突触数密度Disector测量法的建立与计算机辅助分析的实现
作者：张琳 买鸿宴 黄浩 刘贺飞 南燕 尚俊杰 廖洪恩 于恩华 沈丽
单位：张 琳 买鸿宴(北京医科大学解剖学系，北京 100083)；黄 浩 刘贺飞(北京大学力与工程科学系，北京 100871)；南 燕(北京医科大学解剖学系，北京 100083)；尚俊杰(北京大学力与工程科学系，北京 100871)；廖洪恩(北京大学力与工程科学系，北京 100871)；于恩华 沈 丽(北京医科大学解剖学系，北京 100083)
关键词：突触；数密度；体视学；Disector技术；计算机软件
解剖学报000103 摘 要：目的 建立基于Disector技术的突触数密度定量研究方法；利用Visual Basic语言实现计算机辅助的突触数密度定量分析。 方法 应用连续超薄切片技术和透射电镜技术观察并记录位于同一纵轴上的神经毡，选取已知距离的相邻平行电镜照片构成Physical Disector,依据Disector原理计算突触的数密度；以Visual Basic4.0为开发工具，在Windows95平台上开发基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统(Disector Countor 1.0)。 结果 比较手工计数与计算机辅助分析的结果表明两者无显著性差异(P>0.05)。 结论 我们开发的基于Disector技术的突触的数密度计算机辅助分析系统——Disector Countor 1.0，具备客观、高效等优点，是突触数目定量分析的发展方向。
, http://www.100md.com
分类号：R322.85 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-8
THE SYNAPTIC NUMERICAL DENSITY COUNTING BASED ON
DISECTOR TECHNIQUE AND ITS COMPUTER-AIDED ANALYSIS
ZHANG Lin
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
MAI Hong-yan
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
, 百拇医药
HUANG Hao
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
LIU He-fei
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
NAN Yan
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
SHANG Jun-jie
, http://www.100md.com
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
LIAO Hong-en
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
YU En-hua
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
SHEN Li
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
, 百拇医药
Abstract：Objective We developed a quantitative method based on the Disector technique to count the synaptic numerical density and implemented the computer-aided analysis on it with the Visual Basic.Methods The neuropils on the same vertical axes were observed and recorded with the serial ultrathin section technique as well as transmission electron microscopy.The adjacent parallel electron micrographs of known distance apart were selected to make up the Physical Disector,and the synaptic numerical density was counted according to the Disector principle.The computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique(DisectorCountor 1.0) was developed on the Windows95 system with the Visual Basic 4.0.Results There was no significant statistical difference (P>0.05) between the result by hand and that with Disector Countor 1.0.Conclusion With the advantage of being highly objective and efficient,the computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique,Disector Countor 1.0,would be the developmental direction for synaptic numerical density analysis.
