去肾上腺大鼠垂体内IL-6水平的变化PCR定量技术的辅助分析
作者：徐平西 刘惠玲 邱建勇 许汉鹏 鞠躬
单位：徐平西(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032经；刘惠玲(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；邱建勇(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；许汉鹏(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；鞠躬(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)
关键词：去肾上腺；白细胞介素-6；聚合酶链反应；神经纤维；垂体前叶
解剖学报000304 【摘要】 目的 探测白细胞介素-6(IL-6)是否与垂体前叶中的神经纤维的营养效应有关。 方法 应用免疫组织化学和原位杂交技术对去肾上腺大鼠垂体中的IL-6表达进行形态观察，并试用两种微量PCR方法对同一组织中的IL-6进行蛋白水平和mRNA水平的定量检测。 结果 免疫组织化学分析，阳性物质主要存在于垂体前叶滤泡星形(FS)细胞中，但其含量变化却不甚清晰。PCR定量分析，IL-6在上述两个水平上的表达均有增加，且基因激活时间早于术后24h。 结论 IL-6变化与ACTH无关，可能参与下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴以外的垂体前叶功能调节的其他路径，譬如通过神经支配而发挥影响。
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【中图分类号】 Q523 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-207
ANALYSIS OF THE IL-6 EXPRESSION IN THE ANTERIOR
PITUITARY OF ADRENALECTOMIZED RATS
XU Ping-xi, LIU Hui-ling, QIU Jian-yong, XU Han-peng, JU Gong
(Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective To explore the relationship between IL-6 and an effect of neurotrophy on the nerve fibres in anterior pituitary. Methods To investigate the changes of IL-6 in the anterior pituitary of adrenalectomized rats,two PCR procedures,Immuno-PCR(I-PCR) and RT-PCR were modified to quantify antigen and mRNA in tiny samples respectively to supplement the morphometry,since morphoanalysis,immunocytochemistry and in situ hybridization seemed not efficient to show quantification. Results The most IL6-IL stainings were found to be gathered mainly in FS cell,and the levels of both protein and mRNA of IL-6 determined by PCRs rised obviously.Meanwhile,the activation of IL-6 gene occurred within 24h after adrenalectomy. Conclusion This study suggests that IL-6 might be involved in the regulation of the secretion of anterior pituitary in other way independent of PHA axis,such as neuro-regulation.
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【Key words】 Adrenalectomy; IL-6; PCR;Nerve fiber; Anterior pituitary
垂体前叶内肽能神经纤维的发现，尤其是去肾上腺后大鼠垂体前叶内肽能神经纤维的增生，揭示了它们与垂体前叶的功能联系[1]；进而为垂体前叶功能双重调节假说提供了强有力的依据。Lu和Paden等观察到去肾上腺大鼠垂体前叶内神经纤维有GAP43大量表达，表明这些神经增生至少部分由芽生所致。从理论上讲，上述变化必然涉及到神经营养因子活动。我们曾对BDNF、NGF和NT3神经生长因子作了系统的调查，均未获得相关结果。IL-6是一个多重生物学活性的细胞因子，具有神经营养作用；并且能为垂体前叶内FS细胞合成，因此它是否参与垂体前叶中的神经纤维生长的调节值得进一步研究。
