小鼠卵巢Ⅳ型胶原、间质金属蛋白酶和层粘连蛋白的合成、分布
作者：钱晓菁 许增禄徐健 徐园园
单位：钱晓菁(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)；许增禄(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)；徐健(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)；徐园园(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)
关键词：卵巢Ⅳ型胶原；层粘连蛋白；间质金属蛋白酶-2
解剖学报000310 【摘要】 目的 研究Ⅳ型胶原、层粘连蛋白(laminin, LN)和间质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在不同年龄小鼠卵巢中的分布和变化模式。 方法 利用生物素-抗生物素蛋白间接免疫荧光方法，从蛋白水平观察Ⅳ型胶原和LN的分布和变化；利用地高辛标记的Ⅳ型胶原和MMP-2基因探针进行原位杂交，从mRNA水平观察Ⅳ型胶原和MMP-2的分布和变化。 结果 出生5d小鼠卵巢的卵泡基膜和卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium, OSE)基膜处已有少量Ⅳ型胶原和LN分布，基质细胞和OSE中也有分布。Ⅳ型胶原和MMP-2的mRNA在基质细胞和OSE有表达。发育期小鼠卵巢中卵泡基膜和OSE基膜中Ⅳ型胶原和LN的含量随年龄的增加而呈增加趋势，分布也趋于连续。颗粒细胞、膜细胞、OSE中都有Ⅳ型胶原和LN分布，也有Ⅳ型胶原和MMP-2 mRNA的表达，其表达水平明显比5d时高。成熟期小鼠卵巢Ⅳ型胶原和LN的含量较高。12个月的小鼠卵巢已开始退化，基膜细胞外间质(extracellular matrix,ECM)的数量减少，MMP-2 mRNA的表达量无明显变化。 结论 Ⅳ型胶原和LN在小鼠卵巢发育过程中含量和分布发生着动态变化，可能对卵泡发育起重要作用。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R322.6+5，R329.2+4 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-231
SYNTHESIS AND DISTRIBUTION OF TYPE Ⅳ COLLAGEN, MATRIX
METALLOPROTEINASE AND LAMININ IN MOUSE OVARIES
QIAN Xiao-jing, XU Zeng-lu, XU Jian, XU Yuan-yuan
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the distribution of type Ⅳ collagen and LN and the expression of type Ⅳ collagen and MMP-2 genes. Methods Biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence technique, in situ hybridization with diglabeling type Ⅳ collagen and MMP-2 cDNA probe were used. Results In the ovary of 5-day-old neonatal mouse, a small amount of type Ⅳ collagen and LN fluorescence was seen in the basement membrane of follicle and OSE. The expression of type Ⅳ collagen and MMP-2 was observed inside OSE and stromal cells. In 15day to 2 month old mouse ovaries, the contents of ECM components increased with advancing age, and the distribution of basement membrane componets were smoothly than before. The mRNA expressions of type Ⅳ collagen and MMP-2 was markedly increased during this peroid. OSE, granulosa and thecal cells were the cells, which contributed to the synthesis of those ECM components and MMP-2. In 2 to 6 month mouse ovaries, the amount of basement membrane ECM components did not change much, and maintain about the same level. In 12-month-old mouse ovary, the contents of the basement membrane ECM components decreased. Conclusion We suggest that the type Ⅳ collagen and LN of ovary may play important roles in the process of follicle development.
