局灶性脑缺血后鼠脑组织tPA基因表达及其与细胞凋亡
作者：潘涌 郑素秋 谢勉 谢元云 林以理 颜光美
单位：潘 涌 郑素秋(中山医科大学药理教研室) 谢 勉 谢元云 林以理(解剖学教研室，广州 510089)；颜光美(中山医科大学药理教研室)
关键词：组织型纤溶酶原激活物；脑缺血；表达；基因
解剖学报000104 摘 要：目的 探讨局灶性脑缺血后组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因的表达及其与细胞凋亡的关系。 方法 用原位杂交和免疫组织化学方法检测tPA基因在大鼠局灶性脑缺血(大脑中动脉阻塞)后的表达，用TUNEL法检测缺血不同时间的细胞凋亡状况。 结果 脑缺血6h缺血中心部位的胶质细胞和梗死灶周边缺血半影区的神经元均观察到tPA免疫反应性信号，在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马区和齿状回可见凋亡细胞，但缺血18h缺血侧神经元及胶质细胞未见tPA免疫反应性信号，仅齿状回有凋亡细胞。 结论 tPA蛋白在脑缺血6h缺血侧表达增高，局灶性脑缺血后神经元死亡有细胞凋亡的参与，该凋亡可能与tPA基因表达和缺血时间有一定关联。
, 百拇医药
分类号：Q344+.13； Q255 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-13
EXPRESSION OF tPA GENE AND CELL APOPTOSIS FOLLOWING
FOCAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RAT
PAN Yong
(Department of Pharmacology)
ZHENG Su-qiu
(Department of Pharmacology)
, 百拇医药
XIE Mian
(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)
XIE Yuan-yun
(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)
LIN Yi-li
(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)
, 百拇医药
YAN Guang-mei
(Department of Pharmacology)
Abstract：Objective To study the expression of tissue plasminogen activator(tPA) gene and the relationship with cell apoptosis following focal cerebral ischemia in rat.Methods The samples of focal cerebral ischemia(middle cerebral artery occlusion,MCA occlusion) were analyzed by using in situ hybridization (ISH) and immunohistochemical(IHC) methods.Apoptotic neurons were detected by using TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results In the rats 6h after MCA occlusion,posititive immunostaining of tPA was detected in endothelial cells of small blood vessels,meninges,chorioid,in the glial cells at the zone of ischemic core and neurons at the infarct border zone,apoptotic cells were observed in parietal and hindlimb cerebral cortex,hippocumpus and dentate gyrus,but in the rats 18h after MCA occlusion,immunoreactivity of tPA was not detected in the neurons and glial cells of the ischemic hemisphere,and apoptotic cells were only found in dentate gyrus.Conclusions Expression of tPA protein in ischemic site 6h after MCA occlusion is higher than that of nonischemic site.Cell apoptosis was involved in neuronal death following focal cerebral ischemia,and the apoptosis might be related with expression of tPA gene and the time after cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words：tPA;Ischemia;Expression;Gene▲