, http://www.100md.com
Key words：Synapse;Numerical density;Stereology;Disector technique;Computer software▲
突触的数目在神经系统的发育与衰老、损伤与修复、可塑性与学习记忆等生理病理过程中具有明显变化，准确计数神经组织中突触的数目是神经生物学研究方法亟待解决的难题[1，2]。体视学技术是应用数学方法对固体组织的剖面进行空间解释和估算的方法。Disector技术是一种利用若干组相邻平行二维剖面计数三维空间中任意形状粒子数目的体视学方法，具有计数效率高、无偏差等优点，是80年代以来空间粒子计数技术领域的重大突破[3，4]。计算机辅助生物图像分析技术是在生物学、计算数学和计算机数值分析技术等学科基础上形成的交叉学科，已广泛应用于生物图像的定量分析[5，6]。我们利用本文探讨应用Disector技术测量突触数密度的可行性和具体步骤，以及基于该技术的突触数密度计算机辅助分析的原理和过程。
, http://www.100md.com
材料和方法
1.突触数密度Disector测量法的建立
1.1 组织包埋块的制备：30d龄Wistar大鼠3只。复合麻醉剂腹腔麻醉，左心室插管，37℃生理盐水50ml快速冲洗，4℃含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH 7.4)250ml灌注，持续30min。开颅取脑。4℃含3%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH7.4)后固定4h。0.18mol/L蔗糖冲洗液(4℃)冲洗3次，4℃冰箱过夜。次日，振动切片机额状切片，片厚50μm。每只动物从海马完整的厚片中随机抽取5～10片。1%锇酸固定1h(4℃)。618环氧树脂平板包埋。
1.2 连续超薄切片的制备：每只动物从平板包埋的厚片中随机抽取1片，解剖显微镜下取CA1区，切取半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，依据半薄切片定位修块。超薄切片机连续超薄切片，每1厚片选取2～3条由6～10片连续超薄切片构成的切片带，裱于独眼铜网。醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。
, 百拇医药
1.3 电镜摄片的方法：每只动物从切片带中随机选取1条，TM100X-Ⅱ透射电镜下观察摄片。选取切片带的第1张切片，1 400倍下，寻找锥体细胞的胞体的位置，确定海马辐射层的位置和范围，在该范围内随机选取1个仅由1个内皮细胞构成的毛细血管。在该毛细血管周围随机选取神经毡，7 200倍下摄片。选取第2张切片，1 400倍下，寻找定位的毛细血管，并以此确定与上一拍摄视野在同一纵轴上的视野(即相邻视野)，7 200倍下摄片。同样方法依次观察并拍摄剩余切片，每条切片带摄片5～9张。
1.4 Disector法与突触数密度的测量：Disector是由两个间距为h的平行平面构成的三维测试系统，其中1个平面称为计数平面(reference plane)，上覆Gundersen测试系统，用于确定测试范围和计数待测粒子的截面数；另一平面称为核查平面(look-up plane)用于核查两个平面间待测粒子截面数的差别[4，7，8]。其中粒子截面数的计数应遵循Gundersen法则：(1)落在测试系统内的粒子为有效粒子；(2)仅与包容线(即图1中覆盖在计数切片上测试框的虚线)相交的粒子为有效粒子；(3)凡与排斥线(即图1中覆盖在计数切片上测试框的实线)相交，无论是否与包容线相交均为无效粒子[9]。在测量突触数目时，利用相邻两张电镜切片代替Disector的两个平行平面，分别称为计数切片和核查切片，即Physical disector技术(如图1)。若切片厚度为t,则h=t。
, http://www.100md.com
图1 Physical Disector的模式图
Fig.1 The illustration of the Physical Disector
超薄切片的照片光学放大3倍，依次抽取相邻的两张，选定测试框的面积为7.23×106nm2。首先在两张照片上描出较粗大轴突的轮廓，作为定位标记。然后在计数切片(两张切片中的任何1张)中计数突触的截面数，突触计数标准为：(1)在突触前成分中存在3个以上突触小泡；(2)在突触后成分中可辨认出突触后致密物[10]。最后在核查切片中计数同时出现在计数切片和核查切片上的突触的截面数；两者之差为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-，也就是相应计数空间(测试面的面积A乘以两测试面的间距t)内突触的数目(详细数学推导参见参考文献[7])，因此：
(*)
, 百拇医药
其中：Nv:突触的数密度；Q-：为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数；t:超薄切片的厚度；A：测试面的面积。
1.5 微皱折法与超薄切片厚度的测量：超薄切片在捞片时可形成两种皱折，一种是宽窄不定的大皱折，另一种是宽度恰好为切片厚度2倍的微皱折(small fold)[11](图2)。微皱折在电镜下具有以下特征：皱折为两条紧密相贴的黑线；两黑线间有时可见1条极细、不连续的致密黑线(图3)系由染液渗入皱折间的缝隙中所形成；皱折的末端常可见分岔(图4)。48 000倍下，拍摄若干微皱折，测量它们的宽度，计算超薄切片的厚度为：42±5nm。
图2 微皱折的模式图 A微皱折；B大皱折
Fig.2 The illustration of the small fold