, http://www.100md.com
【Key words】 Type Ⅳ collagen; LN; MMP-2; Ovary
细胞外间质包括多种具有生物活性的大分子，它们在许多生理和病理过程中发挥重要作用。卵巢中有丰富的ECM，其中基膜就是由Ⅳ型胶原，层粘连蛋白，巢蛋白/制动素和硫酸乙酰肝素等多种ECM成分构成的[1]，但这些成分在卵泡发育中所起的作用目前尚不清楚。本实验选取小鼠作为实验动物，采用免疫细胞化学，组织化学和分子生物学等技术方法，研究不同年龄阶段的小鼠卵巢中Ⅳ型胶原，LN以及MMP-2的分布和变化规律，探讨这些ECM成分和蛋白水解酶对卵泡的发育过程所起的作用。为卵泡发育提供理论基础，为女性计划生育研究提供科学依据。
材料和方法
1.实验动物
由中国医学科学院动物所提供健康5d和15d，1、2、3、6和12个月雌性昆明小鼠，断颈处死后取卵巢。一侧用中性福尔马林固定液固定24h后，常规石蜡包埋、切片，片厚6μm。另一侧用OCT包埋，液氮迅速冷冻，组织块用恒冷箱切片机切片，片厚8～10μm。
, 百拇医药
2.试剂
兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，由北京医科大学细胞生物室提供。生物素化山羊抗兔IgG和荧光素抗生物素蛋白DCS购于北京中山生物技术有限公司。地高辛DNA标记和检测试剂盒购于德国Boehringer Mannheim。含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA插入片段的重组质粒和含人MMP-2 cDNA插入片段的重组质粒，均由芬兰Tuomo Karttunen教授和Helena Autio-Harmainen教授惠赠。
3.荧光素-抗生物素蛋白间接免疫荧光染色
冰冻切片室温干燥后，在组织上滴加用PBS稀释的正常山羊血清，4℃孵育20min。分别加兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，4℃孵育过夜。对照片此步以山羊血清代替第一抗体。冷PBS冲洗。加入生物素化的山羊抗兔IgG,4℃孵育1h。冷PBS冲洗。加入以碳酸氢钠缓冲液稀释的荧光素-抗生物素蛋白DCS，4℃孵育1h。冷PBS冲洗。用含PBS和对苯基二胺(P-phenylenediamine,PPd)的甘油做介质封片。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察、摄片。
, 百拇医药
4.石蜡组织切片原位杂交及统计学处理
含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和人MMP-2 cDNA片段的重组质粒分别用磷酸钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，碱裂解法进行质粒DNA的大量制备，PEG法纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定OD260和OD280值，计算DNA浓度。人与小鼠的Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链以及MMP-2均有很高同源性[2，3]。Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和MMP-2 cDNA探针根据Boringer Mannheim公司推荐的标准程序进行cDNA探针非放射性标记及免疫检测。
石蜡组织切片以0.04% DEPC水裱贴于圆玻片上，52℃过夜烤干。新鲜二甲苯37℃，30min，室温10min，梯度酒精脱水，PBS冲洗。新配的0.3% Triton X-100 10min,PBS冲洗。蛋白酶 K(1mg/L)37℃ 30min，冷PBS冲洗。0.25%乙酸酐室温10min，PBS冲洗。余下步骤按常规原位杂交方法[4]操作，终止显色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，镜检并摄片。对照：以杂交液中免去探针作阴性对照。
, http://www.100md.com
利用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对照片做半定量灰度扫描，以其单位面积平均灰度值作为mRNA表达量的参数，并将结果以方差检验和Student Newman-Keuls(SNK)检验进行统计学分析，所有数据都以均值±标准误差(
±s)表示，P<0.05为差异显著。
结 果
1.间接免疫荧光染色观察结果
1.1 Ⅳ型胶原(图1A)：卵巢整体的荧光强度从5d到2个月一直在增加，进入性成熟期后荧光强度保持稳定，至12个月时下降。5d时原始卵泡外已有绿色荧光环绕，初级卵泡的基膜荧光染色弱且不完整。随年龄增加，各级卵泡基膜荧光逐渐增强，形成完整、光滑的基膜。5d时卵巢基质细胞和OSE有弱荧光，颗粒细胞和卵母细胞未显示荧光。15d膜细胞和颗粒细胞内有较弱绿色荧光出现。从15d到2个月卵巢中膜细胞的荧光一直在增加，其幅度较大。进入性成熟期后，膜细胞荧光强度保持较高水平，变化幅度不大，12个月时减弱。颗粒细胞变化不明显。
, 百拇医药
1.2 层粘连蛋白(图1B)：层粘连蛋白间接免疫荧光分布与变化趋势基本与Ⅳ型胶原相似，颗粒细胞之间的荧光比Ⅳ型胶原稍强，部分呈点状分布。
1.3 阴性对照片未见绿色荧光。
图3 不同年龄小鼠卵巢Ⅳ型胶原原位杂交统计分析图
Fig.3 Densitometric quantification analysis of in
situ hybridization of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA
expression in mouse ovaries of different age
, http://www.100md.com
图4 不同年龄小鼠卵巢MMP-2 mRNA原位杂交统计分析图
Fig.4 Densitometric quantification analysis of in situ hybridization of
MMP-2 mRNA expression in mouse ovaries of different age
2.cDNA探针的鉴定
2.1 含Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA探针的质粒，用Bam HI和Hind Ⅲ进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察鉴定，酶切片段长度为0.9kb，与预期相符。
2.2 MMP-2 cDNA探针的质粒，用EcoRI和Hind Ⅲ进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察鉴定，酶切片段长度为0.7kb，与预期相符。
, 百拇医药
3.原位杂交观察与扫描结果
3.1Ⅳ型胶原mRNA表达(图2A)：5d的小鼠卵巢中，OSE细胞的Ⅳ型胶原mRNA表达明显比卵巢其他细胞强。原始卵泡的基质细胞中也有少量表达。卵巢中部的初级卵泡卵母细胞的胞质中可见极弱的mRNA表达信号。15d到1个月初级卵泡和次级卵泡颗粒细胞和部分卵母细胞的表达明显增强，膜细胞表达较颗粒细胞弱。2个月时膜细胞表达增强。3个月和6个月卵巢中，大的次级卵泡近腔面的颗粒细胞和卵丘的颗粒细胞表达较基底面强，膜细胞与颗粒细胞表达强度相接近。12个月的卵巢整体表达稍减弱，但发育卵泡的颗粒细胞和卵母细胞表达都较强。OSE从5d时即开始表达Ⅳ型胶原mRNA，以后各个阶段Ⅳ型胶原mRNA的表达一直较强。
分别对5和15d、1、2、6和12个月卵巢原位杂交的结果进行灰度扫描，结果显示，卵巢整体Ⅳ型胶原mRNA的表达从5d到1个月呈增加趋势，2个月时稍有减弱，6个月稍增强，12个月时再次下降。SNK检验发现，除5d mRNA表达量与其余各年龄段差异显著外(P<0.05)，其余各时段之间差异不显著(P>0.05)(表1，图3)。
, 百拇医药
3.2 MMP-2 mRNA的表达(图2B)：MMP-2 mRNA的表达从位置和变化趋势与Ⅳ型胶原的
表1 不同年龄小鼠卵巢Ⅳ型胶原mRNA
表达的原位杂交统计分析表
Table 1 Densitometric quantification analysis of in
situ hybridization of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA
expression in mouse ovaries of different age
5d
5day
, 百拇医药
15d
15day
1月
1 month
光密度单位
A unit
0.0 155±0.002
0.034±0.003
0.0 393±0.005
2月
, http://www.100md.com 2 month
6月
6 month
12月
12 month
光密度单位
A unit
0.0 354±0.008
0.0 375±0.004
0.0 314±0.003
, 百拇医药
与5d组相比较P<0.05(P<0.05 vs 5 day)
mRNA表达基本相似。
灰度扫描结果表明，从5d到6个月整个卵巢的MMP-2 mRNA表达量一直在增加，12个月与6个月表达量相同。SNK统计结果显示只有5d与其他各年龄阶段MMP-2 mRNA的表达差异显著(P<0.05)，其他各年龄阶段之间差异不显著(P<0.05)(表2，图4)。
3.3 阴性对照片中无蓝色颗粒
表2 不同年龄小鼠卵巢MMP-2 mRNA
原位杂交统计分析表
Table 2 Densitometric quantification analysis of
, 百拇医药
in situ hybridization of MMP-2 mRNA expression
in mouse ovaries of different age
5d
5 day
15d
15 day
1月
1 monty
光密度单位
A unit
0.0 140±0.001
, 百拇医药
0.0 423±0.004
0.0 511±0.005
2月
2 month
6月
6 month
12月
12 month
光密度单位
A unit
, 百拇医药 0.0 536±0.01
0.0 586±0.012
0.0 586±0.003
与5d组相比较P<0.05(P<0.05 vs 5 day)
讨 论
Ⅳ型胶原和LN是基膜的主要成分，两者分别交联成网格状结构，再通过巢蛋白使两者稳定结合构成基膜的骨架，纤粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其他大分子填充于其间，共同构成基膜[5]。
5d小鼠卵巢中Ⅳ型胶原和LN已构成基膜围绕在原始卵泡外周。此时卵母细胞、颗粒细胞胞质中均无Ⅳ型胶原和LN的间接免疫荧光，两种基膜ECM的荧光定位于基质细胞中，Ⅳ型胶原mRNA的表达也定位于基质细胞中。原始卵泡的基膜可能是由基质细胞分泌的。这与大鼠的情况相近，大鼠出生24h原始卵泡尚未形成时，已有一层薄薄的隔膜把将来要发育成卵泡的细胞团与周围的基质细胞分隔开。出生72h后，原始卵泡已经形成，每个原始卵泡外都围绕着一层基膜[6]。大鼠卵巢中除基质细胞合成Ⅳ型胶原外，原始卵泡内还有一些颗粒细胞可能合成少量的Ⅳ型胶原。
, 百拇医药
