醉下固定于专用固定架上，放在γ-刀室(不受γ-刀直接照射)30min，动物成活90d按实验组步骤灌流固定，切片和免疫组织化学反应。
2.3 替代实验：随机抽取实验组切片若干，用KPBS替代第一抗体，浸泡切片48h(4℃)，其余步骤与实验组相同。结果未见到Fos阳性产物。
结 果
1.正常对照组和对照实验
仅在延髓内脏带(MVZ)的孤束核(NTS)和腹外侧延髓(VLM)有少数散在的Fos阳性胞核，其他部位为阴性。
2.实验组
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为了叙述方便，我们参照有关文献[1，2]将照射剂量分为3个剂量级，即低剂量级(10～30Gy)，中剂量级(40～60Gy)和高剂量级(70～100Gy)。
2.1 低剂量组(10～30Gy)：Fos阳性胞核出现在下列结构，(1)MVZ中有少量Fos阳性胞核，主要分布于NTS的内侧亚核(图1)，VLM的表面和腹外侧网状核(图2)，而MVZ中间部(IRt)则较少。MVZ内Fos阳性胞核的数量详见表1。(2)双侧延髓背侧网状核内有Fos表达(图3)。(3)三叉神经尾侧亚核(Sc5)有少量Fos胞核，以浅层为主，其他层均散在出现，照射侧多于非照射侧；三叉神经极间亚核以上部位则明显减少。(4)双侧三叉神经束间核也有少量Fos阳性胞核。
图1 10Gy照射后，最后区平面MVZ内孤束核(NTS)的Fos表达 ×100(下同)
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Fig.1 Expression of Fos in NTS of MVZ at area postrema (AP) level of rat after irradiating with 10Gy of gamma knife. ×100(The same as follows)
图2 10Gy照射后，最后区平面MVZ内腹外侧延髓(VLM)的Fos表达
Fig.2 Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 10Gy
图3 10Gy照射后，延髓背侧网状核的Fos表达
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Fig.3 Expression of Fos in the dorsal reticular nucleus of the medulla oblongata of rat after irradiating with 10Gy
表1 低剂量组(10～30Gy)9只大鼠MVZ
内Fos阳性胞核的计数
Table 1 Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ of
the rat (n=9) irradiated by low-dose(10-30Gy)
锥体交叉
平面
, 百拇医药 Pyr.level
最后区平面
AP.level
闩平面
Obex.level
闩吻侧平面
rostal level
to obex
NTS
503
852
206
108
, 百拇医药
IRt
90
163
78
70
VLM
807
1 053
402
280
总数
total
1 400
, 百拇医药
2 068
986
458
均数/只
average/
per rat
155.5
229.7
109.5
50.9
2.2 中剂量组(40～60Gy)，上述区域内的Fos阳性胞核有所增加，(1)MVZ的NTS、VLM和IRt Fos阳性胞核增加明显，形成一条弧形带状分布区，在VLM，Fos阳性胞核分布于表面，外侧网状核小细胞部，腹外侧网状核和三叉下核(图4～6)。MVZ内的Fos阳性胞核计数详见表2。(2)三叉神经尾侧亚核Fos阳性胞核有增加，仍以照射侧较多。(3)双侧延髓背侧网状核有较多的Fos阳性胞核，位于NTS之腹外侧，IRt背外侧与三叉神经尾侧亚核背侧之间。
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图4 50Gy照射后，闩平面MVZ内NTS的Fos表达
Fig.4 Expression of Fos in NTS of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy
图5 50Gy照射后，闩平面MVZ内中间网状带(IRt)的Fos表达
Fig.5 Expression of Fos in IRt of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy
图6 50Gy照射后，闩平面MVZ内VLM的Fos表达
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Fig.6 Expression of Fos in VLM of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy
表2 中剂量组(40～60Gy)9只大鼠MVZ
内Fos阳性胞核的计数
Table 2 Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ of
the rat (n=9) irradiated by mid-dose(40-60Gy)
锥体交叉
平面
Pyr.level
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最后区平面
AP.level
闩平面
Obex.level
闩吻侧平面
rostal level
to obex