缺血性脑损伤神经元死亡的方式主要有坏死和凋亡两种不同的机制。近年研究表明，细胞凋亡与多种丝氨酸(Ser)蛋白酶及其抑制物有关[1，2]。组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)是一种Ser蛋白酶，能催化无活性的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，使血栓溶解。tPA也是脑内主要的纤溶酶原激活物[3]，它在神经组织的异常表达与神经元退变和某些神经系统疾病有关[4，5]。但tPA通过何种途径引起中枢神经元退化?尚不清楚。国内未见类似报道。鉴于临床可能广泛应用tPA治疗中风患者，我们研究了脑缺血后tPA基因的表达及其是否涉及脑缺血后的神经元死亡，为进一步研究脑缺血后神经元损伤的分子机制及寻求有效的临床防治提供科学依据。
材料和方法
, 百拇医药
1.主要实验仪器及试剂
TTC(Sigma公司，美国)、DIG寡核苷酸尾部标记试剂盒、DIG检测试剂盒和POD原位死亡检测试剂盒(宝灵曼公司，德国)，PAM-tPA单克隆抗体(Diamercan公司，美国)，SP免疫组织化学试剂盒(迈新公司，进口分装，广州)，UVP-GDS 8000凝胶成像系统(英国)。
2.制备鼠局灶性脑缺血模型
采用中山医科大学实验动物中心提供的健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，230～300g，随机分为两组：缺血组和正常对照组。缺血组采用线栓法制备鼠右侧大脑中动脉阻塞模型[6]。先用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)将鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上，经颈正中切口分离暴露右侧颈总动脉，在颈总动脉分叉处插入栓子(直径约为0.15mm的尼龙线)，栓子前端到达颈内动脉及远端，阻断大脑中动脉的血流。术后约1h实验鼠苏醒，出现左前肢屈曲和前进时向左侧划圈，证明右侧大脑中动脉阻塞成功。实验鼠按处死时间又分为6h(n=6)和18h(n=6)。用2%氯化三本四氮唑(TTC)染色以证实脑缺血灶的存在，冰冻切片或蜡片用于原位杂交、免疫组织化学和细胞凋亡检测。
, 百拇医药
3.原位杂交
3.1 探针合成：根据带有tPAcDNA序列的PGEM-1质粒图谱设计tPA探针，其序列为：GAT GCC CTG GCC CTG GAA GCA GGT TGC TCT GGT ATG TAT ACT由上海申工生物公司合成。
3.2 探针标记：按DIG寡核苷酸尾部标记试剂盒指示进行标记。
3.3 ISH(参照文献[7])：将鼠冰冻冠状切片，片厚20μm，预处理后与DIG标记的寡核苷酸探针42℃杂交(50μl杂交液/片，探针浓度300μg/L)12～16h。清洗后在1∶4 000碱性磷酸酶标记的DIG抗体中温育40min，加入NBT和BCIP显色液室温避光染色3h，用PBS缓冲液终止反应，核固红复染。取正常鼠肾冰片作为阳性对照。
4.免疫组织化学SP法[8]
, 百拇医药
蜡片脱蜡和水化后，加50μl过氧化物酶阻断液；PBS冲洗；再加50μl非免疫性动物血清室温孵育20min;PBS冲洗；加PAM-3tPA单抗室温孵育1h;再加生物素结合的二抗，室温孵育30min；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液孵育30min。DAB染色，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用正常羊血清取代第一抗体，其余步骤同上。
5.TUNEL(TdT介导dUTP-X末端标记)染色
按原位死亡检测试剂盒指示进行。蜡片脱水后，经蛋白酶K处理后在TdT(末端脱氧核苷酰转移酶)与荧光素连接的核苷酸混合液37℃孵育45min，PBS冲洗两次，再加HRP连接的抗荧光素抗体，37℃温育60min。DAB显色，核快红复染，封片，镜下分析。阴性对照不加TdT。
结 果
1.形态学观察
, 百拇医药
TTC染色显示正常鼠脑组织着深红色，梗塞灶为苍白色，位于右侧额、顶、颞叶皮层(图1)。TTC染色蜡片显示缺血灶位于大脑皮层后肢体区、顶皮层区和基底节区(图2)。HE染色缺血区许多细胞嗜伊红，细胞核固缩深染，核仁消失，胞浆疏松，染色变浅，细胞水肿，边界不清，有变性和坏死发生。缺血18h皮层变性坏死较6h更为明显。对照组无梗塞灶的出现。
图1 局灶性脑缺血6h,TTC染色显示正常鼠脑组织着深红色(a)，缺血侧为苍白色(b)
Fig.1 In rat brain at 6h after MCA occlusion by TTC saining .normal ischemic site is pink(a),ischemic site is pale(b).
, 百拇医药
图2 TTC染色局灶性脑缺血6h脑片，表明缺血灶位于大脑皮层后肢体区、顶皮层区和基底节区
Fig.2 In coronal section of central nervous system in rats at 6h after MCA occlusion .Ischemic region lies to parietal and hindlimb cerebral cortex,basal ganglia by TTC saining.