15d到1个月期间，颗粒细胞Ⅳ型胶原的表达量比5d明显增加，颗粒细胞间也可见较弱的Ⅳ型胶原和LN的间接免疫荧光。膜细胞Ⅳ型胶原mRNA表达的量增加虽不明显，可它的Ⅳ型胶原和LN的蛋白合成量明显增加。颗粒细胞、膜细胞共同合成的Ⅳ型胶原和LN补充到正在发育的卵泡的基膜中去，使基膜Ⅳ型胶原和LN不断增多，分布也由刚形成时的不均匀到逐渐形成完整、平滑的卵泡基膜包围在初级卵泡、次级卵泡的周围。在体内基膜成分的旺盛合成，可能对卵泡的发育、颗粒细胞的增殖、分化起诱导作用。体外实验已证实基膜可促进培养颗粒细胞的粘附、伸展、增殖、分化；生长在基膜上的颗粒细胞呈多层集合排列，并可促进颗粒细胞分泌孕酮[7]。卵巢体积的增大，需要有大量的ECM合成，同样也需要有ECM的降解。5d的小鼠卵巢已可见基质细胞及初级卵泡的颗粒细胞、膜细胞开始少量表达MMP-2和Ⅳ型胶原的mRNA，15d后它们在颗粒细胞的表达更是明显增加。提示卵泡发育的过程中胶原在进行积极地改建，胶原的合成和降解同时进行，但在发育期，合成功能可能更旺盛。
2～3个月左右，小鼠卵巢基本发育完全，处于较成熟相对稳定的阶段。由于每个动情周期中，都有若干卵泡发育、排卵、形成黄体或闭锁等，卵巢一直处于活跃状态。2～6个月卵巢中的膜细胞和颗粒细胞保持旺盛活力，卵巢基膜ECM成分和MMP-2的mRNA转录和蛋白翻译一直保持高水平，保证ECM的合成和降解处于动态变化中，卵泡发育时合成占优势，而临近排卵时降解占优势。小鼠性成熟期，Ⅳ型胶原的α1(Ⅳ)的mRNA含量在卵泡发育中一直保持高水平与在牛、猪和兔等卵巢中观察到的结果一致[8，9]。但牛的卵泡发育到大的次级卵泡阶段时，基膜的部分成分如α6(Ⅳ)丢失，Ⅳ型胶原的强度降低，LN的强度增高，基膜由Ⅳ型胶原丰富逐渐变为LN丰富。LN形成的网状结构没有Ⅳ型胶原形成的结构致密，可能更适应卵泡增大的需要[5，10]。我们的实验由于采用的是Ⅳ型胶原分子中含量最高的、最常见α1(Ⅳ)链以及Ⅳ型胶原和LN的多抗，未发现Ⅳ型胶原和LN间接免疫荧光强度随卵泡发育有明显变化。
, 百拇医药
12个月时卵巢开始退化，卵巢Ⅳ型胶原的mRNA表达量降低，Ⅳ型胶原和LN的荧光强度也有下降。但对于个别处于发育阶段的卵泡，Ⅳ型胶原的mRNA的合成仍很旺盛。
在小鼠的卵巢发育中Ⅳ型胶原和LN以及MMP-2的含量和分布随年龄的改变而发生着积极的改变，可能对卵泡发育起重要作用。
本文图1A～2B见插图第7页
【基金项目】高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(9704)
【作者简介】 钱晓菁(1972—)，女(汉族)，北京市人，医学硕士，助教
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
, 百拇医药
[1]Luck MR. The gonadal extracellular matrix[J]. Oxf Rev Reprod Bio,1994,16(1)：33-85.
[2]Kurkinen M, Condon MR, Blumberg B, et al. Extensive homology between the carboxyl-terminal peptides of mouse α1(Ⅳ) and α2(Ⅳ) collagen[J]. J Biol Chem, 1987,262(18):8496-8499.
[3]Reponen P, Sahlberg C, Huhtala P, et al. Molecular cloning of mouse 72-kDa type Ⅳ collagenase and its expression during mouse development[J]. J Biol Chem,1992,267(11)：7856-7862.
, 百拇医药
[4]苏慧慈，原位杂交[M]. 北京：中国科学技术出版社.1994：147～150.
[5]Yurchenco PD, Schittny JC. Molecular architecture of basement membranes[J]. FASEB J. 1990,4(6)：1577-1590.
[6]Rajah R, Sundaram GS. Protein distribution and gene expression of collagen type Ⅳ in the neonatal rat ovary during follicle formation[J]. Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),1994 Sep,40(6):769-780.
[7]肖娜，杨燕，贾孟春，等 卵泡基膜中Ⅳ型胶原、层粘连蛋白来源的初步探讨[J].生殖医学杂志，1996，5(3)：140～144.
, http://www.100md.com
[8]Rodgers HF, Irvine CM, V, Wezel IL, et al. Distribution of the α1 to α6 chains of type Ⅳ collagen in bovine follicles[J]. Biol Reprod,1998,59(6)：1334-1341.
[9]Lee VH, Britt JH, Dunbar BS. Localization of laminin proteins during early follicular development in pig and rabbit ovaries[J]. J Reprod Fertil, 1996 Sep,108(1):115-112.
[10]Van Wezel IL, Rodgers HF, Rodgers RJ. Differential localization of laminin chains in bovine follicles[J]. J Reprod Fertil,1998 Mar,112(2):267-278.
