大鼠胸腺内促性腺激素释放激素-mRNA的表达
作者：
单位：
关键词：
解剖学报000122 摘 要：目的 对大鼠胸腺GnRH的存在及胸腺GnRH-mRNA的表达进行研究。 方法 采用免疫组织化学及原位杂交方法。 结果 大鼠胸腺内不仅有GnRH样物质，而且有GnRH-mRNA的表达。这种GnRH除了表达在胸腺上皮细胞以外，在皮质和髓质的部分淋巴细胞及巨噬细胞也有表达。 结论 GnRH可能是一种在免疫系统和神经内分泌系统之间起双向直接联系作用的因子。
分类号：Q954.55 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-90
THE EXPRESSION OF GnRH-mRNA IN RAT THYMUS
, 百拇医药
HE Wei
(Department of Histology and Embryology, China Medical University, Shenyang 110001, China)
WANG Zhan-you
(Department of Histology and Embryology, China Medical University, Shenyang 110001, China)
SHI Yu-xiu
(Department of Histology and Embryology, China Medical University, Shenyang 110001, China)
, 百拇医药
Sakabe Kou
(Department of Morphology, Tokai University School of Medicine, 259-1193, Japan)
Seiki Kanji
(Department of Morphology, Tokai University School of Medicine, 259-1193, Japan)
Abstract：Objective It has been reported that the hypothalamic GnRH affects the activation of thymic lymphocytes as an immune modulator. However, whether thymus itself produces GnRH is not completely clear. Thus, the existence of GnRH and the expression of GnRH-mRNA in rat thymus were studied in this article.Methods The immunohistochemistry and in situ hybridization were used in the present study. Results There was hypothalamic GnRH like substance expression in rat thymus at both the polypeptide and the mRNA. The GnRH-mRNA was not only expressed in thymic epithelial cells, but also in part of the lymphocytes and macrophages of cortex and medulla. Conclusion This result indicated that GnRH might be a bidirectional factor between immune system and neuroendocrine system.
, http://www.100md.com
Key words：Thymus; GnRH; Immunohistochemistry; In situ hybridization▲
哺乳动物胸腺是具有明显特性的中枢淋巴器官，其对T淋巴细胞的分化起决定性作用，并表现出对性类固醇激素的敏感性[1]。下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的经典作用是通过位于垂体前叶、性腺及胎盘的GnRH受体调节性激素分泌从而控制生殖生理过程。可是，近年的研究提示，GnRH作为免疫调节因子参与T淋巴细胞活化。而且，胸腺内有GnRH受体的存在已被证实[2]。可是，有文献报告，大鼠门脉系统内GnRH浓度很低。下丘脑GnRH在垂体门脉系和颈静脉之间被稀释500倍，从而提示其已在垂体前叶被迅速代谢，下丘脑GnRH经血循环使胸腺的GnRH受体活化的可能性很小[3]。所以，胸腺组织以局部分泌方式产生GnRH的可能性引入注目。有人用放射免疫分析法证明胸腺内似有GnRH的存在。但是由于其方法的局限性，胸腺组织是否有GnRH的基因表达仍不十分清楚。我们用免疫组织化学、原位杂交法研究了大鼠胸腺内多肽水平及mRNA水平GnRH的表达。
, 百拇医药
材料和方法
7周龄近交系雌性SD大鼠4只，进行卵巢切除术1周后，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉下，经左心室4%多聚甲醛灌流固定，取胸腺，同样固定液固定18h(4℃)后，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片，厚4μm，用于免疫组织化学染色及原位杂交。
1. 免疫组织化学