2.tPAmRNA的表达
原位杂交除极少数毛细血管呈现紫蓝色阳性信号外，在鼠脑组织均未见阳性信号。鉴于对照肾冰片ISH显示部分阳性信号，本实验用非放射性ISH在脑组织未检测到tPA阳性杂交信号，可能与其表达量太低有关，与Kittaka等[9]的报道类似。
, http://www.100md.com 3.tPA蛋白的分布
免疫反应性细胞呈棕色，清晰可见，背景呈淡灰色。局灶性脑缺血6h脑片在脑膜、脉络膜、小血管内皮均可见tPA免疫反应性细胞，在细胞浆内呈棕色颗粒状，缺血侧中心区的胶质细胞和梗死灶周围的缺血半影区的神经元也显示tPA强免疫反应性信号(图3a,b)，但小脑、海马区未见tPA免疫反应性信号。缺血18h梗塞侧神经元及胶质细胞均未见免疫反应性信号。
图3 局灶性脑缺血6h a.缺血中心部位的胶质细胞显示tPA免疫反应性信号；b.梗死周边区的神经元显示tPA免疫反应性信号 ×200
Fig.3 In coronal paraffin section of central nervous system in rats at 6h afeter MCA occlusion.a,Immunocytochemical demonstration of tPA positive signal in glias of the zone of ischemic core.b,Immunocytochemical demonstration of t PA positive signal in neurons of infarct border zone.×200
, 百拇医药
图4 用TUNEL法检测局灶性脑缺血6h蜡片 a.大脑皮层细胞显示凋亡阳性信号；b.阴性对照片 ×200
Fig.4 Histological features of apotosis in coronal paraffin sections in rats at 6h after MCA occlusion .a,apoptotic cells (arrow)are present among cerebral cells by TUNEL method ,b,negative control.×200
4.TUNEL检测
脑缺血侧缺血6h：在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马和齿状回均可见散在的凋亡细胞(图4a,b)，免疫反应性信号局限在细胞核内，对侧仅见极少数凋亡细胞；缺血18h仅在齿状回有散在的凋亡细胞，正常侧未见凋亡细胞。
, http://www.100md.com
讨 论
tPA是脑内主要的丝氨酸蛋白酶，脑缺血后tPA与神经元死亡的关系已日益引起人们的重视。tPA基因是一种即刻早期基因。在脑组织，惊厥发作、刺激引起癫痫样后放电和短暂高频刺激通道引起长时程增强(LTP)，均可使tPA在全脑和局部增加[10]。Wang等[11]给tPA-/-鼠或野生鼠静注tPA,MCA阻塞后，tPA-/-鼠和野生鼠梗死范围均有不同程度的增加，提示外源性tPA可增加诱导中风样的损伤。Tsirka等[12]用tPA抗体显示tPA存在于小鼠CA2～CA3海马亚区和齿状回的神经元和小胶质细胞，注射海人藻酸(KA)可引起tPA在同侧小胶质细胞表达增强，表明tPA表达具有可诱导性。本实验在大鼠局灶性脑缺血6h的蜡片，发现脑膜、脉络膜、小血管内皮细胞和缺血侧中心区的胶质细胞和梗死灶周围的缺血半影区神经元均显示tPA免疫反应性信号，而缺血18h缺血侧神经元和胶质细胞则未见免疫反应性信号，仅脑膜、脉络膜、小血管内皮细胞有免疫反应性信号，该反应主要出现在胞浆内，与蛋白合成部位相符，证实这些部位有tPA蛋白的存在。tPA蛋白在脑损伤6h左右高表达，它在受损神经细胞中的超量表达具有可诱导性，缺血可诱发tPA蛋白表达，由于tPA是早期反应性基因，出现时间相对较早，故缺血18h则未见tPA蛋白在神经细胞表达。脑缺血6h缺血中心区的胶质细胞和梗死灶周围缺血半影区的神经元均显示tPA强免疫反应性信号，提示该区在MCA缺血损伤中为神经元选择性易损部位，因神经元和胶质细胞可能对缺血的敏感性不同，前者对缺血的耐受性较差，导致缺血中心部位的神经元死亡，故只能观察到胶质细胞，而梗死灶周边缺血半影区缺血程度相对较轻，大部分神经元仍然存活，因而可观察到两种细胞。正常区域神经元和胶质细胞未见免疫反应性信号，可能是tPA蛋白在正常神经细胞中表达量较低。Murtomaki等[5]用IHC法在Weaver鼠小脑粒细胞层、分子层和蒲肯野细胞层均检测到tPA免疫反应性信号，Seed等[13]也在正常和运动后的小鼠小脑检测到tPA蛋白。我们在大鼠小脑组织未检测到tPA蛋白表达，可能与有关文献报道的动物种属不同，该实验现象有待于进一步研究。
, 百拇医药
以往人们一直认为脑缺血后神经元死亡形式是坏死，但近年资料显示，无论是急性局灶性脑缺血，还是短暂性脑缺血后的迟发性神经元死亡(DND)，都有细胞凋亡的参与。大多数情况下，细胞凋亡的发生可被蛋白合成抑制剂所阻抑，说明细胞凋亡受基因调控。大鼠和沙土鼠全脑缺血24h和48h海马和纹状体，大鼠局灶性脑缺血18～24h皮质和纹状体神经元琼脂糖DNA电泳均呈典型梯带[14]。然而，这种方法只能反映所研究组织的DNA平均状态，并不能特异地鉴别凋亡细胞。TUNEL法是识别细胞凋亡的较新方法，该法重复性好，分辨率较高，使用方便。我们用该法检测局灶性脑缺血6h缺血侧，在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马和齿状回均可见散在的凋亡细胞，反映了tPA可能涉及细胞凋亡的发生。而缺血18h，仅在齿状回有凋亡细胞，可能是脑缺血损伤18h，大部分神经细胞已发生坏死。该结果与柯等[15]报道类似，提示细胞凋亡与缺血时间有一定的关联，缺血时间短，较温和的脑损伤以诱发细胞凋亡为主，缺血时间长，剧烈的脑损伤则以细胞坏死为主。本研究在缺血6h正常侧也检测到极少量凋亡细胞，这可能是脑组织发育过程中一种正常的生理性死亡。■