, http://www.100md.com
A shows a small fold and B shows a large fold
图3 典型的微皱折 ×4 800
Fig.3 The typical small fold ×4 800
图4 微皱折的末端 ×4 800
Fig.4 The terminal of the small fold ×4 800
2.计算机辅助分析的实现
2.1 系统硬件构成：系统硬件由主机、扫描仪和打印机3部分构成。主机：主频200MHz、内存32M、硬盘6.4G；扫描仪：ScanMakerⅡSP(MICROTEK公司产品)；打印机：6P激光打印机(HP公司产品)。
, 百拇医药
2.2 开发平台与工具：系统开发的操作系统采用Windows 95(MICROSOFT公司产品)[12]、开发工具采用Visual Basic 4.0(MICROSOFT公司产品)[13]。
2.3 主要功能模块介绍：(1)切片预览模块：该模块可同时打开1组电镜连续切片的照片，依次排列在屏幕上，使操作者可在定量分析切片前预览该组切片。同时，在分析过程中可随时调用该模块，使操作者可从整体上观察该组切片，以利对复杂结构全面分析；(2)测试框添加模块：该模块可在电镜切片的照片上添加预设面积的Gundersen无偏差测试框，并以TIF格式存盘，以备调用；(3)Disector计数模块：该模块可并行打开2张相邻电镜切片的照片，具备同步放大、缩小以及利用水平和垂直滑块同步移动的功能(如图5)，以便使用者对比观察两张相邻切片。使用者利用鼠标首先在计数切片的图片框内点击标记突触结构，同时观察核查切片中该突触是否出现，如果出现也利用鼠标点击标记，该模块可自动根据标记次数计算计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-。如果使用者标记突触时出错，可利用撤消命令取消标记；(4)数据计算分析模块：超薄切片的厚度和测试面的面积利用对话框输入后。该模块可根据公式(*)计算每组电镜切片中突触的数密度，并可计算全部电镜切片的突触数密度的均值和标准差(
±s)。
, 百拇医药
图5 Disector Countor 1.0的界面图
Fig.5 The interface of Disector Countor 1.0
3.手工计数与计算机辅助分析结果的比较
将手工计数的结果与计算机辅助分析的结果利用SPSS软件进行t检验。
结 果
生后30d大鼠海马CA1区辐射层，突触的数密度手工计算结果为：2.31±0.22×10-8个/nm3；计算机分析结果为：2.29±0.18×10-8个/nm3。经t检验两者无显著差异(P>0.05)。
讨 论
, 百拇医药
1.Disector作为一种三维探针可实现对神经组织中突触数密度的无偏差测量
以往测量突触数密度的方法往往采用模型展开技术(model-based unfolding techniques)，即基于一定假设或模型建立由二维切片突触剖面数推算空间突触数密度的体视学公式[14]。此类方法多基于突触接触区为圆盘形且在神经组织中均匀分布等假设，但研究表明：相当比例的突触具有复杂的三维结构并不满足圆盘模型。因此，基于模型展开技术的经典体视学测量法存在明显的原理缺陷，其测量结果具有无法预测的测量偏差[1，3，14]。我们采用的Disector技术体现了80年代以来新兴的设计技术(design-based techniques)的体视学思路，即不是基于任何假设或模型而是采用两张相邻二维切片作为三维探针，相当于直接计数三维空间中突触数目，与突触的形状、大小和空间分布无关，可实现真正意义上的突触数目的无偏差测量[4，8]。
, 百拇医药
2.计算机辅助分析具备客观、高效等优点，是突触数目定量分析的发展方向
我们研制的基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统(Disector Countor1.0)是在Windows95平台上，利用Visual Basic4.0开发研制的。Windows95为用户直观的图形操作环境和用户界面，人机交互方便、利于掌握和使用[12]。Visual Basic 4.0运用可视化设计工具，具备复杂的界面处理动作和事件驱动的编程机制[13]。因此，Disector Countor 1.0获得了开发平台和开发工具赋予的良好的人机界面和图像处理功能，具备客观、高效等优点，是突触数目定量分析发展的方向。同时，整个研究过程中电镜图像全部以数字化图像保存(* JPG格式)，便于存储和利用，既省去了洗印相片等烦琐的暗室工作，又保证了分析过程中放大倍数的可靠性和一致性。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470309)；卫生部科研基金资助项目(98-1-263)
, 百拇医药
作者简介：张琳(1971—)，男，湖南长沙人，医学学士，助教
参考文献：
[1]Coggeshall RE,Lekan HA.Methods for determining the numbers of cells and synapses:a case for more uniform standards of review[J].J Comp Neurol,1996,364(1):6-15.
[2]Coggeshall RE.A consideration of neural counting methods[J].TINS,1994,15(1):9-13.
[3]Mayhew TM.A review of recent advances in stereology for quantifying neural structure[J].J Neurocoytol,1992,21(5):313-328.