一部分胸腺切片标本用ABC法进行免疫组织化学染色(Auto ProbeⅢ Universal Kit, BMD, U S A)，第一抗体为兔抗鼠GnRH抗体(YII YP010 日本)，抗体工作浓度为1∶1 000，孵育时间为18h(4℃)。DAB显色。对照实验：用正常兔血清代替第一抗体染色结果为阴性。免疫染色后，甲绿复染细胞核。
2.原位杂交
主要步骤：切片脱蜡后蛋白酶K(15mg/L)处理，37℃，30min；4%多聚甲醛后固定，4℃，5min；前杂交液(50%去离子甲酰胺；5×SSC;5×Denhardt液；变性的鲱鱼精子DNA 100mg/L);37℃孵育2h；杂交反应(GnRH Exon3位置5′生物素标记合成寡核苷酸探针，31mer，日本宝酒造；探针浓度2mg/L)37℃12h;SSC/甲酰胺洗净；streptavidin-ALP conjugate (In Situ Hybridization and Detection System, Cat No.18250-019 LIFE TECHNOLOGIES, USA)RT 30min; NBT/BCIP 37℃显色2h。
, 百拇医药
结果和讨论
用抗GnRH抗体对胸腺切片标本进行免疫组织化学染色，结果显示GnRH免疫染色阳性(图1)。GnRH样免疫阳性细胞主要存在于髓质的胸腺上皮细胞(图2a)。另外，在皮质及髓质的部分淋巴细胞及巨噬细胞也显示GnRH免疫染色阳性(图2b)。用GnRH合成寡核苷酸探针对胸腺组织进行原位杂交，结果表明胸腺组织有GnRH-mRNA的表达(图3)。胸腺GnRH-mRNA在胸腺内各类细胞的分布与免疫组织化学染色结果基本一致(图4a，图4b)，但表达GnRH-mRNA细胞的数量没有免疫染色阳性细胞多，尤其在胸腺髓质的上皮细胞。两者数量上的差异提示，胸腺在自身以局部分泌形式产生GnRH的同时，可能也通过受体结合接受血中GnRH的调节。
图1 大鼠胸腺显示GnRH免疫染色阳性，特别是胸腺髓质(↑)。 ×52
, http://www.100md.com
Fig.1 Rat thymus showing GnRHpositive immunoreaction,especially in thymic medulla(↑)。 ×52
图2a 胸腺髓质显示GnRH免疫染色阳性(▲胸腺上皮细胞；↑淋巴细胞)。 ×200
Fig.2a Thymic medulla showing Gn RH positive immunoreaction(▲ thymic epithelial cells;↑lymphcyte)×200
图2b 胸腺皮质部分细胞显示GnRH免疫染色阳性(▲巨噬细胞；↑淋巴细胞)。 ×200
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Fig.2b Part of cells of thymic cortex showing GnRH positive immunoreaction(▲macrophage;↑lymphocyts) ×200
图3 大鼠胸腺表达GnRH-mRNA，特别是胸腺髓质(↑)。 ×52
Fig.3 Rat thymus expressing GnRH-mRNA ,especially in thymic medulla(↑) ×52
图4a 胸腺髓质部分上皮细胞表达GnRH-mRNA(▲)。 ×200
Fig.4a Rart of epithelial cells of thymic medulla expressingGnRH-mRNA(▲) ×200
, http://www.100md.com
图4b 胸腺皮质多数淋巴细胞表达GnRH-mRNA(↑)。 ×200
Fig.4b Majority of lymphocytes of thymic cortex expressing GnRH-mRNA(↑) ×200
近年来的研究证明，在中枢神经系统、内分泌系统和免疫系统之间存在着直接、双向的信息交流，这三大系统的互相调节维持着机体内环境的稳定[4]。“免疫-神经-内分泌网络”学说已被人们广泛接受。有学者报告[2]，在个体发生过程中，胸腺-淋巴系统的发育与下丘脑-垂体-性腺轴的发育互相依赖，呈现严格的同步性。在出生5d小鼠，注射GnRH拮抗剂2d后，胸腺的增殖反应完全被抑制；胸腺细胞CD4百分比减少；胸腺的重量减轻并发生组织形态学的破坏。在胚胎16d时，下丘脑GnRH浓度达最高，此时，伴随着垂体LH分泌的出现和胸腺细胞分化的开始。这些事实提示，下丘脑GnRH和胸腺发育有密切关系。近年许多研究证明，GnRH作为传统的生殖激素，也是免疫功能的重要调节物。在体外培养淋巴细胞，GnRH可促进其IL-2受体的表达，参与淋巴细胞的活化。在胸腺重量下降并且胸腺内GnRH受体减少的老年大鼠(15～16月龄)，GnRH的长期(45d)给药，可以使胸腺的变化逆转[5]。本研究用免疫组织化学和原位杂交方法证明，胸腺内部分淋巴细胞及网状上皮细胞GnRH免疫染色阳性，并有一部分细胞表达GnRH-mRNA。提示GnRH可能是一种在免疫系统和神经内分泌系统之间起双向直接联系作用的因子。■
, 百拇医药
基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司[1998]679号)
作者简介：何威(1959—)，女，黑龙江依兰县人，医学博士，教授
参考文献
[1]He W, Sakabe K, Seiki K, et al. Sex steroid modulation of thymic hormone production in thymus epithelial cell culture[J]. Pathophysiol, 1996,3(3):169-174.