, 百拇医药
基金项目：国家杰出青年基金资助项目(39625022)
作者简介：潘涌(1956—)，女，福建人，医学博士，副教授，硕士生导师
参考文献：
[1]Marthinuss J,Andrade-Gordon P,SeibergM.A secreted serine protease can induced apoptosis in Pam212 keratinocytes[J].Cell Growth Differ,1995,6(7):807-816.
[2]Hara S,Halicka HD,Bruno S,et al.Effect of protease inhibitor on early events of apoptosis[J].Exp Cell Res,1996,223(2):372-384.
, 百拇医药
[3]Sappino AP,Madan R,Huarte J,et al.Extracellualr proteolysis in the adult murine brain[J].J Clin Invest 1993,92(2):679-685.
[4]Tsirka SE,Gualandris A,Amaral DG,et al.Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activatory[J].Nature 1995,377(28):340-343.
[5]Murtomaki S,Trenkner E,Wright JM,et al.Increased proteolytic activity of granule neurons may contribute to neuronal death in the weaver mouse[J].Developmental Biology 1995,168(2):635-648.
, 百拇医药
[6]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.
[7]姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，第1版1996：137～139.
[8]施作溶.链酶亲和素蛋白-生物素酶标免疫组化染色法的初步研究[J].中国免疫学杂志 1986,2(3):169～170.
[9]Kittaka M,Liang W,Ning S,et al.Brain capillary tissue plasminogen activator in a diabetes stroke model[J].Stroke,1996,27(4):712-718.
, 百拇医药
[10]Oian Z,Gilbert ME,Colicos MA,et al.TPA is induced as an imediate-early gene during seizure,kindling and long-term protentiation[J].Nature,1993,361(4):453-457.
[11]Wang YF,Tsirka SE,Strickland S,et al.tPA increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice[J].Nature Medicine,1998,4(2):228-231.
[12]Tsirka SE,Rogove AD,Bugge TH,et al.An extracellular protelytic cascade promotes neuronal degeneration in the mouse hippocampus[J].J Neurosci,1997,17(2):543-552.
, http://www.100md.com
[13]Seed NW,Williams BL,Bickford PC.TPA induction in purkinje neurons after cerebellar motor learning[J].Science,1995,270(2):1992-1994.
[14]Charriaut-marlangue C,Aggoun-Zouaoui D,Represa A,et al.Apoptotic features of selective neuronal death in ischemia,epilepsy and gp120 toxicity[J].Trends Neuosci,1996,19(3):109-114.
[15]柯开富，张树生，杨春水，等.建立大鼠可逆性大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型[J].临床神经病学杂志,1997,10(3):131～133.