IL-6在垂体前叶中的含量甚微，一般形态定量法揭示其确切变化有一定的难度。我们在形态学定位的基础上结合微量PCR法定量分析，对去肾上腺大鼠垂体前叶中IL-6表达进行动态观察，得到了满意的结果。
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材料和方法
1. 动物分组及手术
成年SD雄性大鼠30只，体重200～250g，1笼养5只，自由进食，每日昼夜光照为12h/12h。在安静环境中饲养1周，随机分为正常对照1组和双侧肾上腺切除5组。后者用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(40mg/kg)，在无菌条件下从肋脊角处摘除双侧肾上腺，术后给予生理盐水饲饮。
2. 取材
正常对照组及手术组术后1、2、3、4和5d动物在戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸，留取血清样品作免疫PCR测定用。然后经左心室插管至升主动脉。灌流100ml无菌生理盐水以洗净血液，取垂体前叶迅速冷冻保存，留作PCR及原位杂交用。原位杂交标本用恒冷箱切片机作冰冻连续切片，厚15μm。
3. 原位杂交法分析
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根据Northemann发表的大鼠IL-6 cDNA全序列[4]，于3′端截取42bp长度的片段，并合成寡核苷酸作为探针。探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim Biochemica)说明书操作。杂交的主要步骤：取出垂体切片，无酶状态下空气晾干约1h，浸入4%多聚甲醛固定20min，依次经浸洗、蛋白酶K(50mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步处理后，入杂交液(探针浓度为0.1mg/L)于42℃湿盒中孵育16h，其后分别经浓度递减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶5 000)室温作用0.5h，洗涤后加入新鲜配置显色液于室温下暗处显色。镜下观察至显色适度时，浸入蒸馏水中以终止反应。最后经系列乙醇脱水、二甲苯透明、封片。
4. PCR定量分析
4.1 微量免疫PCR(I-PCR)法)
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4.1.1 样品提取液制备：正常对照组及肾上腺切除术后4d手术组各5只，取垂体前叶置100μl的1%Triton X-100 0.05mol/L PBS(pH7.4)中，匀浆后以10kHz 5s×3超声破碎(Soniprep SANYO),离心(10000r/min)×10min，取上清紫外分光光度法定量，稀释提取液使蛋白浓度达到1g/L。
4.1.2 免疫PCR操作步骤：按徐平西等[5]建立的简易免疫PCR法，将上述提取液和1 000倍稀释后的血清20μl用戊二醛直接包被在洁净0.5毫升规格的聚乙烯PCR管内壁，空白对照管以1% BSA替代；以洗涤液(1%吐温20-PBS)洗涤3次，每次3min，依次加入1∶5 000稀释度的兔抗IL-6多克隆抗体20μl(由北京军事医学科学院沈倍奋教授惠赠)，室温下孵育3h,洗涤同上；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，洗涤液洗涤；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，室温下2h，洗涤液洗涤；加入链霉卵白素-报道模板DNA复合体20μl，置室温1h，洗涤液充分洗涤，最后以无离子水洗涤2次，拍尽残液。每管加入20μl标准PCR反应液，覆盖以矿物油，盖紧小管入PCR仪。聚合反应的温度参数为起始变性(94℃×2min)；20个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(56℃×40s)，延长(70℃×40s)；后置延长(72℃×5min)。取管内PCR产物5μl,行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外光下摄片，扫描灰度，分析结果。
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4.2 RT-PCR定量分析
4.2.1 引物设计：从方法3所述基因序列中，设计出欲扩增的大鼠IL-6 cDNA片段引物；此外设计3-磷酸葡萄糖脱氢酶(G3PDH)基因片段引物作为外参照系。
大鼠IL-6片段引物1：5′-GAG AAA AGA GTT GTG CAA TGG C-3′
大鼠IL-6片段引物2：5′-ACT AGG TTT GCC GAG TAG ACC-3′
扩增产物长度444bp。
大鼠G3PDH片段引物：5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′
大鼠G3PDH片段引物2：5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′