NTS
803
1 252
406
214
IRt
, 百拇医药
261
460
178
98
VLM
1 074
1 603
504
381
总数
total
2 138
3 315
, 百拇医药
1 188
693
均数/只
average/
per rat
237.5
268.3
132.0
77
2.3 高剂量组(70～100Gy)，Fos表达的主要特点如下：(1)MVZ内Fos阳性胞核明显增多，形成一条弧形带状区。NTS的Fos阳性胞核主要分布于弧束周围(图7)；VLM的Fos阳性胞核散在分布于VLM各结构(图8)；IRt有较多的散在Fos阳性胞核(图9)。从锥体交叉平面至闩吻侧平面，Fos阳性胞核有所减少。MVZ内Fos阳性胞核计数详见表3。(2)双侧三叉神经尾侧亚核有较多的Fos阳性胞核，浅层较密集，深部各层也有散在分布；极间亚核以前偶见Fos胞核。(3)双侧三叉脊束束间核有少量Fos阳性胞核。(4)双侧外侧楔束核、下橄榄核有少量Fos阳性胞核。(5)双侧延髓背侧网状核有较密集的Fos阳性胞核。(6)在VLM观察3种Fos阳性细胞(神经元或神经胶质细胞)，即Fos阳性胞核，胞浆为阴性；Fos阳性胞浆，胞核为阴性；胞浆和胞核均为Fos阳性(图10～12)。
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图7 70Gy照射后，最后区平面MVZ内NTS的Fos表达
Fig.7 Expression of Fos in NTS of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy
图8 70Gy照射后，最后区平面MVZ内IRt的Fos表达
Fig.8 Expression of Fos in IRt of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy
图9 70Gy照射后，最后区平面MVZ内VLM的Fos表达
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Fig.9 Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy
图10 70Gy照射后，VLM内3种Fos阳性细胞，↑. 胞核阳性者；△. 胞浆阳性者；▲. 胞核胞浆均阳性者 ×200
Fig.10 Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70Gy↑Fos positive only in nuclei of cells, △Fos positive only in cytoplasm,▲Fos positive in both nuclei and cytoplasm. ×200(The same as follows)
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图11 70Gy照射后，VLM内胞核胞浆均Fos阳性细胞▲ ×200
Fig.11 Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70Gy↑Fos positive only in nuclei of cells, △Fos positive only in cytoplasm,▲Fos positive in both nuclei and cytoplasm. ×200(The same as follows)
图12 70Gy照射后，VLM内Fos阳性细胞 ×200
Fig.12 Fos positive cells in VLM after irradiating with 70Gy ×200
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表3 高剂量组(70～100Gy)12只大鼠MVZ
内Fos阳性胞核的计数
Table 3 Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ of
the rat (n=12) irradiated by hight-dose(70-100Gy)
锥体交叉
平面
Pyr.level
最后区平面
AP.level
闩平面
, 百拇医药
Obex.level
闩吻侧平面
rostal level
to obex
NTS
1 241
1 867
608
364
IRt
582
872
378
, http://www.100md.com
116
VLM
1 508
2 043
784
420
总数
total
3 331
4 782
1 770
950
均数/只
, http://www.100md.com
average/
per rat
277.5
498.5
147.5
70.8
总之，从低剂量至高剂量延髓内Fos阳性细胞数量增加，分布范围也逐渐扩大；MVZ是一个敏感区，Fos阳性细胞较密集，特别是NTS和VLM，在锥体交叉平面和最后区平面Fos阳性胞核较多，向吻侧至闩平面和闩吻侧平面Fos表达有所减少；双侧三叉神经尾侧亚核有Fos表达，极间亚核以吻部位则极少；在高剂量组可见到3种Fos阳性细胞。讨 论
1.关于γ刀照射大鼠脑部模型的建立
, http://www.100md.com 1.1 靶区位置的选定，本实验将靶区定于尾状核头部，其理由如下：(1)由于所用γ-刀装置是用于人脑的，最小的准直器直径为4mm,这就决定了γ射线集中照射中心区，直径最小为4mm，大鼠脑内仅尾状核头部较大超过4mm，结构比较单一，其他区域结构复杂，涉及的核团较多，增加了对结果解释的难度；(2)由于大鼠脑子小，在MRI扫描图上只有尾状核头部易于辨识；(3)国外已有学者用此作为靶区[2]。