收稿日期：1998-12-11
修回日期：1999-05-07, 百拇医药
单位：潘 涌 郑素秋(中山医科大学药理教研室) 谢 勉 谢元云 林以理(解剖学教研室，广州 510089)；颜光美(中山医科大学药理教研室)
关键词：组织型纤溶酶原激活物；脑缺血；表达；基因
解剖学报000104 摘 要：目的 探讨局灶性脑缺血后组织型纤溶酶原激活物(tPA)基因的表达及其与细胞凋亡的关系。 方法 用原位杂交和免疫组织化学方法检测tPA基因在大鼠局灶性脑缺血(大脑中动脉阻塞)后的表达，用TUNEL法检测缺血不同时间的细胞凋亡状况。 结果 脑缺血6h缺血中心部位的胶质细胞和梗死灶周边缺血半影区的神经元均观察到tPA免疫反应性信号，在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马区和齿状回可见凋亡细胞，但缺血18h缺血侧神经元及胶质细胞未见tPA免疫反应性信号，仅齿状回有凋亡细胞。 结论 tPA蛋白在脑缺血6h缺血侧表达增高，局灶性脑缺血后神经元死亡有细胞凋亡的参与，该凋亡可能与tPA基因表达和缺血时间有一定关联。
, 百拇医药
分类号：Q344+.13； Q255 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-13
EXPRESSION OF tPA GENE AND CELL APOPTOSIS FOLLOWING
FOCAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RAT
PAN Yong
(Department of Pharmacology)
ZHENG Su-qiu
(Department of Pharmacology)
, 百拇医药
XIE Mian
(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)
XIE Yuan-yun
(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)
LIN Yi-li
(Department of Anatomy,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089;China)
, 百拇医药
YAN Guang-mei
(Department of Pharmacology)
Abstract：Objective To study the expression of tissue plasminogen activator(tPA) gene and the relationship with cell apoptosis following focal cerebral ischemia in rat.Methods The samples of focal cerebral ischemia(middle cerebral artery occlusion,MCA occlusion) were analyzed by using in situ hybridization (ISH) and immunohistochemical(IHC) methods.Apoptotic neurons were detected by using TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results In the rats 6h after MCA occlusion,posititive immunostaining of tPA was detected in endothelial cells of small blood vessels,meninges,chorioid,in the glial cells at the zone of ischemic core and neurons at the infarct border zone,apoptotic cells were observed in parietal and hindlimb cerebral cortex,hippocumpus and dentate gyrus,but in the rats 18h after MCA occlusion,immunoreactivity of tPA was not detected in the neurons and glial cells of the ischemic hemisphere,and apoptotic cells were only found in dentate gyrus.Conclusions Expression of tPA protein in ischemic site 6h after MCA occlusion is higher than that of nonischemic site.Cell apoptosis was involved in neuronal death following focal cerebral ischemia,and the apoptosis might be related with expression of tPA gene and the time after cerebral ischemia.
, 百拇医药