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扩增产物长度309bp。
4.2.2 总RNA的提取、定量：将正常及术后1、2、3、4及5d处理的单个大鼠垂体前叶按RNA提取盒(GIBCO公司)说明置入100μl TRIZOL Reagent试剂，以自制杵子在0.5ml离心管中碾匀后室温中静置5min。加入20μl氯仿剧烈振荡，室温停置3min，离心(4℃ 12 000g)15min，取上清水加入50μl异丙醇，混匀，置室温10min，离心(4℃ 12 000g)10min，沉淀用100μl 75%乙醇洗涤，空干，以17μl DEPC处理水溶解，再加入RNase free DNase，混匀，37℃消化0.5h；然后经酸性饱和酚抽提、沉淀、干燥及EDPC处理水溶解后，于紫外分光光度计定量，将RNA样品浓度稀释成500mg/L，备用。同时作RNA电泳以检验其完整性。
4.2.3 RT-PCR循环：精确吸取2μl RNA样品作模板加入标准20μl RT-PCR反应混合液(按PROMEGA公司说明书配制)，石蜡油封盖。反应参数为：反转录反应(48℃×45min)；起始变性(94℃×2min)；40个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(62℃×40s)，延长(68℃×40s)；后置延长(68℃×6min)。反应结束后取产物电泳、摄片。
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结果
1. 原位杂交
IL-6探针对垂体前叶切片杂交的地高辛-酶显色阳性细胞主要为FS样细胞，在分布上与免疫组织化学结果相似(图1)。然而细胞的灰度分析未能反映出肾上腺切除与正常对照的组间差异(P>0.05)。
2. PCR的量化分析
2.1 免疫PCR(I-PCR)：来自10只大鼠垂体蛋白提取液图2B和血清样品图2A，用阿拉伯数字编号，序号1～5为切除肾上腺组样品，6～10为正常对照组样品。免疫PCR产物经电泳、EB染色，灰度检测结果提示血清样品中两组间的IL-6浓度无明显改变，而垂体提取液样品显示出组间差异，其中手术组的2～4号样品的IL-6增加尤为明显(图2B)。提示去除肾上腺后引起垂体前叶内IL-6含量的显著变化(图2C)。
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图1 去肾上腺大鼠垂体前叶内IL-6原位杂交阳性结构。 ×300
IL-6免疫阳性细胞散在分布，形态多样，呈多边形、梭形、三角形
等，突起间有接触。与正常对照组比较，胞体面积及灰度无差别。
Fig.1 IL-6 in situ-hybridization positive structures of the anterior pituitary in the adrenalectomized rat. ×300
图2 免疫PCR法测定IL-6蛋白含量
1～5号为手术组(去肾上腺4d后)；6～10号为对照组；
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M为1kb DNA片段大小指示物
A:血清样品；B:垂体前叶提取液；
C:手术组与对照组IL-6含量之灰度值比较。
(n=5,表示P<0.01)
Fig.2 Change of the content of IL-6 in anterior
pituitary following ADX.
A,In serial example; B,In the extract of anterior pituitary;
C,Comparison of IL-6 concentration in AP between
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the ADX and the normal(n=5,P<0.01)
2.2 RT-PCR:垂体总RNA样品共30个，共分6组，分别是正常对照和术后1、2、3、4和5d，每组5只。用100bp DNA Mark标定PCR产物，确定其大小介于400～500bp之间，与设计的扩增片段长度吻合(图3A)。图3中阿拉伯数代表手术组术后的天数。灰度扫描提示，大鼠经双侧肾上腺切除后，垂体前叶中的IL-6转录水平于术后第1d显著提高，并持续至5d以后(图3A，3C)。G3PDH 引物以相同RNA样品作RT-PCR作为外参照系，结果产物电泳灰度均一恒定(图3B)，表明整个反应系统模板定量及操作规程精确可靠。
图3 RT-PCR法检测大鼠垂体前叶内IL-6mRNA含量的变化
0～5号分别表示术后0、1、2、3、4和5d的样品；M为100bp DNA片段大小指示物
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A：IL-6特异性引物；B：G3PDH引物；C：术后大鼠垂体前叶中IL-6 mRNA的变化
(n=5,与对照组0d比较，表示P<0.05；表示P<0.01)
Fig.3 Transcribing activity of IL-6 mRNA in anterior pituitary following ADX.
A，With IL-6 specific probe; B，With G3PDH probe as control.