, http://www.100md.com
[4]沈丽,张琳,南燕.体视学在突触超微结构定量研究中的应用[J].中国体视学与图像分析杂志,1998,3(1):37～41.
[5]Buravkov SV.Simple PC-based system for morphometric analysis of synapse[J].J Neurosci Methods,1995,61(1):1-4.
[6]Dahlhaus R,Eichler M,Sandkuhler J.Identification of synaptic connections in neural ensembles by graphical models[J].J Neurosci Methods,1997,77(1):93-107.
[7]Sterio DC.The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector[J].J Microsc,1984,134(2):127-136.
, 百拇医药
[8]张琳,买鸿宴,南燕,等.Disector法测量突触的数密度[J].神经解剖学杂志,1998,14(4):411～414.
[9]Gundersen HJG.Notes on estimation of the numerical density of arbitrary profiles:the edge effect[J].J Microsc,1977;111(2):219-223.
[10]Jones DG,Calverley RKS.Frequency of occurrence of perforated synapses in develping rat neocortex[J].Neurosc Letter,1991,129(3):189-192.
[11]Small JV.Measurement of section thickness.In:Bocciarelli DS.Proceeding of the Forth European Congress on Electronic Microscopy[M].Vol 1.Roma:Tipografia poliglotta vaticana,1968:609-610.
, 百拇医药
[12]Simpson A.Windows 95 UNCUT[M].California:IDG Books Worldwide Inc,1995:1-129.
[13]Rahmel D,Rahmel R.Developing Client/Server Application with Visual Basic 4.0[J].Washington:SAMS Publishing,1995:1-170.
[14]Mayhew TM,Gundersen HJG.If you assume,you can make an ass out of u and me:a decade of the disector for stereological counting of particles in 3D space[J].J Anat,1996,183(1):1
[15]Jastrow H,Mach MA,Vollrath L.The shape of synaptic ribbons in the rat pineal gland[J].Cell Tissue Res,1997,287(3):255-261.
收稿日期：1998-11-06
修回日期：1999-03-26, http://www.100md.com
单位：张 琳 买鸿宴(北京医科大学解剖学系，北京 100083)；黄 浩 刘贺飞(北京大学力与工程科学系，北京 100871)；南 燕(北京医科大学解剖学系，北京 100083)；尚俊杰(北京大学力与工程科学系，北京 100871)；廖洪恩(北京大学力与工程科学系，北京 100871)；于恩华 沈 丽(北京医科大学解剖学系，北京 100083)
关键词：突触；数密度；体视学；Disector技术；计算机软件
解剖学报000103 摘 要：目的 建立基于Disector技术的突触数密度定量研究方法；利用Visual Basic语言实现计算机辅助的突触数密度定量分析。 方法 应用连续超薄切片技术和透射电镜技术观察并记录位于同一纵轴上的神经毡，选取已知距离的相邻平行电镜照片构成Physical Disector,依据Disector原理计算突触的数密度；以Visual Basic4.0为开发工具，在Windows95平台上开发基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统(Disector Countor 1.0)。 结果 比较手工计数与计算机辅助分析的结果表明两者无显著性差异(P>0.05)。 结论 我们开发的基于Disector技术的突触的数密度计算机辅助分析系统——Disector Countor 1.0，具备客观、高效等优点，是突触数目定量分析的发展方向。
, http://www.100md.com
分类号：R322.85 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-8
THE SYNAPTIC NUMERICAL DENSITY COUNTING BASED ON
DISECTOR TECHNIQUE AND ITS COMPUTER-AIDED ANALYSIS
ZHANG Lin
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
MAI Hong-yan
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
, 百拇医药
HUANG Hao
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
LIU He-fei
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
NAN Yan
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
SHANG Jun-jie
, http://www.100md.com
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
LIAO Hong-en
(Department of Mechanics and Engineering Science,Peking University,Beijing 100871,China)
YU En-hua
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
SHEN Li
(Department of Anatomy,Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
, 百拇医药
Abstract：Objective We developed a quantitative method based on the Disector technique to count the synaptic numerical density and implemented the computer-aided analysis on it with the Visual Basic.Methods The neuropils on the same vertical axes were observed and recorded with the serial ultrathin section technique as well as transmission electron microscopy.The adjacent parallel electron micrographs of known distance apart were selected to make up the Physical Disector,and the synaptic numerical density was counted according to the Disector principle.The computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique(DisectorCountor 1.0) was developed on the Windows95 system with the Visual Basic 4.0.Results There was no significant statistical difference (P>0.05) between the result by hand and that with Disector Countor 1.0.Conclusion With the advantage of being highly objective and efficient,the computer-aided analysis system for synaptic numerical density based on the Disector technique,Disector Countor 1.0,would be the developmental direction for synaptic numerical density analysis.