1.2 照射剂量，我们选定从10Gy到100Gy的10个等级剂量，临床治疗用的剂量在此范围内[3]，虽然有的学者在动物实施过150Gy和200Gy的照射，远远超过了临床的实际用量，故未选用。
1.3 动物的成活时间，我们参考有关文献[1～3]将γ-刀照射后，脑组织的放射神经生物学效应分为早期(即照后90d以内)，中期(照后90d至1年)和长期(照后1年以上)。我们观察的是早期变化。
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2.关于Fos蛋白的表达及其意义
2.1 Fos蛋白表达显示技术的优缺点
c-fos早期原癌基因(c-fos proto oncogene)是存在于细胞内的第三信使，当受到刺激时，大多数细胞的反应是c-fos mRNA和Fos蛋白的早期表达。用原位分子杂交技术显示胞浆内的c-fos mRNA，用免疫组织化学方法显示胞核内的Fos蛋白。c-fos mRNA和Fos蛋白的显示技术作为神经系统的机能形态学方法已被广泛地采用[4，5，6]。当机体受到刺激时，神经系统与此机能相关的多级神经元可能出现阳性表达，而且非常敏感，这是其优点。由于任何刺激均能引起相应神经元的c-fos表达，因此如何保证c-fos表达的特异性是至关重要的[4～6]。我们对实验条件进行了严格控制，尽量减少无关刺激对动物的影响，并设置了对照组，从而保证结果的可靠性。
2.2 γ-刀照射后脑内Fos阳性表达及其意义
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γ-刀照射后除靶区出现Fos阳性细胞外，在全脑某些非靶区部位(例如：皮质、侧脑室周围的白质、海马以及下丘脑、杏仁中央核和延髓)也出现Fos阳性细胞，并显示出与照射剂量和成活时间的相应关系，有关结果另有报告[7]，故不赘述。
我们发现在大剂量(70～100Gy)照射或照后较长时间成活(3个月)后出现3种Fos阳性细胞，即(1)胞核阳性，胞浆阴性；(2)胞核阴性，胞浆阳性；(3)胞核、胞浆均为阳性。我们认为(1)为正常反应细胞，(2)是严重受损细胞，(3)是中间过渡性细胞，并专题作了报告[8]，在此不重复。
我们主要讨论γ-刀照射尾状核头部后延髓内Fos表达及其变化的意义。延髓内脏带(MVZ)是一个位于延髓中尾段，从背内侧，穿经网状结构至腹外侧延髓(VLM)的弧形带状区，呼吸中枢、心血管中枢等均位于MVZ内，MVZ参与应激反应的调节，各种伤害性刺激(胃肠、心血管、躯体、内分泌、免疫刺激)均引起MVZ内神经元的Fos表达，关于MVZ的结构与机能，请参阅Rao和Ju的综述[9]。γ-刀照射脑部，造成靶区脑组织的损伤，细胞变性、凋亡或坏死，因此靶区组织又形成了一个新的伤害性刺激源，通过神经传导或神经体液途径引起应激反应，MVZ内细胞产生不同程度Fos表达。随着照射剂量的增加，靶区组织的损伤也加重，应激反应也随之加强，Fos阳性细胞增多。锥体交叉平面和最后区平面MVZ内Fos阳性胞核密集，向吻侧至闩平面和闩吻侧平面，Fos的表达有所减少，可能与反应部位的位置有关。
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三叉神经脊束核接受经三叉神经半月节内神经元的中央突传入的躯体性感觉信息，痛觉冲动经三叉神经中的无髓和薄髓纤维传至三叉神经尾侧亚核。γ-刀照射脑部引起脑血管扩张和脑水肿，颅压增高而刺激支配脑膜的三叉神经，本实验发现γ-刀照射前部尾壳核后在双侧三叉神经尾侧亚核(以照射侧为主)出现较多的Fos阳性胞核，正说明这一点[10]。
延髓背侧网状核位于延髓尾侧网状结构的背外侧部，介于三叉神经尾侧亚核与MVZ的IRt之间。该核在伤害感受过程中具有鲜明的特性，这些神经元能特异地被全身伤害性刺激(包括内脏伤害性刺激)激活。延髓背侧网状核内神经元，在传递起源于脊髓和三叉系统的伤害性信息过程中起重要作用[11]。γ-刀照射前脑后引起该核内Fos阳性表达的机理不清楚。
三叉神经脊束间核是散在分布于三叉神经脊束纤维之间的神经元群，它接受来自三叉神经和迷走神经的传入，是躯体感觉与内脏感觉的汇聚区[12]，它发出纤维投射至脑干网状结构，臂旁核等结构。
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下橄榄核是一个重要的小脑前核，它接受多种来源的传入纤维，其中有来自三叉神经尾侧亚核的三叉橄榄纤维，它投射至双侧下橄榄核；还接受来自大脑皮质感觉运动区、尾状核、苍白球等下行纤维[10]。本实验在γ-刀照射一侧尾壳核后，双侧下橄榄核内出现Fos阳性胞核，这可能是因为(1)脑血管扩张，脑水肿引起了颅压升高而刺激了三叉神经，三叉神经尾侧亚核有纤维投身至双侧下橄榄核之故；(2)γ-刀照射靶区为尾壳核，而刺激了尾状核投射至下橄榄核之纤维。
总之延髓远离靶区，为何出现Fos阳性细胞，其机理可能很能复杂，上述解释只是一种假说，目前无法定论，有待进一步研究。
本研究获得广东微侵袭神经外科治疗中心董事长周达银高级工程师资助，特此致谢。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970230)
作者简介：铙志仁(1935—)，男，湖南浏阳市人，教授，博士生导师，研究室主任
, 百拇医药
参考文献：
[1]Kondziolka D,Lunstird LD,Flickihger J.Current concepts in gamma knife radiosurgery[J].Neurosurgery Quarterly,1992,3(4):253-271.