Key words：tPA;Ischemia;Expression;Gene▲
缺血性脑损伤神经元死亡的方式主要有坏死和凋亡两种不同的机制。近年研究表明，细胞凋亡与多种丝氨酸(Ser)蛋白酶及其抑制物有关[1，2]。组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)是一种Ser蛋白酶，能催化无活性的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，使血栓溶解。tPA也是脑内主要的纤溶酶原激活物[3]，它在神经组织的异常表达与神经元退变和某些神经系统疾病有关[4，5]。但tPA通过何种途径引起中枢神经元退化?尚不清楚。国内未见类似报道。鉴于临床可能广泛应用tPA治疗中风患者，我们研究了脑缺血后tPA基因的表达及其是否涉及脑缺血后的神经元死亡，为进一步研究脑缺血后神经元损伤的分子机制及寻求有效的临床防治提供科学依据。
材料和方法
, 百拇医药
1.主要实验仪器及试剂
TTC(Sigma公司，美国)、DIG寡核苷酸尾部标记试剂盒、DIG检测试剂盒和POD原位死亡检测试剂盒(宝灵曼公司，德国)，PAM-tPA单克隆抗体(Diamercan公司，美国)，SP免疫组织化学试剂盒(迈新公司，进口分装，广州)，UVP-GDS 8000凝胶成像系统(英国)。
2.制备鼠局灶性脑缺血模型
采用中山医科大学实验动物中心提供的健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，230～300g，随机分为两组：缺血组和正常对照组。缺血组采用线栓法制备鼠右侧大脑中动脉阻塞模型[6]。先用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)将鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上，经颈正中切口分离暴露右侧颈总动脉，在颈总动脉分叉处插入栓子(直径约为0.15mm的尼龙线)，栓子前端到达颈内动脉及远端，阻断大脑中动脉的血流。术后约1h实验鼠苏醒，出现左前肢屈曲和前进时向左侧划圈，证明右侧大脑中动脉阻塞成功。实验鼠按处死时间又分为6h(n=6)和18h(n=6)。用2%氯化三本四氮唑(TTC)染色以证实脑缺血灶的存在，冰冻切片或蜡片用于原位杂交、免疫组织化学和细胞凋亡检测。
, 百拇医药
3.原位杂交
3.1 探针合成：根据带有tPAcDNA序列的PGEM-1质粒图谱设计tPA探针，其序列为：GAT GCC CTG GCC CTG GAA GCA GGT TGC TCT GGT ATG TAT ACT由上海申工生物公司合成。
3.2 探针标记：按DIG寡核苷酸尾部标记试剂盒指示进行标记。
3.3 ISH(参照文献[7])：将鼠冰冻冠状切片，片厚20μm，预处理后与DIG标记的寡核苷酸探针42℃杂交(50μl杂交液/片，探针浓度300μg/L)12～16h。清洗后在1∶4 000碱性磷酸酶标记的DIG抗体中温育40min，加入NBT和BCIP显色液室温避光染色3h，用PBS缓冲液终止反应，核固红复染。取正常鼠肾冰片作为阳性对照。
4.免疫组织化学SP法[8]
, 百拇医药
蜡片脱蜡和水化后，加50μl过氧化物酶阻断液；PBS冲洗；再加50μl非免疫性动物血清室温孵育20min;PBS冲洗；加PAM-3tPA单抗室温孵育1h;再加生物素结合的二抗，室温孵育30min；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液孵育30min。DAB染色，自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用正常羊血清取代第一抗体，其余步骤同上。
5.TUNEL(TdT介导dUTP-X末端标记)染色
按原位死亡检测试剂盒指示进行。蜡片脱水后，经蛋白酶K处理后在TdT(末端脱氧核苷酰转移酶)与荧光素连接的核苷酸混合液37℃孵育45min，PBS冲洗两次，再加HRP连接的抗荧光素抗体，37℃温育60min。DAB显色，核快红复染，封片，镜下分析。阴性对照不加TdT。
结 果
1.形态学观察
, 百拇医药
TTC染色显示正常鼠脑组织着深红色，梗塞灶为苍白色，位于右侧额、顶、颞叶皮层(图1)。TTC染色蜡片显示缺血灶位于大脑皮层后肢体区、顶皮层区和基底节区(图2)。HE染色缺血区许多细胞嗜伊红，细胞核固缩深染，核仁消失，胞浆疏松，染色变浅，细胞水肿，边界不清，有变性和坏死发生。缺血18h皮层变性坏死较6h更为明显。对照组无梗塞灶的出现。
图1 局灶性脑缺血6h,TTC染色显示正常鼠脑组织着深红色(a)，缺血侧为苍白色(b)
Fig.1 In rat brain at 6h after MCA occlusion by TTC saining .normal ischemic site is pink(a),ischemic site is pale(b).
, 百拇医药
图2 TTC染色局灶性脑缺血6h脑片，表明缺血灶位于大脑皮层后肢体区、顶皮层区和基底节区
Fig.2 In coronal section of central nervous system in rats at 6h after MCA occlusion .Ischemic region lies to parietal and hindlimb cerebral cortex,basal ganglia by TTC saining.