, http://www.100md.com
Key words：Synapse;Numerical density;Stereology;Disector technique;Computer software▲
突触的数目在神经系统的发育与衰老、损伤与修复、可塑性与学习记忆等生理病理过程中具有明显变化，准确计数神经组织中突触的数目是神经生物学研究方法亟待解决的难题[1，2]。体视学技术是应用数学方法对固体组织的剖面进行空间解释和估算的方法。Disector技术是一种利用若干组相邻平行二维剖面计数三维空间中任意形状粒子数目的体视学方法，具有计数效率高、无偏差等优点，是80年代以来空间粒子计数技术领域的重大突破[3，4]。计算机辅助生物图像分析技术是在生物学、计算数学和计算机数值分析技术等学科基础上形成的交叉学科，已广泛应用于生物图像的定量分析[5，6]。我们利用本文探讨应用Disector技术测量突触数密度的可行性和具体步骤，以及基于该技术的突触数密度计算机辅助分析的原理和过程。
, http://www.100md.com
材料和方法
1.突触数密度Disector测量法的建立
1.1 组织包埋块的制备：30d龄Wistar大鼠3只。复合麻醉剂腹腔麻醉，左心室插管，37℃生理盐水50ml快速冲洗，4℃含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH 7.4)250ml灌注，持续30min。开颅取脑。4℃含3%戊二醛的0.1mol/L PBS(pH7.4)后固定4h。0.18mol/L蔗糖冲洗液(4℃)冲洗3次，4℃冰箱过夜。次日，振动切片机额状切片，片厚50μm。每只动物从海马完整的厚片中随机抽取5～10片。1%锇酸固定1h(4℃)。618环氧树脂平板包埋。
1.2 连续超薄切片的制备：每只动物从平板包埋的厚片中随机抽取1片，解剖显微镜下取CA1区，切取半薄切片，1%甲苯胺蓝染色，依据半薄切片定位修块。超薄切片机连续超薄切片，每1厚片选取2～3条由6～10片连续超薄切片构成的切片带，裱于独眼铜网。醋酸铀-枸橼酸铅双重染色。
, 百拇医药
1.3 电镜摄片的方法：每只动物从切片带中随机选取1条，TM100X-Ⅱ透射电镜下观察摄片。选取切片带的第1张切片，1 400倍下，寻找锥体细胞的胞体的位置，确定海马辐射层的位置和范围，在该范围内随机选取1个仅由1个内皮细胞构成的毛细血管。在该毛细血管周围随机选取神经毡，7 200倍下摄片。选取第2张切片，1 400倍下，寻找定位的毛细血管，并以此确定与上一拍摄视野在同一纵轴上的视野(即相邻视野)，7 200倍下摄片。同样方法依次观察并拍摄剩余切片，每条切片带摄片5～9张。
1.4 Disector法与突触数密度的测量：Disector是由两个间距为h的平行平面构成的三维测试系统，其中1个平面称为计数平面(reference plane)，上覆Gundersen测试系统，用于确定测试范围和计数待测粒子的截面数；另一平面称为核查平面(look-up plane)用于核查两个平面间待测粒子截面数的差别[4，7，8]。其中粒子截面数的计数应遵循Gundersen法则：(1)落在测试系统内的粒子为有效粒子；(2)仅与包容线(即图1中覆盖在计数切片上测试框的虚线)相交的粒子为有效粒子；(3)凡与排斥线(即图1中覆盖在计数切片上测试框的实线)相交，无论是否与包容线相交均为无效粒子[9]。在测量突触数目时，利用相邻两张电镜切片代替Disector的两个平行平面，分别称为计数切片和核查切片，即Physical disector技术(如图1)。若切片厚度为t,则h=t。
, http://www.100md.com
图1 Physical Disector的模式图
Fig.1 The illustration of the Physical Disector
超薄切片的照片光学放大3倍，依次抽取相邻的两张，选定测试框的面积为7.23×106nm2。首先在两张照片上描出较粗大轴突的轮廓，作为定位标记。然后在计数切片(两张切片中的任何1张)中计数突触的截面数，突触计数标准为：(1)在突触前成分中存在3个以上突触小泡；(2)在突触后成分中可辨认出突触后致密物[10]。最后在核查切片中计数同时出现在计数切片和核查切片上的突触的截面数；两者之差为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-，也就是相应计数空间(测试面的面积A乘以两测试面的间距t)内突触的数目(详细数学推导参见参考文献[7])，因此：
(*), 百拇医药
其中：Nv:突触的数密度；Q-：为计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数；t:超薄切片的厚度；A：测试面的面积。