【收稿日期】1999-11-16 【修稿日期】2000-01-10, http://www.100md.com
单位：钱晓菁(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)；许增禄(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)；徐健(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)；徐园园(中国医学科学院 中国协和医科大学基础医学研究所，北京 100005)
关键词：卵巢Ⅳ型胶原；层粘连蛋白；间质金属蛋白酶-2
解剖学报000310 【摘要】 目的 研究Ⅳ型胶原、层粘连蛋白(laminin, LN)和间质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在不同年龄小鼠卵巢中的分布和变化模式。 方法 利用生物素-抗生物素蛋白间接免疫荧光方法，从蛋白水平观察Ⅳ型胶原和LN的分布和变化；利用地高辛标记的Ⅳ型胶原和MMP-2基因探针进行原位杂交，从mRNA水平观察Ⅳ型胶原和MMP-2的分布和变化。 结果 出生5d小鼠卵巢的卵泡基膜和卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium, OSE)基膜处已有少量Ⅳ型胶原和LN分布，基质细胞和OSE中也有分布。Ⅳ型胶原和MMP-2的mRNA在基质细胞和OSE有表达。发育期小鼠卵巢中卵泡基膜和OSE基膜中Ⅳ型胶原和LN的含量随年龄的增加而呈增加趋势，分布也趋于连续。颗粒细胞、膜细胞、OSE中都有Ⅳ型胶原和LN分布，也有Ⅳ型胶原和MMP-2 mRNA的表达，其表达水平明显比5d时高。成熟期小鼠卵巢Ⅳ型胶原和LN的含量较高。12个月的小鼠卵巢已开始退化，基膜细胞外间质(extracellular matrix,ECM)的数量减少，MMP-2 mRNA的表达量无明显变化。 结论 Ⅳ型胶原和LN在小鼠卵巢发育过程中含量和分布发生着动态变化，可能对卵泡发育起重要作用。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R322.6+5，R329.2+4 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-231
SYNTHESIS AND DISTRIBUTION OF TYPE Ⅳ COLLAGEN, MATRIX
METALLOPROTEINASE AND LAMININ IN MOUSE OVARIES
QIAN Xiao-jing, XU Zeng-lu, XU Jian, XU Yuan-yuan
(Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the distribution of type Ⅳ collagen and LN and the expression of type Ⅳ collagen and MMP-2 genes. Methods Biotin-avidin DCS system indirect immunofluorescence technique, in situ hybridization with diglabeling type Ⅳ collagen and MMP-2 cDNA probe were used. Results In the ovary of 5-day-old neonatal mouse, a small amount of type Ⅳ collagen and LN fluorescence was seen in the basement membrane of follicle and OSE. The expression of type Ⅳ collagen and MMP-2 was observed inside OSE and stromal cells. In 15day to 2 month old mouse ovaries, the contents of ECM components increased with advancing age, and the distribution of basement membrane componets were smoothly than before. The mRNA expressions of type Ⅳ collagen and MMP-2 was markedly increased during this peroid. OSE, granulosa and thecal cells were the cells, which contributed to the synthesis of those ECM components and MMP-2. In 2 to 6 month mouse ovaries, the amount of basement membrane ECM components did not change much, and maintain about the same level. In 12-month-old mouse ovary, the contents of the basement membrane ECM components decreased. Conclusion We suggest that the type Ⅳ collagen and LN of ovary may play important roles in the process of follicle development.