C，Temporal change of IL-6 mRNA after ADX(n=5, P<0.05;P<0.01 compared with normal control)
讨论
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腺垂体功能的双向调节假说的提出，基于垂体前叶中的肽能神经纤维的存在以及与腺细胞间发生突触联系等证据[1]；而肾上腺摘除后垂体中GAP43表达增加及其特定亚群神经纤维的增生[2]，暗示垂体中的神经纤维生长必定有相应营养因子的支持。IL-6是一种多重生物活性的细胞因子[6]，体外表现出的神经营养作用，加之垂体前叶FS细胞能自行合成IL-6，使我们自然将其列为对垂体前叶中神经营养因子甄别的侯选分子。前期的免疫细胞化学研究结果显示，去肾上腺垂体前叶中IL-6免疫样阳性FS细胞数量明显增多、增深，并且形态多样，呈多边形、梭形、三角形和卵圆形等，细胞突起增多变长[7]。然而令人困扰的是，多次原位杂交结果却未能发现去肾上腺前后IL-6转录水平有相应的变化。其原因无非有下列可能：IL-6的变化不牵涉转录活性，主要在于翻译水平的调节；术后样品采集时间错过转录活跃期；原位杂交中DIG-酶显色在定量上的局限性；免疫细胞化学结果本身的偏差。
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为了澄清原因，我们特别改良了两种敏感而特异的微量PCR量化方法，即免疫PCR和RT-PCR，分别测定蛋白质和mRNA两个水平的表达。免疫PCR本质上是一种以PCR代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率的改进型ELISA。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出低至2ng/L浓度的抗原物质[8]。由于垂体前叶中表达IL-6的细胞数量太少(小于1%)[9]，一般ELISA方法难以测出。我们用这种改良的方法测定了切除肾上腺大鼠的垂体前叶和血清中的微量细胞因子IL-6，结果在3个垂体样品中浓度明显增加，而血清无改变。这一结果不仅验证了IL-6抗原物质增加的免疫组织化学的结果，同时也表明参与调节垂体功能的IL-6可以来源于垂体前叶自身。RT-PCR是通过反转录mRNA后再进行PCR指数扩增，使极微量的mRNA模板得以定量显现的技术。GIBCO公司推出的TRIZOL Reagent试剂使RNA的微量提取成为可能。用重量不到8mg大鼠垂体前叶提取了足够量的总RNA，成功地进行了RT-PCR的定量扩增。大鼠切除肾上腺后血清中的ACTH浓度变化存在3个时相，其中持续升高相多发生在术后92h[10]，并且能为CRH抗血清所阻断，而之前出现的高峰与血浆中的皮质酮并无反馈关联[11]。RT-PCR结果显示去肾上腺后垂体前叶中的IL-6转录活性早在术后24h内就已被激活，这种时相上的差异提示IL-6作用可能独立于HPA轴的调控环路。IL-6具有营养神经细胞的特性，其变化与垂体前叶中的神经纤维的消长存在的时相上重叠。是否与垂体功能的神经调节相关，尚需进一步实验证据。
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形态计量学是生物形态定量研究中常用的分析手段。由于样品显现灰度的稳定性、样本量不足和抽样制样方法以及人为主观判断的可信度诸方面的因素，削弱了定量效率[12]。形态学不能显示的差异，常常是疏漏有意义结果的原因。在本研究中我们用PCR定量技术辅助分析形态学所得结果，不仅用不同方法对量的变化加以证实，而且还显示出形态学方法本身所不能呈现的微量变化。PCR微量定量方法所需样品量少，可以在同一样品上取样而不影响形态学观察；并且每一个体样品可以作为独立的数据，使统计处理更具效率。当然，以PCR辅助形态学分析有一定的设备条件和技术方法上的限制，然而在目前用来弥补形态计量学上不足，仍不失为一个便捷有效的途径。
【作者简介】 徐平西(1959—)，男(汉族)，江苏人，博士学位，讲师
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
, 百拇医药 参考文献
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【收稿日期】1999-05-07 【修稿日期】2000-01-25, 百拇医药
单位：徐平西(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032经；刘惠玲(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；邱建勇(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；许汉鹏(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)；鞠躬(第四军医大学神经科学研究所，西安 710032)