1.5 微皱折法与超薄切片厚度的测量：超薄切片在捞片时可形成两种皱折，一种是宽窄不定的大皱折，另一种是宽度恰好为切片厚度2倍的微皱折(small fold)[11](图2)。微皱折在电镜下具有以下特征：皱折为两条紧密相贴的黑线；两黑线间有时可见1条极细、不连续的致密黑线(图3)系由染液渗入皱折间的缝隙中所形成；皱折的末端常可见分岔(图4)。48 000倍下，拍摄若干微皱折，测量它们的宽度，计算超薄切片的厚度为：42±5nm。
图2 微皱折的模式图 A微皱折；B大皱折
Fig.2 The illustration of the small fold
, http://www.100md.com
A shows a small fold and B shows a large fold
图3 典型的微皱折 ×4 800
Fig.3 The typical small fold ×4 800
图4 微皱折的末端 ×4 800
Fig.4 The terminal of the small fold ×4 800
2.计算机辅助分析的实现
2.1 系统硬件构成：系统硬件由主机、扫描仪和打印机3部分构成。主机：主频200MHz、内存32M、硬盘6.4G；扫描仪：ScanMakerⅡSP(MICROTEK公司产品)；打印机：6P激光打印机(HP公司产品)。
, 百拇医药
2.2 开发平台与工具：系统开发的操作系统采用Windows 95(MICROSOFT公司产品)[12]、开发工具采用Visual Basic 4.0(MICROSOFT公司产品)[13]。
2.3 主要功能模块介绍：(1)切片预览模块：该模块可同时打开1组电镜连续切片的照片，依次排列在屏幕上，使操作者可在定量分析切片前预览该组切片。同时，在分析过程中可随时调用该模块，使操作者可从整体上观察该组切片，以利对复杂结构全面分析；(2)测试框添加模块：该模块可在电镜切片的照片上添加预设面积的Gundersen无偏差测试框，并以TIF格式存盘，以备调用；(3)Disector计数模块：该模块可并行打开2张相邻电镜切片的照片，具备同步放大、缩小以及利用水平和垂直滑块同步移动的功能(如图5)，以便使用者对比观察两张相邻切片。使用者利用鼠标首先在计数切片的图片框内点击标记突触结构，同时观察核查切片中该突触是否出现，如果出现也利用鼠标点击标记，该模块可自动根据标记次数计算计数切片上出现而核查切片上不出现的突触的截面数Q-。如果使用者标记突触时出错，可利用撤消命令取消标记；(4)数据计算分析模块：超薄切片的厚度和测试面的面积利用对话框输入后。该模块可根据公式(*)计算每组电镜切片中突触的数密度，并可计算全部电镜切片的突触数密度的均值和标准差(
±s)。, 百拇医药
图5 Disector Countor 1.0的界面图
Fig.5 The interface of Disector Countor 1.0
3.手工计数与计算机辅助分析结果的比较
将手工计数的结果与计算机辅助分析的结果利用SPSS软件进行t检验。
结 果
生后30d大鼠海马CA1区辐射层，突触的数密度手工计算结果为：2.31±0.22×10-8个/nm3；计算机分析结果为：2.29±0.18×10-8个/nm3。经t检验两者无显著差异(P>0.05)。
讨 论
, 百拇医药
1.Disector作为一种三维探针可实现对神经组织中突触数密度的无偏差测量
以往测量突触数密度的方法往往采用模型展开技术(model-based unfolding techniques)，即基于一定假设或模型建立由二维切片突触剖面数推算空间突触数密度的体视学公式[14]。此类方法多基于突触接触区为圆盘形且在神经组织中均匀分布等假设，但研究表明：相当比例的突触具有复杂的三维结构并不满足圆盘模型。因此，基于模型展开技术的经典体视学测量法存在明显的原理缺陷，其测量结果具有无法预测的测量偏差[1，3，14]。我们采用的Disector技术体现了80年代以来新兴的设计技术(design-based techniques)的体视学思路，即不是基于任何假设或模型而是采用两张相邻二维切片作为三维探针，相当于直接计数三维空间中突触数目，与突触的形状、大小和空间分布无关，可实现真正意义上的突触数目的无偏差测量[4，8]。
, 百拇医药
2.计算机辅助分析具备客观、高效等优点，是突触数目定量分析的发展方向
我们研制的基于Disector技术的突触数密度计算机辅助分析系统(Disector Countor1.0)是在Windows95平台上，利用Visual Basic4.0开发研制的。Windows95为用户直观的图形操作环境和用户界面，人机交互方便、利于掌握和使用[12]。Visual Basic 4.0运用可视化设计工具，具备复杂的界面处理动作和事件驱动的编程机制[13]。因此，Disector Countor 1.0获得了开发平台和开发工具赋予的良好的人机界面和图像处理功能，具备客观、高效等优点，是突触数目定量分析发展的方向。同时，整个研究过程中电镜图像全部以数字化图像保存(* JPG格式)，便于存储和利用，既省去了洗印相片等烦琐的暗室工作，又保证了分析过程中放大倍数的可靠性和一致性。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470309)；卫生部科研基金资助项目(98-1-263)