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[7]饶志仁,吴声伶,刘惠玲，等.正常大鼠脑组织伽玛刀照射后Fos蛋白的表达及变化[J].中国微侵袭神经外科杂志,1998,3(1)：36～41.
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[11]朱兵.延髓背侧网状亚核——一个和伤害感受有关的重要结构[R].复旦神经生物学讲座，1993，IX：53～70.
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收稿日期：1998-10-20
修回日期：1999-04-22, http://www.100md.com
单位：饶志仁 邱建勇 段晓勤 鞠 躬(第四军医大学全军神经科学研究所，西安 710032)；吴声伶 徐 欣(广东微侵袭神经外科治疗中心，广州 510010)
关键词：γ-刀；延髓；Fos；延髓内脏带；免疫组织化学
解剖学报000106 摘 要：目的 观察γ-刀不同剂量照射正常大鼠一侧尾壳核后3个月，远离靶区的延髓中尾段内Fos的表达和变化及与剂量的关系。 方法 分别用10Gy至100Gy 10个级别剂量照射大鼠一侧尾壳核，3个月后，用ABC法对延髓中尾段切片进行抗Fos蛋白的免疫组织化学反应。 结果 在延髓内脏带、三叉神经尾侧亚核、三叉神经间质核、延髓背侧网状核和下橄榄核等处出现多少不等的Fos阳性胞核，随着剂量的增加Fos阳性胞核的数量增加，范围扩大。在高剂量组的延髓腹外侧区出现3种Fos阳性细胞：胞核阳性、胞浆阴性；胞浆阳性、胞核阴性；胞核胞浆均为阳性。 结论 γ-刀照射前脑一个局部，在远离靶区的延髓中尾段出现Fos阳性反应，并与剂量成正相关。
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文章编号：0529-1356(2000)01-21
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OBLONGATA OF RAT FOLLOWING EXPOSURE TO
VARIOUS DOSE OF GAMMA KNIFE
RAO Zhi-ren
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
WU Sheng-ling
, 百拇医药
(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)
QIU Jian-yong
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
XU Xin
(Guang dong Minimally Invasive Neurosurgery Medical Center,Guang zhou 510630,China)
DUAN Xiao-qin
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
, 百拇医药
JU Gong
(Institute of Neuroscience,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
Abstract：Objective To observe alterations in Fos protein expression in middle-caudal segment of the normal rat medulla oblongata after the unilateral caudate putamen nucleus was irradiated with different dosage of gamma knife.Methods The caudate putamen nucleus was irradiated with various dosage from 10Gy to 100Gy of gamma knife.The rats were sacrificed 3 months after irradiation and fixed and cut with cryostat.The sections of the medulla oblongata were reacted with anti-Fos protein immunohistochemical ABC method.Results At low dosage,Fos positive nucleus was observed in medullary visceral zone,caudal subnucleus of trigeminal nerve,intertrigeminal nucleus of trigeminal nerve,dorsal medullary reticular nucleus and inferior olive nucleus.With the dosage increasing,both the number and distribution scope of positive nucleus was increased.In the high dosage group,three types of Fos positive expression appeared in ventrolateral medulla oblongata nucleus.The three types were:only the nucleus was stained;only cytoplasm was stained;both nucleus and cytoplasm were stained.Conclusion Though a local nucleus in the forebrain was exposed to gamma knife,the distant area of middle-caudal segment of the medulla oblongata showed Fos positive reaction and the reaction was positively related with dosage.