, http://www.100md.com
【Key words】 Type Ⅳ collagen; LN; MMP-2; Ovary
细胞外间质包括多种具有生物活性的大分子，它们在许多生理和病理过程中发挥重要作用。卵巢中有丰富的ECM，其中基膜就是由Ⅳ型胶原，层粘连蛋白，巢蛋白/制动素和硫酸乙酰肝素等多种ECM成分构成的[1]，但这些成分在卵泡发育中所起的作用目前尚不清楚。本实验选取小鼠作为实验动物，采用免疫细胞化学，组织化学和分子生物学等技术方法，研究不同年龄阶段的小鼠卵巢中Ⅳ型胶原，LN以及MMP-2的分布和变化规律，探讨这些ECM成分和蛋白水解酶对卵泡的发育过程所起的作用。为卵泡发育提供理论基础，为女性计划生育研究提供科学依据。
材料和方法
1.实验动物
由中国医学科学院动物所提供健康5d和15d，1、2、3、6和12个月雌性昆明小鼠，断颈处死后取卵巢。一侧用中性福尔马林固定液固定24h后，常规石蜡包埋、切片，片厚6μm。另一侧用OCT包埋，液氮迅速冷冻，组织块用恒冷箱切片机切片，片厚8～10μm。
, 百拇医药
2.试剂
兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，由北京医科大学细胞生物室提供。生物素化山羊抗兔IgG和荧光素抗生物素蛋白DCS购于北京中山生物技术有限公司。地高辛DNA标记和检测试剂盒购于德国Boehringer Mannheim。含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA插入片段的重组质粒和含人MMP-2 cDNA插入片段的重组质粒，均由芬兰Tuomo Karttunen教授和Helena Autio-Harmainen教授惠赠。
3.荧光素-抗生物素蛋白间接免疫荧光染色
冰冻切片室温干燥后，在组织上滴加用PBS稀释的正常山羊血清，4℃孵育20min。分别加兔抗小鼠Ⅳ型胶原抗体和兔抗小鼠LN抗体，4℃孵育过夜。对照片此步以山羊血清代替第一抗体。冷PBS冲洗。加入生物素化的山羊抗兔IgG,4℃孵育1h。冷PBS冲洗。加入以碳酸氢钠缓冲液稀释的荧光素-抗生物素蛋白DCS，4℃孵育1h。冷PBS冲洗。用含PBS和对苯基二胺(P-phenylenediamine,PPd)的甘油做介质封片。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察、摄片。
, 百拇医药
4.石蜡组织切片原位杂交及统计学处理
含人Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和人MMP-2 cDNA片段的重组质粒分别用磷酸钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，碱裂解法进行质粒DNA的大量制备，PEG法纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖回收cDNA片段，测定OD260和OD280值，计算DNA浓度。人与小鼠的Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链以及MMP-2均有很高同源性[2，3]。Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA和MMP-2 cDNA探针根据Boringer Mannheim公司推荐的标准程序进行cDNA探针非放射性标记及免疫检测。
石蜡组织切片以0.04% DEPC水裱贴于圆玻片上，52℃过夜烤干。新鲜二甲苯37℃，30min，室温10min，梯度酒精脱水，PBS冲洗。新配的0.3% Triton X-100 10min,PBS冲洗。蛋白酶 K(1mg/L)37℃ 30min，冷PBS冲洗。0.25%乙酸酐室温10min，PBS冲洗。余下步骤按常规原位杂交方法[4]操作，终止显色后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，镜检并摄片。对照：以杂交液中免去探针作阴性对照。
, http://www.100md.com
利用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对照片做半定量灰度扫描，以其单位面积平均灰度值作为mRNA表达量的参数，并将结果以方差检验和Student Newman-Keuls(SNK)检验进行统计学分析，所有数据都以均值±标准误差(
±s)表示，P<0.05为差异显著。结 果
1.间接免疫荧光染色观察结果
1.1 Ⅳ型胶原(图1A)：卵巢整体的荧光强度从5d到2个月一直在增加，进入性成熟期后荧光强度保持稳定，至12个月时下降。5d时原始卵泡外已有绿色荧光环绕，初级卵泡的基膜荧光染色弱且不完整。随年龄增加，各级卵泡基膜荧光逐渐增强，形成完整、光滑的基膜。5d时卵巢基质细胞和OSE有弱荧光，颗粒细胞和卵母细胞未显示荧光。15d膜细胞和颗粒细胞内有较弱绿色荧光出现。从15d到2个月卵巢中膜细胞的荧光一直在增加，其幅度较大。进入性成熟期后，膜细胞荧光强度保持较高水平，变化幅度不大，12个月时减弱。颗粒细胞变化不明显。
, 百拇医药
1.2 层粘连蛋白(图1B)：层粘连蛋白间接免疫荧光分布与变化趋势基本与Ⅳ型胶原相似，颗粒细胞之间的荧光比Ⅳ型胶原稍强，部分呈点状分布。
1.3 阴性对照片未见绿色荧光。
图3 不同年龄小鼠卵巢Ⅳ型胶原原位杂交统计分析图
Fig.3 Densitometric quantification analysis of in
situ hybridization of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA
expression in mouse ovaries of different age