2.tPAmRNA的表达
原位杂交除极少数毛细血管呈现紫蓝色阳性信号外，在鼠脑组织均未见阳性信号。鉴于对照肾冰片ISH显示部分阳性信号，本实验用非放射性ISH在脑组织未检测到tPA阳性杂交信号，可能与其表达量太低有关，与Kittaka等[9]的报道类似。
, http://www.100md.com 3.tPA蛋白的分布
免疫反应性细胞呈棕色，清晰可见，背景呈淡灰色。局灶性脑缺血6h脑片在脑膜、脉络膜、小血管内皮均可见tPA免疫反应性细胞，在细胞浆内呈棕色颗粒状，缺血侧中心区的胶质细胞和梗死灶周围的缺血半影区的神经元也显示tPA强免疫反应性信号(图3a,b)，但小脑、海马区未见tPA免疫反应性信号。缺血18h梗塞侧神经元及胶质细胞均未见免疫反应性信号。
图3 局灶性脑缺血6h a.缺血中心部位的胶质细胞显示tPA免疫反应性信号；b.梗死周边区的神经元显示tPA免疫反应性信号 ×200
Fig.3 In coronal paraffin section of central nervous system in rats at 6h afeter MCA occlusion.a,Immunocytochemical demonstration of tPA positive signal in glias of the zone of ischemic core.b,Immunocytochemical demonstration of t PA positive signal in neurons of infarct border zone.×200
, 百拇医药
图4 用TUNEL法检测局灶性脑缺血6h蜡片 a.大脑皮层细胞显示凋亡阳性信号；b.阴性对照片 ×200
Fig.4 Histological features of apotosis in coronal paraffin sections in rats at 6h after MCA occlusion .a,apoptotic cells (arrow)are present among cerebral cells by TUNEL method ,b,negative control.×200
4.TUNEL检测
脑缺血侧缺血6h：在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马和齿状回均可见散在的凋亡细胞(图4a,b)，免疫反应性信号局限在细胞核内，对侧仅见极少数凋亡细胞；缺血18h仅在齿状回有散在的凋亡细胞，正常侧未见凋亡细胞。
, http://www.100md.com
讨 论
tPA是脑内主要的丝氨酸蛋白酶，脑缺血后tPA与神经元死亡的关系已日益引起人们的重视。tPA基因是一种即刻早期基因。在脑组织，惊厥发作、刺激引起癫痫样后放电和短暂高频刺激通道引起长时程增强(LTP)，均可使tPA在全脑和局部增加[10]。Wang等[11]给tPA-/-鼠或野生鼠静注tPA,MCA阻塞后，tPA-/-鼠和野生鼠梗死范围均有不同程度的增加，提示外源性tPA可增加诱导中风样的损伤。Tsirka等[12]用tPA抗体显示tPA存在于小鼠CA2～CA3海马亚区和齿状回的神经元和小胶质细胞，注射海人藻酸(KA)可引起tPA在同侧小胶质细胞表达增强，表明tPA表达具有可诱导性。本实验在大鼠局灶性脑缺血6h的蜡片，发现脑膜、脉络膜、小血管内皮细胞和缺血侧中心区的胶质细胞和梗死灶周围的缺血半影区神经元均显示tPA免疫反应性信号，而缺血18h缺血侧神经元和胶质细胞则未见免疫反应性信号，仅脑膜、脉络膜、小血管内皮细胞有免疫反应性信号，该反应主要出现在胞浆内，与蛋白合成部位相符，证实这些部位有tPA蛋白的存在。tPA蛋白在脑损伤6h左右高表达，它在受损神经细胞中的超量表达具有可诱导性，缺血可诱发tPA蛋白表达，由于tPA是早期反应性基因，出现时间相对较早，故缺血18h则未见tPA蛋白在神经细胞表达。脑缺血6h缺血中心区的胶质细胞和梗死灶周围缺血半影区的神经元均显示tPA强免疫反应性信号，提示该区在MCA缺血损伤中为神经元选择性易损部位，因神经元和胶质细胞可能对缺血的敏感性不同，前者对缺血的耐受性较差，导致缺血中心部位的神经元死亡，故只能观察到胶质细胞，而梗死灶周边缺血半影区缺血程度相对较轻，大部分神经元仍然存活，因而可观察到两种细胞。正常区域神经元和胶质细胞未见免疫反应性信号，可能是tPA蛋白在正常神经细胞中表达量较低。Murtomaki等[5]用IHC法在Weaver鼠小脑粒细胞层、分子层和蒲肯野细胞层均检测到tPA免疫反应性信号，Seed等[13]也在正常和运动后的小鼠小脑检测到tPA蛋白。我们在大鼠小脑组织未检测到tPA蛋白表达，可能与有关文献报道的动物种属不同，该实验现象有待于进一步研究。
, 百拇医药
以往人们一直认为脑缺血后神经元死亡形式是坏死，但近年资料显示，无论是急性局灶性脑缺血，还是短暂性脑缺血后的迟发性神经元死亡(DND)，都有细胞凋亡的参与。大多数情况下，细胞凋亡的发生可被蛋白合成抑制剂所阻抑，说明细胞凋亡受基因调控。大鼠和沙土鼠全脑缺血24h和48h海马和纹状体，大鼠局灶性脑缺血18～24h皮质和纹状体神经元琼脂糖DNA电泳均呈典型梯带[14]。然而，这种方法只能反映所研究组织的DNA平均状态，并不能特异地鉴别凋亡细胞。TUNEL法是识别细胞凋亡的较新方法，该法重复性好，分辨率较高，使用方便。我们用该法检测局灶性脑缺血6h缺血侧，在大脑皮层后肢体区、顶皮层区、海马和齿状回均可见散在的凋亡细胞，反映了tPA可能涉及细胞凋亡的发生。而缺血18h，仅在齿状回有凋亡细胞，可能是脑缺血损伤18h，大部分神经细胞已发生坏死。该结果与柯等[15]报道类似，提示细胞凋亡与缺血时间有一定的关联，缺血时间短，较温和的脑损伤以诱发细胞凋亡为主，缺血时间长，剧烈的脑损伤则以细胞坏死为主。本研究在缺血6h正常侧也检测到极少量凋亡细胞，这可能是脑组织发育过程中一种正常的生理性死亡。■