关键词：去肾上腺；白细胞介素-6；聚合酶链反应；神经纤维；垂体前叶
解剖学报000304 【摘要】 目的 探测白细胞介素-6(IL-6)是否与垂体前叶中的神经纤维的营养效应有关。 方法 应用免疫组织化学和原位杂交技术对去肾上腺大鼠垂体中的IL-6表达进行形态观察，并试用两种微量PCR方法对同一组织中的IL-6进行蛋白水平和mRNA水平的定量检测。 结果 免疫组织化学分析，阳性物质主要存在于垂体前叶滤泡星形(FS)细胞中，但其含量变化却不甚清晰。PCR定量分析，IL-6在上述两个水平上的表达均有增加，且基因激活时间早于术后24h。 结论 IL-6变化与ACTH无关，可能参与下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴以外的垂体前叶功能调节的其他路径，譬如通过神经支配而发挥影响。
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【中图分类号】 Q523 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-207
ANALYSIS OF THE IL-6 EXPRESSION IN THE ANTERIOR
PITUITARY OF ADRENALECTOMIZED RATS
XU Ping-xi, LIU Hui-ling, QIU Jian-yong, XU Han-peng, JU Gong
(Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032,China)
【Abstract】 Objective To explore the relationship between IL-6 and an effect of neurotrophy on the nerve fibres in anterior pituitary. Methods To investigate the changes of IL-6 in the anterior pituitary of adrenalectomized rats,two PCR procedures,Immuno-PCR(I-PCR) and RT-PCR were modified to quantify antigen and mRNA in tiny samples respectively to supplement the morphometry,since morphoanalysis,immunocytochemistry and in situ hybridization seemed not efficient to show quantification. Results The most IL6-IL stainings were found to be gathered mainly in FS cell,and the levels of both protein and mRNA of IL-6 determined by PCRs rised obviously.Meanwhile,the activation of IL-6 gene occurred within 24h after adrenalectomy. Conclusion This study suggests that IL-6 might be involved in the regulation of the secretion of anterior pituitary in other way independent of PHA axis,such as neuro-regulation.
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【Key words】 Adrenalectomy; IL-6; PCR;Nerve fiber; Anterior pituitary
垂体前叶内肽能神经纤维的发现，尤其是去肾上腺后大鼠垂体前叶内肽能神经纤维的增生，揭示了它们与垂体前叶的功能联系[1]；进而为垂体前叶功能双重调节假说提供了强有力的依据。Lu和Paden等观察到去肾上腺大鼠垂体前叶内神经纤维有GAP43大量表达，表明这些神经增生至少部分由芽生所致。从理论上讲，上述变化必然涉及到神经营养因子活动。我们曾对BDNF、NGF和NT3神经生长因子作了系统的调查，均未获得相关结果。IL-6是一个多重生物学活性的细胞因子，具有神经营养作用；并且能为垂体前叶内FS细胞合成，因此它是否参与垂体前叶中的神经纤维生长的调节值得进一步研究。
IL-6在垂体前叶中的含量甚微，一般形态定量法揭示其确切变化有一定的难度。我们在形态学定位的基础上结合微量PCR法定量分析，对去肾上腺大鼠垂体前叶中IL-6表达进行动态观察，得到了满意的结果。
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材料和方法