, http://www.100md.com
图4 不同年龄小鼠卵巢MMP-2 mRNA原位杂交统计分析图
Fig.4 Densitometric quantification analysis of in situ hybridization of
MMP-2 mRNA expression in mouse ovaries of different age
2.cDNA探针的鉴定
2.1 含Ⅳ型胶原α1(Ⅳ)链cDNA探针的质粒，用Bam HI和Hind Ⅲ进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察鉴定，酶切片段长度为0.9kb，与预期相符。
2.2 MMP-2 cDNA探针的质粒，用EcoRI和Hind Ⅲ进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察鉴定，酶切片段长度为0.7kb，与预期相符。
, 百拇医药
3.原位杂交观察与扫描结果
3.1Ⅳ型胶原mRNA表达(图2A)：5d的小鼠卵巢中，OSE细胞的Ⅳ型胶原mRNA表达明显比卵巢其他细胞强。原始卵泡的基质细胞中也有少量表达。卵巢中部的初级卵泡卵母细胞的胞质中可见极弱的mRNA表达信号。15d到1个月初级卵泡和次级卵泡颗粒细胞和部分卵母细胞的表达明显增强，膜细胞表达较颗粒细胞弱。2个月时膜细胞表达增强。3个月和6个月卵巢中，大的次级卵泡近腔面的颗粒细胞和卵丘的颗粒细胞表达较基底面强，膜细胞与颗粒细胞表达强度相接近。12个月的卵巢整体表达稍减弱，但发育卵泡的颗粒细胞和卵母细胞表达都较强。OSE从5d时即开始表达Ⅳ型胶原mRNA，以后各个阶段Ⅳ型胶原mRNA的表达一直较强。
分别对5和15d、1、2、6和12个月卵巢原位杂交的结果进行灰度扫描，结果显示，卵巢整体Ⅳ型胶原mRNA的表达从5d到1个月呈增加趋势，2个月时稍有减弱，6个月稍增强，12个月时再次下降。SNK检验发现，除5d mRNA表达量与其余各年龄段差异显著外(P<0.05)，其余各时段之间差异不显著(P>0.05)(表1，图3)。
, 百拇医药
3.2 MMP-2 mRNA的表达(图2B)：MMP-2 mRNA的表达从位置和变化趋势与Ⅳ型胶原的
表1 不同年龄小鼠卵巢Ⅳ型胶原mRNA
表达的原位杂交统计分析表
Table 1 Densitometric quantification analysis of in
situ hybridization of type Ⅳ collagen α1(Ⅳ) mRNA
expression in mouse ovaries of different age
5d
5day
, 百拇医药
15d
15day
1月
1 month
光密度单位
A unit
0.0 155±0.002
0.034±0.003
0.0 393±0.005
2月
, http://www.100md.com 2 month
6月
6 month
12月
12 month
光密度单位
A unit
0.0 354±0.008
0.0 375±0.004
0.0 314±0.003
, 百拇医药
与5d组相比较P<0.05(P<0.05 vs 5 day)
mRNA表达基本相似。
灰度扫描结果表明，从5d到6个月整个卵巢的MMP-2 mRNA表达量一直在增加，12个月与6个月表达量相同。SNK统计结果显示只有5d与其他各年龄阶段MMP-2 mRNA的表达差异显著(P<0.05)，其他各年龄阶段之间差异不显著(P<0.05)(表2，图4)。
3.3 阴性对照片中无蓝色颗粒
表2 不同年龄小鼠卵巢MMP-2 mRNA
原位杂交统计分析表
Table 2 Densitometric quantification analysis of
, 百拇医药
in situ hybridization of MMP-2 mRNA expression
in mouse ovaries of different age
5d
5 day
15d
15 day
1月
1 monty
光密度单位
A unit
0.0 140±0.001
, 百拇医药
0.0 423±0.004
0.0 511±0.005
2月
2 month
6月
6 month
12月
12 month
光密度单位
A unit
, 百拇医药 0.0 536±0.01
0.0 586±0.012
0.0 586±0.003
与5d组相比较P<0.05(P<0.05 vs 5 day)
讨 论
Ⅳ型胶原和LN是基膜的主要成分，两者分别交联成网格状结构，再通过巢蛋白使两者稳定结合构成基膜的骨架，纤粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其他大分子填充于其间，共同构成基膜[5]。
5d小鼠卵巢中Ⅳ型胶原和LN已构成基膜围绕在原始卵泡外周。此时卵母细胞、颗粒细胞胞质中均无Ⅳ型胶原和LN的间接免疫荧光，两种基膜ECM的荧光定位于基质细胞中，Ⅳ型胶原mRNA的表达也定位于基质细胞中。原始卵泡的基膜可能是由基质细胞分泌的。这与大鼠的情况相近，大鼠出生24h原始卵泡尚未形成时，已有一层薄薄的隔膜把将来要发育成卵泡的细胞团与周围的基质细胞分隔开。出生72h后，原始卵泡已经形成，每个原始卵泡外都围绕着一层基膜[6]。大鼠卵巢中除基质细胞合成Ⅳ型胶原外，原始卵泡内还有一些颗粒细胞可能合成少量的Ⅳ型胶原。
, 百拇医药