[2]Morale MC, Batticane N, Bartoloni G, et al. Blockade of central and peripheral luteinizing hormone-releasing hormone(LHRH) receptors in neonatal rats with a potent LHRH-antagonist inhibits the morphofunctional development of the thymus and maturation of the cell-mediated and humoral immune responses[J]. Endocrinology, 1991,128(2):1073-1085.
, http://www.100md.com
[3]Labrie F, Seguin C, Lefebvre F-A, et al. Gonadal LHRH receptors and direct gonadal effects of LHRH agonists[J]. Front Horm Res, 1982,10(1):33-40.
[4]朱长庚.免疫-神经-内分泌网络[J].解剖学报，1993，24(2)：216～221.
[5]Marchetti B, Guarcello V, Morale MC, et al. Luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) agonist restoration of age-associated decline of thymus weight, thymic LHRH receptors, and thymocyte proliferative capacity[J]. Endocrinology, 1989, 125(2):1037-1045.
收稿日期：1998-11-17
修回日期：1999-04-13, 百拇医药
单位：
关键词：
解剖学报000122 摘 要：目的 对大鼠胸腺GnRH的存在及胸腺GnRH-mRNA的表达进行研究。 方法 采用免疫组织化学及原位杂交方法。 结果 大鼠胸腺内不仅有GnRH样物质，而且有GnRH-mRNA的表达。这种GnRH除了表达在胸腺上皮细胞以外，在皮质和髓质的部分淋巴细胞及巨噬细胞也有表达。 结论 GnRH可能是一种在免疫系统和神经内分泌系统之间起双向直接联系作用的因子。
分类号：Q954.55 文献标识码：A
文章编号：0529-1356(2000)01-90
THE EXPRESSION OF GnRH-mRNA IN RAT THYMUS
, 百拇医药
HE Wei
(Department of Histology and Embryology, China Medical University, Shenyang 110001, China)
WANG Zhan-you
(Department of Histology and Embryology, China Medical University, Shenyang 110001, China)
SHI Yu-xiu
(Department of Histology and Embryology, China Medical University, Shenyang 110001, China)
, 百拇医药
Sakabe Kou
(Department of Morphology, Tokai University School of Medicine, 259-1193, Japan)
Seiki Kanji
(Department of Morphology, Tokai University School of Medicine, 259-1193, Japan)
Abstract：Objective It has been reported that the hypothalamic GnRH affects the activation of thymic lymphocytes as an immune modulator. However, whether thymus itself produces GnRH is not completely clear. Thus, the existence of GnRH and the expression of GnRH-mRNA in rat thymus were studied in this article.Methods The immunohistochemistry and in situ hybridization were used in the present study. Results There was hypothalamic GnRH like substance expression in rat thymus at both the polypeptide and the mRNA. The GnRH-mRNA was not only expressed in thymic epithelial cells, but also in part of the lymphocytes and macrophages of cortex and medulla. Conclusion This result indicated that GnRH might be a bidirectional factor between immune system and neuroendocrine system.