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Key words：Gamma knife;Medulla oblongata;Fos;Medullary visceral zone;Immunohistochemistry▲
γ-刀定位照射是某些颅内疾病(脑血管畸形、脑肿瘤及脑功能性疾病)的非手术治疗方法之一。有关γ-刀的放射神经生物学的基础研究虽有一些报告，但仍比较薄弱，Kandziolka等[1～3]曾做过比较系统的观察，他曾用γ-刀(30、40、50、60、70、80、100、150、200Gy)定位照射一侧尾状核头部，动物成活90d后靶区的组织学变化，结果照射剂量少于70Gy，在光镜下未见到组织学的改变；在70～100Gy发现神经元的大小与形态有变化，小动脉壁增厚，血红细胞或蛋白渗出血管外，并有点状坏死；150～200Gy照射后1～7d脑未出现病理学改变，14d出现靶区的脑水肿，21d后靶区出现一直径为4mm的坏死。这一结果初步提示了靶区脑组织的变化与剂量及成活时间的关系，由于他们只是用组织学方法仅观察了靶区组织的变化，说明的问题很局限，因此有必要对γ-刀照射正常大鼠脑部后，脑组织的变化进行更深入的研究。为此我们进行了两方面的工作，第1用100Gy剂量的γ-刀照射正常大鼠一侧尾状核头部，动物分别成活0.5、1、3、6、12h及1、3、7、14、30和90d后，采用组织学方法(HE染色)，组织化学方法(NADPH-diaphorase染色)，抗Fos蛋白，抗GFAP，抗0x42，和抗HSP70等免疫组织化学技术，观察全脑(包括靶区和非靶区)血管内皮，神经元，星形胶质细胞和小胶质细胞的变化及其与时间的效应关系。第2用10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy的γ-刀照射正常大鼠一侧尾状核头部，动物均成活90d，采用上述方法观察全脑组织的变化及其剂量的效应关系。
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我们仅就用10Gy至100Gy不同剂量的γ-刀照射后延髓内Fos蛋白的表达及变化作一报告，其他结果另行报告(请参阅“全国首届微侵袭神经外科学术会议论文汇编”，广州，1998：66～119)。
材料和方法
共用SD成年雄性大鼠(体重200g)34只，其中实验组30只，对照组4只。
1.实验组
1.1 γ-刀照射：在戊巴比妥钠(40mg/kg,腹腔注射)麻醉下，大鼠被固定于γ-刀专用固定架上(自己设计)，用磁共振成像(MRI)进行脑冠状面的连续扫描，扫描图像传至γ-刀控制计算机，确定将照射靶区定于尾状核前部的X.Y.Z的座标。然后将大鼠固定架按确定座标安放在γ-刀定位架上，用4mm准直器，对脑组织实施照射，中心部位剂量分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Gy等10个剂量级，每一剂量级3只大鼠。
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1.2 组织材料的处理：照射后动物饲养在避光、温暖、水和食物充分的环境，均存活3个月，动物在戊巴比妥钠深麻下，按常规灌流固定。用恒冷箱切片机切制大脑的连续冠状切片(片厚30μm)，切片收集于冷PBS中。
1.3 免疫组织化学染色：切片在0.01mol/L KPBS中漂洗后，入含0.3% Triton X-100的KPBS浸泡300min(室温)，然后移至兔抗Fos抗体稀释液(1：1 000，Santa Cruz)孵育48h(4℃)。再入生物素结合的羊抗兔IgG(1:200,Vector),放置4h(温室)，最后入生物素-卵白素-HRP复合物(ABC：1∶500，Sigma)浸泡2～4h(室温)，放入显色剂(含0.05%DAB，2.5%硫酸镍铵，0.2%葡萄糖，0.04%氯化铵和0.0019%葡萄糖氧化酶的0.1mol/L醋酸缓冲液)中反应20min(室温)。以上步骤之间均用KPBS漂洗10min×3，常规贴片、干燥、脱水、透明、封片。
2.对照组和对照实验
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2.1 正常对照组：2只正常大鼠未经MRI和γ-刀处理，在深麻下按实验组方法对动物进行灌流固定、切片和免疫组织化学反应。
2.2 对照实验：大鼠2只在麻醉下固定于专用固定架上，放在γ-刀室(不受γ-刀直接照射)30min，动物成活90d按实验组步骤灌流固定，切片和免疫组织化学反应。
2.3 替代实验：随机抽取实验组切片若干，用KPBS替代第一抗体，浸泡切片48h(4℃)，其余步骤与实验组相同。结果未见到Fos阳性产物。
结 果
1.正常对照组和对照实验
仅在延髓内脏带(MVZ)的孤束核(NTS)和腹外侧延髓(VLM)有少数散在的Fos阳性胞核，其他部位为阴性。
2.实验组
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为了叙述方便，我们参照有关文献[1，2]将照射剂量分为3个剂量级，即低剂量级(10～30Gy)，中剂量级(40～60Gy)和高剂量级(70～100Gy)。