, 百拇医药
基金项目：国家杰出青年基金资助项目(39625022)
作者简介：潘涌(1956—)，女，福建人，医学博士，副教授，硕士生导师
参考文献：
[1]Marthinuss J,Andrade-Gordon P,SeibergM.A secreted serine protease can induced apoptosis in Pam212 keratinocytes[J].Cell Growth Differ,1995,6(7):807-816.
[2]Hara S,Halicka HD,Bruno S,et al.Effect of protease inhibitor on early events of apoptosis[J].Exp Cell Res,1996,223(2):372-384.
, 百拇医药
[3]Sappino AP,Madan R,Huarte J,et al.Extracellualr proteolysis in the adult murine brain[J].J Clin Invest 1993,92(2):679-685.
[4]Tsirka SE,Gualandris A,Amaral DG,et al.Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activatory[J].Nature 1995,377(28):340-343.
[5]Murtomaki S,Trenkner E,Wright JM,et al.Increased proteolytic activity of granule neurons may contribute to neuronal death in the weaver mouse[J].Developmental Biology 1995,168(2):635-648.
, 百拇医药
[6]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.
[7]姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，第1版1996：137～139.
[8]施作溶.链酶亲和素蛋白-生物素酶标免疫组化染色法的初步研究[J].中国免疫学杂志 1986,2(3):169～170.
[9]Kittaka M,Liang W,Ning S,et al.Brain capillary tissue plasminogen activator in a diabetes stroke model[J].Stroke,1996,27(4):712-718.
, 百拇医药
[10]Oian Z,Gilbert ME,Colicos MA,et al.TPA is induced as an imediate-early gene during seizure,kindling and long-term protentiation[J].Nature,1993,361(4):453-457.
[11]Wang YF,Tsirka SE,Strickland S,et al.tPA increases neuronal damage after focal cerebral ischemia in wild-type and tPA-deficient mice[J].Nature Medicine,1998,4(2):228-231.
[12]Tsirka SE,Rogove AD,Bugge TH,et al.An extracellular protelytic cascade promotes neuronal degeneration in the mouse hippocampus[J].J Neurosci,1997,17(2):543-552.
, http://www.100md.com
[13]Seed NW,Williams BL,Bickford PC.TPA induction in purkinje neurons after cerebellar motor learning[J].Science,1995,270(2):1992-1994.
[14]Charriaut-marlangue C,Aggoun-Zouaoui D,Represa A,et al.Apoptotic features of selective neuronal death in ischemia,epilepsy and gp120 toxicity[J].Trends Neuosci,1996,19(3):109-114.
[15]柯开富，张树生，杨春水，等.建立大鼠可逆性大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血模型[J].临床神经病学杂志,1997,10(3):131～133.
收稿日期：1998-12-11
修回日期：1999-05-07, 百拇医药