1. 动物分组及手术
成年SD雄性大鼠30只，体重200～250g，1笼养5只，自由进食，每日昼夜光照为12h/12h。在安静环境中饲养1周，随机分为正常对照1组和双侧肾上腺切除5组。后者用戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(40mg/kg)，在无菌条件下从肋脊角处摘除双侧肾上腺，术后给予生理盐水饲饮。
2. 取材
正常对照组及手术组术后1、2、3、4和5d动物在戊巴比妥钠腹腔麻醉下开胸，留取血清样品作免疫PCR测定用。然后经左心室插管至升主动脉。灌流100ml无菌生理盐水以洗净血液，取垂体前叶迅速冷冻保存，留作PCR及原位杂交用。原位杂交标本用恒冷箱切片机作冰冻连续切片，厚15μm。
3. 原位杂交法分析
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根据Northemann发表的大鼠IL-6 cDNA全序列[4]，于3′端截取42bp长度的片段，并合成寡核苷酸作为探针。探针标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim Biochemica)说明书操作。杂交的主要步骤：取出垂体切片，无酶状态下空气晾干约1h，浸入4%多聚甲醛固定20min，依次经浸洗、蛋白酶K(50mg/L)消化、4%多聚甲醛再固定、0.25%乙酸酐封闭等10余步处理后，入杂交液(探针浓度为0.1mg/L)于42℃湿盒中孵育16h，其后分别经浓度递减的系列标准枸橼酸盐溶液(SSC)漂洗，再入地高辛抗体工作液(1∶5 000)室温作用0.5h，洗涤后加入新鲜配置显色液于室温下暗处显色。镜下观察至显色适度时，浸入蒸馏水中以终止反应。最后经系列乙醇脱水、二甲苯透明、封片。
4. PCR定量分析
4.1 微量免疫PCR(I-PCR)法)
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4.1.1 样品提取液制备：正常对照组及肾上腺切除术后4d手术组各5只，取垂体前叶置100μl的1%Triton X-100 0.05mol/L PBS(pH7.4)中，匀浆后以10kHz 5s×3超声破碎(Soniprep SANYO),离心(10000r/min)×10min，取上清紫外分光光度法定量，稀释提取液使蛋白浓度达到1g/L。
4.1.2 免疫PCR操作步骤：按徐平西等[5]建立的简易免疫PCR法，将上述提取液和1 000倍稀释后的血清20μl用戊二醛直接包被在洁净0.5毫升规格的聚乙烯PCR管内壁，空白对照管以1% BSA替代；以洗涤液(1%吐温20-PBS)洗涤3次，每次3min，依次加入1∶5 000稀释度的兔抗IL-6多克隆抗体20μl(由北京军事医学科学院沈倍奋教授惠赠)，室温下孵育3h,洗涤同上；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，洗涤液洗涤；加入1∶500稀释度的生物素化羊抗兔抗体20μl(Sigma公司)，室温下2h，洗涤液洗涤；加入链霉卵白素-报道模板DNA复合体20μl，置室温1h，洗涤液充分洗涤，最后以无离子水洗涤2次，拍尽残液。每管加入20μl标准PCR反应液，覆盖以矿物油，盖紧小管入PCR仪。聚合反应的温度参数为起始变性(94℃×2min)；20个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(56℃×40s)，延长(70℃×40s)；后置延长(72℃×5min)。取管内PCR产物5μl,行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。紫外光下摄片，扫描灰度，分析结果。
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4.2 RT-PCR定量分析
4.2.1 引物设计：从方法3所述基因序列中，设计出欲扩增的大鼠IL-6 cDNA片段引物；此外设计3-磷酸葡萄糖脱氢酶(G3PDH)基因片段引物作为外参照系。
大鼠IL-6片段引物1：5′-GAG AAA AGA GTT GTG CAA TGG C-3′
大鼠IL-6片段引物2：5′-ACT AGG TTT GCC GAG TAG ACC-3′
扩增产物长度444bp。
大鼠G3PDH片段引物：5′-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3′
大鼠G3PDH片段引物2：5′-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3′
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扩增产物长度309bp。