2.1 低剂量组(10～30Gy)：Fos阳性胞核出现在下列结构，(1)MVZ中有少量Fos阳性胞核，主要分布于NTS的内侧亚核(图1)，VLM的表面和腹外侧网状核(图2)，而MVZ中间部(IRt)则较少。MVZ内Fos阳性胞核的数量详见表1。(2)双侧延髓背侧网状核内有Fos表达(图3)。(3)三叉神经尾侧亚核(Sc5)有少量Fos胞核，以浅层为主，其他层均散在出现，照射侧多于非照射侧；三叉神经极间亚核以上部位则明显减少。(4)双侧三叉神经束间核也有少量Fos阳性胞核。
图1 10Gy照射后，最后区平面MVZ内孤束核(NTS)的Fos表达 ×100(下同)
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Fig.1 Expression of Fos in NTS of MVZ at area postrema (AP) level of rat after irradiating with 10Gy of gamma knife. ×100(The same as follows)
图2 10Gy照射后，最后区平面MVZ内腹外侧延髓(VLM)的Fos表达
Fig.2 Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 10Gy
图3 10Gy照射后，延髓背侧网状核的Fos表达
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Fig.3 Expression of Fos in the dorsal reticular nucleus of the medulla oblongata of rat after irradiating with 10Gy
表1 低剂量组(10～30Gy)9只大鼠MVZ
内Fos阳性胞核的计数
Table 1 Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ of
the rat (n=9) irradiated by low-dose(10-30Gy)
锥体交叉
平面
, 百拇医药 Pyr.level
最后区平面
AP.level
闩平面
Obex.level
闩吻侧平面
rostal level
to obex
NTS
503
852
206
108
, 百拇医药
IRt
90
163
78
70
VLM
807
1 053
402
280
总数
total
1 400
, 百拇医药
2 068
986
458
均数/只
average/
per rat
155.5
229.7
109.5
50.9
2.2 中剂量组(40～60Gy)，上述区域内的Fos阳性胞核有所增加，(1)MVZ的NTS、VLM和IRt Fos阳性胞核增加明显，形成一条弧形带状分布区，在VLM，Fos阳性胞核分布于表面，外侧网状核小细胞部，腹外侧网状核和三叉下核(图4～6)。MVZ内的Fos阳性胞核计数详见表2。(2)三叉神经尾侧亚核Fos阳性胞核有增加，仍以照射侧较多。(3)双侧延髓背侧网状核有较多的Fos阳性胞核，位于NTS之腹外侧，IRt背外侧与三叉神经尾侧亚核背侧之间。
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图4 50Gy照射后，闩平面MVZ内NTS的Fos表达
Fig.4 Expression of Fos in NTS of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy
图5 50Gy照射后，闩平面MVZ内中间网状带(IRt)的Fos表达
Fig.5 Expression of Fos in IRt of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy
图6 50Gy照射后，闩平面MVZ内VLM的Fos表达
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Fig.6 Expression of Fos in VLM of MVZ at the obex level of rat after irradiating with 50Gy
表2 中剂量组(40～60Gy)9只大鼠MVZ
内Fos阳性胞核的计数
Table 2 Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ of
the rat (n=9) irradiated by mid-dose(40-60Gy)
锥体交叉
平面
Pyr.level
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最后区平面
AP.level
闩平面
Obex.level
闩吻侧平面
rostal level
to obex
NTS
803
1 252
406
214
IRt
, 百拇医药
261
460
178
98
VLM
1 074
1 603
504
381
总数
total
2 138
3 315
, 百拇医药
1 188
693
均数/只
average/
per rat
237.5
268.3
132.0
77