, http://www.100md.com
Key words：Thymus; GnRH; Immunohistochemistry; In situ hybridization▲
哺乳动物胸腺是具有明显特性的中枢淋巴器官，其对T淋巴细胞的分化起决定性作用，并表现出对性类固醇激素的敏感性[1]。下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的经典作用是通过位于垂体前叶、性腺及胎盘的GnRH受体调节性激素分泌从而控制生殖生理过程。可是，近年的研究提示，GnRH作为免疫调节因子参与T淋巴细胞活化。而且，胸腺内有GnRH受体的存在已被证实[2]。可是，有文献报告，大鼠门脉系统内GnRH浓度很低。下丘脑GnRH在垂体门脉系和颈静脉之间被稀释500倍，从而提示其已在垂体前叶被迅速代谢，下丘脑GnRH经血循环使胸腺的GnRH受体活化的可能性很小[3]。所以，胸腺组织以局部分泌方式产生GnRH的可能性引入注目。有人用放射免疫分析法证明胸腺内似有GnRH的存在。但是由于其方法的局限性，胸腺组织是否有GnRH的基因表达仍不十分清楚。我们用免疫组织化学、原位杂交法研究了大鼠胸腺内多肽水平及mRNA水平GnRH的表达。
, 百拇医药
材料和方法
7周龄近交系雌性SD大鼠4只，进行卵巢切除术1周后，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹膜腔注射麻醉下，经左心室4%多聚甲醛灌流固定，取胸腺，同样固定液固定18h(4℃)后，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片，厚4μm，用于免疫组织化学染色及原位杂交。
1. 免疫组织化学
一部分胸腺切片标本用ABC法进行免疫组织化学染色(Auto ProbeⅢ Universal Kit, BMD, U S A)，第一抗体为兔抗鼠GnRH抗体(YII YP010 日本)，抗体工作浓度为1∶1 000，孵育时间为18h(4℃)。DAB显色。对照实验：用正常兔血清代替第一抗体染色结果为阴性。免疫染色后，甲绿复染细胞核。
2.原位杂交
主要步骤：切片脱蜡后蛋白酶K(15mg/L)处理，37℃，30min；4%多聚甲醛后固定，4℃，5min；前杂交液(50%去离子甲酰胺；5×SSC;5×Denhardt液；变性的鲱鱼精子DNA 100mg/L);37℃孵育2h；杂交反应(GnRH Exon3位置5′生物素标记合成寡核苷酸探针，31mer，日本宝酒造；探针浓度2mg/L)37℃12h;SSC/甲酰胺洗净；streptavidin-ALP conjugate (In Situ Hybridization and Detection System, Cat No.18250-019 LIFE TECHNOLOGIES, USA)RT 30min; NBT/BCIP 37℃显色2h。
, 百拇医药
结果和讨论
用抗GnRH抗体对胸腺切片标本进行免疫组织化学染色，结果显示GnRH免疫染色阳性(图1)。GnRH样免疫阳性细胞主要存在于髓质的胸腺上皮细胞(图2a)。另外，在皮质及髓质的部分淋巴细胞及巨噬细胞也显示GnRH免疫染色阳性(图2b)。用GnRH合成寡核苷酸探针对胸腺组织进行原位杂交，结果表明胸腺组织有GnRH-mRNA的表达(图3)。胸腺GnRH-mRNA在胸腺内各类细胞的分布与免疫组织化学染色结果基本一致(图4a，图4b)，但表达GnRH-mRNA细胞的数量没有免疫染色阳性细胞多，尤其在胸腺髓质的上皮细胞。两者数量上的差异提示，胸腺在自身以局部分泌形式产生GnRH的同时，可能也通过受体结合接受血中GnRH的调节。
图1 大鼠胸腺显示GnRH免疫染色阳性，特别是胸腺髓质(↑)。 ×52
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Fig.1 Rat thymus showing GnRHpositive immunoreaction,especially in thymic medulla(↑)。 ×52
图2a 胸腺髓质显示GnRH免疫染色阳性(▲胸腺上皮细胞；↑淋巴细胞)。 ×200
Fig.2a Thymic medulla showing Gn RH positive immunoreaction(▲ thymic epithelial cells;↑lymphcyte)×200
图2b 胸腺皮质部分细胞显示GnRH免疫染色阳性(▲巨噬细胞；↑淋巴细胞)。 ×200
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Fig.2b Part of cells of thymic cortex showing GnRH positive immunoreaction(▲macrophage;↑lymphocyts) ×200