15d到1个月期间，颗粒细胞Ⅳ型胶原的表达量比5d明显增加，颗粒细胞间也可见较弱的Ⅳ型胶原和LN的间接免疫荧光。膜细胞Ⅳ型胶原mRNA表达的量增加虽不明显，可它的Ⅳ型胶原和LN的蛋白合成量明显增加。颗粒细胞、膜细胞共同合成的Ⅳ型胶原和LN补充到正在发育的卵泡的基膜中去，使基膜Ⅳ型胶原和LN不断增多，分布也由刚形成时的不均匀到逐渐形成完整、平滑的卵泡基膜包围在初级卵泡、次级卵泡的周围。在体内基膜成分的旺盛合成，可能对卵泡的发育、颗粒细胞的增殖、分化起诱导作用。体外实验已证实基膜可促进培养颗粒细胞的粘附、伸展、增殖、分化；生长在基膜上的颗粒细胞呈多层集合排列，并可促进颗粒细胞分泌孕酮[7]。卵巢体积的增大，需要有大量的ECM合成，同样也需要有ECM的降解。5d的小鼠卵巢已可见基质细胞及初级卵泡的颗粒细胞、膜细胞开始少量表达MMP-2和Ⅳ型胶原的mRNA，15d后它们在颗粒细胞的表达更是明显增加。提示卵泡发育的过程中胶原在进行积极地改建，胶原的合成和降解同时进行，但在发育期，合成功能可能更旺盛。
2～3个月左右，小鼠卵巢基本发育完全，处于较成熟相对稳定的阶段。由于每个动情周期中，都有若干卵泡发育、排卵、形成黄体或闭锁等，卵巢一直处于活跃状态。2～6个月卵巢中的膜细胞和颗粒细胞保持旺盛活力，卵巢基膜ECM成分和MMP-2的mRNA转录和蛋白翻译一直保持高水平，保证ECM的合成和降解处于动态变化中，卵泡发育时合成占优势，而临近排卵时降解占优势。小鼠性成熟期，Ⅳ型胶原的α1(Ⅳ)的mRNA含量在卵泡发育中一直保持高水平与在牛、猪和兔等卵巢中观察到的结果一致[8，9]。但牛的卵泡发育到大的次级卵泡阶段时，基膜的部分成分如α6(Ⅳ)丢失，Ⅳ型胶原的强度降低，LN的强度增高，基膜由Ⅳ型胶原丰富逐渐变为LN丰富。LN形成的网状结构没有Ⅳ型胶原形成的结构致密，可能更适应卵泡增大的需要[5，10]。我们的实验由于采用的是Ⅳ型胶原分子中含量最高的、最常见α1(Ⅳ)链以及Ⅳ型胶原和LN的多抗，未发现Ⅳ型胶原和LN间接免疫荧光强度随卵泡发育有明显变化。
, 百拇医药
12个月时卵巢开始退化，卵巢Ⅳ型胶原的mRNA表达量降低，Ⅳ型胶原和LN的荧光强度也有下降。但对于个别处于发育阶段的卵泡，Ⅳ型胶原的mRNA的合成仍很旺盛。
在小鼠的卵巢发育中Ⅳ型胶原和LN以及MMP-2的含量和分布随年龄的改变而发生着积极的改变，可能对卵泡发育起重要作用。
本文图1A～2B见插图第7页
【基金项目】高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(9704)
【作者简介】 钱晓菁(1972—)，女(汉族)，北京市人，医学硕士，助教
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
, 百拇医药
[1]Luck MR. The gonadal extracellular matrix[J]. Oxf Rev Reprod Bio,1994,16(1)：33-85.
[2]Kurkinen M, Condon MR, Blumberg B, et al. Extensive homology between the carboxyl-terminal peptides of mouse α1(Ⅳ) and α2(Ⅳ) collagen[J]. J Biol Chem, 1987,262(18):8496-8499.
[3]Reponen P, Sahlberg C, Huhtala P, et al. Molecular cloning of mouse 72-kDa type Ⅳ collagenase and its expression during mouse development[J]. J Biol Chem,1992,267(11)：7856-7862.
, 百拇医药
[4]苏慧慈，原位杂交[M]. 北京：中国科学技术出版社.1994：147～150.
[5]Yurchenco PD, Schittny JC. Molecular architecture of basement membranes[J]. FASEB J. 1990,4(6)：1577-1590.
[6]Rajah R, Sundaram GS. Protein distribution and gene expression of collagen type Ⅳ in the neonatal rat ovary during follicle formation[J]. Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),1994 Sep,40(6):769-780.
[7]肖娜，杨燕，贾孟春，等 卵泡基膜中Ⅳ型胶原、层粘连蛋白来源的初步探讨[J].生殖医学杂志，1996，5(3)：140～144.
, http://www.100md.com
[8]Rodgers HF, Irvine CM, V, Wezel IL, et al. Distribution of the α1 to α6 chains of type Ⅳ collagen in bovine follicles[J]. Biol Reprod,1998,59(6)：1334-1341.
[9]Lee VH, Britt JH, Dunbar BS. Localization of laminin proteins during early follicular development in pig and rabbit ovaries[J]. J Reprod Fertil, 1996 Sep,108(1):115-112.
[10]Van Wezel IL, Rodgers HF, Rodgers RJ. Differential localization of laminin chains in bovine follicles[J]. J Reprod Fertil,1998 Mar,112(2):267-278.
【收稿日期】1999-11-16 【修稿日期】2000-01-10, http://www.100md.com