2.3 高剂量组(70～100Gy)，Fos表达的主要特点如下：(1)MVZ内Fos阳性胞核明显增多，形成一条弧形带状区。NTS的Fos阳性胞核主要分布于弧束周围(图7)；VLM的Fos阳性胞核散在分布于VLM各结构(图8)；IRt有较多的散在Fos阳性胞核(图9)。从锥体交叉平面至闩吻侧平面，Fos阳性胞核有所减少。MVZ内Fos阳性胞核计数详见表3。(2)双侧三叉神经尾侧亚核有较多的Fos阳性胞核，浅层较密集，深部各层也有散在分布；极间亚核以前偶见Fos胞核。(3)双侧三叉脊束束间核有少量Fos阳性胞核。(4)双侧外侧楔束核、下橄榄核有少量Fos阳性胞核。(5)双侧延髓背侧网状核有较密集的Fos阳性胞核。(6)在VLM观察3种Fos阳性细胞(神经元或神经胶质细胞)，即Fos阳性胞核，胞浆为阴性；Fos阳性胞浆，胞核为阴性；胞浆和胞核均为Fos阳性(图10～12)。
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图7 70Gy照射后，最后区平面MVZ内NTS的Fos表达
Fig.7 Expression of Fos in NTS of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy
图8 70Gy照射后，最后区平面MVZ内IRt的Fos表达
Fig.8 Expression of Fos in IRt of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy
图9 70Gy照射后，最后区平面MVZ内VLM的Fos表达
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Fig.9 Expression of Fos in VLM of MVZ at AP level of rat after irradiating with 70Gy
图10 70Gy照射后，VLM内3种Fos阳性细胞，↑. 胞核阳性者；△. 胞浆阳性者；▲. 胞核胞浆均阳性者 ×200
Fig.10 Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70Gy↑Fos positive only in nuclei of cells, △Fos positive only in cytoplasm,▲Fos positive in both nuclei and cytoplasm. ×200(The same as follows)
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图11 70Gy照射后，VLM内胞核胞浆均Fos阳性细胞▲ ×200
Fig.11 Three kinds of Fos positive cells in VLM of rat after irradiating with 70Gy↑Fos positive only in nuclei of cells, △Fos positive only in cytoplasm,▲Fos positive in both nuclei and cytoplasm. ×200(The same as follows)
图12 70Gy照射后，VLM内Fos阳性细胞 ×200
Fig.12 Fos positive cells in VLM after irradiating with 70Gy ×200
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表3 高剂量组(70～100Gy)12只大鼠MVZ
内Fos阳性胞核的计数
Table 3 Enumeration of Fos positive nuclei in MVZ of
the rat (n=12) irradiated by hight-dose(70-100Gy)
锥体交叉
平面
Pyr.level
最后区平面
AP.level
闩平面
, 百拇医药
Obex.level
闩吻侧平面
rostal level
to obex
NTS
1 241
1 867
608
364
IRt
582
872
378
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116
VLM
1 508
2 043
784
420
总数
total
3 331
4 782
1 770
950
均数/只
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average/
per rat
277.5
498.5
147.5
70.8
总之，从低剂量至高剂量延髓内Fos阳性细胞数量增加，分布范围也逐渐扩大；MVZ是一个敏感区，Fos阳性细胞较密集，特别是NTS和VLM，在锥体交叉平面和最后区平面Fos阳性胞核较多，向吻侧至闩平面和闩吻侧平面Fos表达有所减少；双侧三叉神经尾侧亚核有Fos表达，极间亚核以吻部位则极少；在高剂量组可见到3种Fos阳性细胞。讨 论
1.关于γ刀照射大鼠脑部模型的建立
, http://www.100md.com 1.1 靶区位置的选定，本实验将靶区定于尾状核头部，其理由如下：(1)由于所用γ-刀装置是用于人脑的，最小的准直器直径为4mm,这就决定了γ射线集中照射中心区，直径最小为4mm，大鼠脑内仅尾状核头部较大超过4mm，结构比较单一，其他区域结构复杂，涉及的核团较多，增加了对结果解释的难度；(2)由于大鼠脑子小，在MRI扫描图上只有尾状核头部易于辨识；(3)国外已有学者用此作为靶区[2]。