图3 大鼠胸腺表达GnRH-mRNA，特别是胸腺髓质(↑)。 ×52
Fig.3 Rat thymus expressing GnRH-mRNA ,especially in thymic medulla(↑) ×52
图4a 胸腺髓质部分上皮细胞表达GnRH-mRNA(▲)。 ×200
Fig.4a Rart of epithelial cells of thymic medulla expressingGnRH-mRNA(▲) ×200
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图4b 胸腺皮质多数淋巴细胞表达GnRH-mRNA(↑)。 ×200
Fig.4b Majority of lymphocytes of thymic cortex expressing GnRH-mRNA(↑) ×200
近年来的研究证明，在中枢神经系统、内分泌系统和免疫系统之间存在着直接、双向的信息交流，这三大系统的互相调节维持着机体内环境的稳定[4]。“免疫-神经-内分泌网络”学说已被人们广泛接受。有学者报告[2]，在个体发生过程中，胸腺-淋巴系统的发育与下丘脑-垂体-性腺轴的发育互相依赖，呈现严格的同步性。在出生5d小鼠，注射GnRH拮抗剂2d后，胸腺的增殖反应完全被抑制；胸腺细胞CD4百分比减少；胸腺的重量减轻并发生组织形态学的破坏。在胚胎16d时，下丘脑GnRH浓度达最高，此时，伴随着垂体LH分泌的出现和胸腺细胞分化的开始。这些事实提示，下丘脑GnRH和胸腺发育有密切关系。近年许多研究证明，GnRH作为传统的生殖激素，也是免疫功能的重要调节物。在体外培养淋巴细胞，GnRH可促进其IL-2受体的表达，参与淋巴细胞的活化。在胸腺重量下降并且胸腺内GnRH受体减少的老年大鼠(15～16月龄)，GnRH的长期(45d)给药，可以使胸腺的变化逆转[5]。本研究用免疫组织化学和原位杂交方法证明，胸腺内部分淋巴细胞及网状上皮细胞GnRH免疫染色阳性，并有一部分细胞表达GnRH-mRNA。提示GnRH可能是一种在免疫系统和神经内分泌系统之间起双向直接联系作用的因子。■
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基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司[1998]679号)
作者简介：何威(1959—)，女，黑龙江依兰县人，医学博士，教授
参考文献
[1]He W, Sakabe K, Seiki K, et al. Sex steroid modulation of thymic hormone production in thymus epithelial cell culture[J]. Pathophysiol, 1996,3(3):169-174.
[2]Morale MC, Batticane N, Bartoloni G, et al. Blockade of central and peripheral luteinizing hormone-releasing hormone(LHRH) receptors in neonatal rats with a potent LHRH-antagonist inhibits the morphofunctional development of the thymus and maturation of the cell-mediated and humoral immune responses[J]. Endocrinology, 1991,128(2):1073-1085.
, http://www.100md.com
[3]Labrie F, Seguin C, Lefebvre F-A, et al. Gonadal LHRH receptors and direct gonadal effects of LHRH agonists[J]. Front Horm Res, 1982,10(1):33-40.
[4]朱长庚.免疫-神经-内分泌网络[J].解剖学报，1993，24(2)：216～221.
[5]Marchetti B, Guarcello V, Morale MC, et al. Luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) agonist restoration of age-associated decline of thymus weight, thymic LHRH receptors, and thymocyte proliferative capacity[J]. Endocrinology, 1989, 125(2):1037-1045.
收稿日期：1998-11-17
修回日期：1999-04-13, 百拇医药