, 百拇医药
作者简介：张琳(1971—)，男，湖南长沙人，医学学士，助教
参考文献：
[1]Coggeshall RE,Lekan HA.Methods for determining the numbers of cells and synapses:a case for more uniform standards of review[J].J Comp Neurol,1996,364(1):6-15.
[2]Coggeshall RE.A consideration of neural counting methods[J].TINS,1994,15(1):9-13.
[3]Mayhew TM.A review of recent advances in stereology for quantifying neural structure[J].J Neurocoytol,1992,21(5):313-328.
, http://www.100md.com
[4]沈丽,张琳,南燕.体视学在突触超微结构定量研究中的应用[J].中国体视学与图像分析杂志,1998,3(1):37～41.
[5]Buravkov SV.Simple PC-based system for morphometric analysis of synapse[J].J Neurosci Methods,1995,61(1):1-4.
[6]Dahlhaus R,Eichler M,Sandkuhler J.Identification of synaptic connections in neural ensembles by graphical models[J].J Neurosci Methods,1997,77(1):93-107.
[7]Sterio DC.The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector[J].J Microsc,1984,134(2):127-136.
, 百拇医药
[8]张琳,买鸿宴,南燕,等.Disector法测量突触的数密度[J].神经解剖学杂志,1998,14(4):411～414.
[9]Gundersen HJG.Notes on estimation of the numerical density of arbitrary profiles:the edge effect[J].J Microsc,1977;111(2):219-223.
[10]Jones DG,Calverley RKS.Frequency of occurrence of perforated synapses in develping rat neocortex[J].Neurosc Letter,1991,129(3):189-192.
[11]Small JV.Measurement of section thickness.In:Bocciarelli DS.Proceeding of the Forth European Congress on Electronic Microscopy[M].Vol 1.Roma:Tipografia poliglotta vaticana,1968:609-610.
, 百拇医药
[12]Simpson A.Windows 95 UNCUT[M].California:IDG Books Worldwide Inc,1995:1-129.
[13]Rahmel D,Rahmel R.Developing Client/Server Application with Visual Basic 4.0[J].Washington:SAMS Publishing,1995:1-170.
[14]Mayhew TM,Gundersen HJG.If you assume,you can make an ass out of u and me:a decade of the disector for stereological counting of particles in 3D space[J].J Anat,1996,183(1):1
[15]Jastrow H,Mach MA,Vollrath L.The shape of synaptic ribbons in the rat pineal gland[J].Cell Tissue Res,1997,287(3):255-261.
收稿日期：1998-11-06
修回日期：1999-03-26, http://www.100md.com