4.2.2 总RNA的提取、定量：将正常及术后1、2、3、4及5d处理的单个大鼠垂体前叶按RNA提取盒(GIBCO公司)说明置入100μl TRIZOL Reagent试剂，以自制杵子在0.5ml离心管中碾匀后室温中静置5min。加入20μl氯仿剧烈振荡，室温停置3min，离心(4℃ 12 000g)15min，取上清水加入50μl异丙醇，混匀，置室温10min，离心(4℃ 12 000g)10min，沉淀用100μl 75%乙醇洗涤，空干，以17μl DEPC处理水溶解，再加入RNase free DNase，混匀，37℃消化0.5h；然后经酸性饱和酚抽提、沉淀、干燥及EDPC处理水溶解后，于紫外分光光度计定量，将RNA样品浓度稀释成500mg/L，备用。同时作RNA电泳以检验其完整性。
4.2.3 RT-PCR循环：精确吸取2μl RNA样品作模板加入标准20μl RT-PCR反应混合液(按PROMEGA公司说明书配制)，石蜡油封盖。反应参数为：反转录反应(48℃×45min)；起始变性(94℃×2min)；40个PCR循环：变性(94℃×30s)，退火(62℃×40s)，延长(68℃×40s)；后置延长(68℃×6min)。反应结束后取产物电泳、摄片。
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结果
1. 原位杂交
IL-6探针对垂体前叶切片杂交的地高辛-酶显色阳性细胞主要为FS样细胞，在分布上与免疫组织化学结果相似(图1)。然而细胞的灰度分析未能反映出肾上腺切除与正常对照的组间差异(P>0.05)。
2. PCR的量化分析
2.1 免疫PCR(I-PCR)：来自10只大鼠垂体蛋白提取液图2B和血清样品图2A，用阿拉伯数字编号，序号1～5为切除肾上腺组样品，6～10为正常对照组样品。免疫PCR产物经电泳、EB染色，灰度检测结果提示血清样品中两组间的IL-6浓度无明显改变，而垂体提取液样品显示出组间差异，其中手术组的2～4号样品的IL-6增加尤为明显(图2B)。提示去除肾上腺后引起垂体前叶内IL-6含量的显著变化(图2C)。
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图1 去肾上腺大鼠垂体前叶内IL-6原位杂交阳性结构。 ×300
IL-6免疫阳性细胞散在分布，形态多样，呈多边形、梭形、三角形
等，突起间有接触。与正常对照组比较，胞体面积及灰度无差别。
Fig.1 IL-6 in situ-hybridization positive structures of the anterior pituitary in the adrenalectomized rat. ×300
图2 免疫PCR法测定IL-6蛋白含量
1～5号为手术组(去肾上腺4d后)；6～10号为对照组；
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M为1kb DNA片段大小指示物
A:血清样品；B:垂体前叶提取液；
C:手术组与对照组IL-6含量之灰度值比较。
(n=5,表示P<0.01)
Fig.2 Change of the content of IL-6 in anterior
pituitary following ADX.
A,In serial example; B,In the extract of anterior pituitary;
C,Comparison of IL-6 concentration in AP between
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the ADX and the normal(n=5,P<0.01)
2.2 RT-PCR:垂体总RNA样品共30个，共分6组，分别是正常对照和术后1、2、3、4和5d，每组5只。用100bp DNA Mark标定PCR产物，确定其大小介于400～500bp之间，与设计的扩增片段长度吻合(图3A)。图3中阿拉伯数代表手术组术后的天数。灰度扫描提示，大鼠经双侧肾上腺切除后，垂体前叶中的IL-6转录水平于术后第1d显著提高，并持续至5d以后(图3A，3C)。G3PDH 引物以相同RNA样品作RT-PCR作为外参照系，结果产物电泳灰度均一恒定(图3B)，表明整个反应系统模板定量及操作规程精确可靠。
图3 RT-PCR法检测大鼠垂体前叶内IL-6mRNA含量的变化
0～5号分别表示术后0、1、2、3、4和5d的样品；M为100bp DNA片段大小指示物
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A：IL-6特异性引物；B：G3PDH引物；C：术后大鼠垂体前叶中IL-6 mRNA的变化
(n=5,与对照组0d比较，表示P<0.05；表示P<0.01)
Fig.3 Transcribing activity of IL-6 mRNA in anterior pituitary following ADX.
A，With IL-6 specific probe; B，With G3PDH probe as control.