1.2 照射剂量，我们选定从10Gy到100Gy的10个等级剂量，临床治疗用的剂量在此范围内[3]，虽然有的学者在动物实施过150Gy和200Gy的照射，远远超过了临床的实际用量，故未选用。
1.3 动物的成活时间，我们参考有关文献[1～3]将γ-刀照射后，脑组织的放射神经生物学效应分为早期(即照后90d以内)，中期(照后90d至1年)和长期(照后1年以上)。我们观察的是早期变化。
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2.关于Fos蛋白的表达及其意义
2.1 Fos蛋白表达显示技术的优缺点
c-fos早期原癌基因(c-fos proto oncogene)是存在于细胞内的第三信使，当受到刺激时，大多数细胞的反应是c-fos mRNA和Fos蛋白的早期表达。用原位分子杂交技术显示胞浆内的c-fos mRNA，用免疫组织化学方法显示胞核内的Fos蛋白。c-fos mRNA和Fos蛋白的显示技术作为神经系统的机能形态学方法已被广泛地采用[4，5，6]。当机体受到刺激时，神经系统与此机能相关的多级神经元可能出现阳性表达，而且非常敏感，这是其优点。由于任何刺激均能引起相应神经元的c-fos表达，因此如何保证c-fos表达的特异性是至关重要的[4～6]。我们对实验条件进行了严格控制，尽量减少无关刺激对动物的影响，并设置了对照组，从而保证结果的可靠性。
2.2 γ-刀照射后脑内Fos阳性表达及其意义
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γ-刀照射后除靶区出现Fos阳性细胞外，在全脑某些非靶区部位(例如：皮质、侧脑室周围的白质、海马以及下丘脑、杏仁中央核和延髓)也出现Fos阳性细胞，并显示出与照射剂量和成活时间的相应关系，有关结果另有报告[7]，故不赘述。
我们发现在大剂量(70～100Gy)照射或照后较长时间成活(3个月)后出现3种Fos阳性细胞，即(1)胞核阳性，胞浆阴性；(2)胞核阴性，胞浆阳性；(3)胞核、胞浆均为阳性。我们认为(1)为正常反应细胞，(2)是严重受损细胞，(3)是中间过渡性细胞，并专题作了报告[8]，在此不重复。
我们主要讨论γ-刀照射尾状核头部后延髓内Fos表达及其变化的意义。延髓内脏带(MVZ)是一个位于延髓中尾段，从背内侧，穿经网状结构至腹外侧延髓(VLM)的弧形带状区，呼吸中枢、心血管中枢等均位于MVZ内，MVZ参与应激反应的调节，各种伤害性刺激(胃肠、心血管、躯体、内分泌、免疫刺激)均引起MVZ内神经元的Fos表达，关于MVZ的结构与机能，请参阅Rao和Ju的综述[9]。γ-刀照射脑部，造成靶区脑组织的损伤，细胞变性、凋亡或坏死，因此靶区组织又形成了一个新的伤害性刺激源，通过神经传导或神经体液途径引起应激反应，MVZ内细胞产生不同程度Fos表达。随着照射剂量的增加，靶区组织的损伤也加重，应激反应也随之加强，Fos阳性细胞增多。锥体交叉平面和最后区平面MVZ内Fos阳性胞核密集，向吻侧至闩平面和闩吻侧平面，Fos的表达有所减少，可能与反应部位的位置有关。
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三叉神经脊束核接受经三叉神经半月节内神经元的中央突传入的躯体性感觉信息，痛觉冲动经三叉神经中的无髓和薄髓纤维传至三叉神经尾侧亚核。γ-刀照射脑部引起脑血管扩张和脑水肿，颅压增高而刺激支配脑膜的三叉神经，本实验发现γ-刀照射前部尾壳核后在双侧三叉神经尾侧亚核(以照射侧为主)出现较多的Fos阳性胞核，正说明这一点[10]。
延髓背侧网状核位于延髓尾侧网状结构的背外侧部，介于三叉神经尾侧亚核与MVZ的IRt之间。该核在伤害感受过程中具有鲜明的特性，这些神经元能特异地被全身伤害性刺激(包括内脏伤害性刺激)激活。延髓背侧网状核内神经元，在传递起源于脊髓和三叉系统的伤害性信息过程中起重要作用[11]。γ-刀照射前脑后引起该核内Fos阳性表达的机理不清楚。
三叉神经脊束间核是散在分布于三叉神经脊束纤维之间的神经元群，它接受来自三叉神经和迷走神经的传入，是躯体感觉与内脏感觉的汇聚区[12]，它发出纤维投射至脑干网状结构，臂旁核等结构。
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下橄榄核是一个重要的小脑前核，它接受多种来源的传入纤维，其中有来自三叉神经尾侧亚核的三叉橄榄纤维，它投射至双侧下橄榄核；还接受来自大脑皮质感觉运动区、尾状核、苍白球等下行纤维[10]。本实验在γ-刀照射一侧尾壳核后，双侧下橄榄核内出现Fos阳性胞核，这可能是因为(1)脑血管扩张，脑水肿引起了颅压升高而刺激了三叉神经，三叉神经尾侧亚核有纤维投身至双侧下橄榄核之故；(2)γ-刀照射靶区为尾壳核，而刺激了尾状核投射至下橄榄核之纤维。
总之延髓远离靶区，为何出现Fos阳性细胞，其机理可能很能复杂，上述解释只是一种假说，目前无法定论，有待进一步研究。
本研究获得广东微侵袭神经外科治疗中心董事长周达银高级工程师资助，特此致谢。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970230)
作者简介：铙志仁(1935—)，男，湖南浏阳市人，教授，博士生导师，研究室主任
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收稿日期：1998-10-20
修回日期：1999-04-22, http://www.100md.com