C，Temporal change of IL-6 mRNA after ADX(n=5, P<0.05;P<0.01 compared with normal control)
讨论
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腺垂体功能的双向调节假说的提出，基于垂体前叶中的肽能神经纤维的存在以及与腺细胞间发生突触联系等证据[1]；而肾上腺摘除后垂体中GAP43表达增加及其特定亚群神经纤维的增生[2]，暗示垂体中的神经纤维生长必定有相应营养因子的支持。IL-6是一种多重生物活性的细胞因子[6]，体外表现出的神经营养作用，加之垂体前叶FS细胞能自行合成IL-6，使我们自然将其列为对垂体前叶中神经营养因子甄别的侯选分子。前期的免疫细胞化学研究结果显示，去肾上腺垂体前叶中IL-6免疫样阳性FS细胞数量明显增多、增深，并且形态多样，呈多边形、梭形、三角形和卵圆形等，细胞突起增多变长[7]。然而令人困扰的是，多次原位杂交结果却未能发现去肾上腺前后IL-6转录水平有相应的变化。其原因无非有下列可能：IL-6的变化不牵涉转录活性，主要在于翻译水平的调节；术后样品采集时间错过转录活跃期；原位杂交中DIG-酶显色在定量上的局限性；免疫细胞化学结果本身的偏差。
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为了澄清原因，我们特别改良了两种敏感而特异的微量PCR量化方法，即免疫PCR和RT-PCR，分别测定蛋白质和mRNA两个水平的表达。免疫PCR本质上是一种以PCR代替酶反应来放大显示抗原抗体结合率的改进型ELISA。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出低至2ng/L浓度的抗原物质[8]。由于垂体前叶中表达IL-6的细胞数量太少(小于1%)[9]，一般ELISA方法难以测出。我们用这种改良的方法测定了切除肾上腺大鼠的垂体前叶和血清中的微量细胞因子IL-6，结果在3个垂体样品中浓度明显增加，而血清无改变。这一结果不仅验证了IL-6抗原物质增加的免疫组织化学的结果，同时也表明参与调节垂体功能的IL-6可以来源于垂体前叶自身。RT-PCR是通过反转录mRNA后再进行PCR指数扩增，使极微量的mRNA模板得以定量显现的技术。GIBCO公司推出的TRIZOL Reagent试剂使RNA的微量提取成为可能。用重量不到8mg大鼠垂体前叶提取了足够量的总RNA，成功地进行了RT-PCR的定量扩增。大鼠切除肾上腺后血清中的ACTH浓度变化存在3个时相，其中持续升高相多发生在术后92h[10]，并且能为CRH抗血清所阻断，而之前出现的高峰与血浆中的皮质酮并无反馈关联[11]。RT-PCR结果显示去肾上腺后垂体前叶中的IL-6转录活性早在术后24h内就已被激活，这种时相上的差异提示IL-6作用可能独立于HPA轴的调控环路。IL-6具有营养神经细胞的特性，其变化与垂体前叶中的神经纤维的消长存在的时相上重叠。是否与垂体功能的神经调节相关，尚需进一步实验证据。
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形态计量学是生物形态定量研究中常用的分析手段。由于样品显现灰度的稳定性、样本量不足和抽样制样方法以及人为主观判断的可信度诸方面的因素，削弱了定量效率[12]。形态学不能显示的差异，常常是疏漏有意义结果的原因。在本研究中我们用PCR定量技术辅助分析形态学所得结果，不仅用不同方法对量的变化加以证实，而且还显示出形态学方法本身所不能呈现的微量变化。PCR微量定量方法所需样品量少，可以在同一样品上取样而不影响形态学观察；并且每一个体样品可以作为独立的数据，使统计处理更具效率。当然，以PCR辅助形态学分析有一定的设备条件和技术方法上的限制，然而在目前用来弥补形态计量学上不足，仍不失为一个便捷有效的途径。
【作者简介】 徐平西(1959—)，男(汉族)，江苏人，博士学位，讲师
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
, 百拇医药 参考文献
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【收稿日期】1999-05-07 【修稿日期】2000-01-25, 百拇医药
参见：首页 > 医疗版 > 疾病专题 > 内分泌科 > 下丘脑-垂体疾病 > 垂体前叶机能减退症