一组毛囊真皮乳头细胞的单克隆抗体
作者：杨恬 向明明
单位：杨恬(第三军医大学细胞生物学教研室)；向明明(西南医院皮肤科，重庆 400038)
关键词：毛囊；真皮乳头；单克隆抗体
解剖学报000322 【摘要】 目的 研究真皮乳头细胞(DP)在毛发的生长和细胞分化中的作用。 方法 细胞培养、单克隆抗体和激光共聚焦显微技术。结果 发现一组能识别毛囊某些特异细胞类型和区域的单克隆抗体，其中一个为毛囊干细胞——隆突细胞的标记物。 结论 为鉴定和分离毛囊特异性的细胞群体以及对毛囊周期调控途径和毛囊干细胞的研究提供了基础。
【中图分类号】 R392.11 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-277
A GROUP OF MONOCLONAL ANTIBODIES OF
, http://www.100md.com
DERMAL PAPILLARY CELLS OF HAIR FOLLICLE
YANG Tian XIANG Ming-ming
Department of Cell Biology
Department of Dermatology of the Southwestern Hospital,the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
【Abstract】 Objective To investigate the functions of dermal papillary cell(DP) in the regulation processes of hair growth and differentiation. Methods The techniques of cell culture, monoclonal antibody and Laser Co-focus light microscopy were used. Results A set of mAbs that recognized surface antigens on cells that comprise specific regions or cells of hair follicle were developed and characterized, one of which marked the Bulge cell, which is the stem cell of hair follicle according to the recent papers. Conclusion The result in this study will be helpful in purification, identification, and characterization of different cell types of hair follicle and elucidation the features of hair stem cell and factors that regulate different phases of hair cycle.
, 百拇医药
【Key words】 Hair follicle; Dermal papilla; Monoclonal antibody
人和哺乳动物的毛囊周期是细胞分化、组织发育和再生过程的一个非常有意义的研究模型。虽然调节毛囊进入各期的信号尚不清楚，但是，已知其角质形成细胞(KC)和真皮乳头的间充质细胞即真皮乳头细胞(dermal papillary cell, DP)之间的双向信息交流和相互诱导活动相当频繁并呈周期性改变。但是，由于迄今缺乏毛囊分化的过程的分子标记物，毛囊周期调控因子的特化以及毛囊上皮/间充质相互关系研究难以取得重大进展。
本研究的目的是寻找和研究可识别大鼠毛囊各特异细胞类型的单克隆抗体，希望为特化毛囊的重要细胞表面，鉴定和分离毛囊特异性的细胞群体和对毛囊周期调控途径、毛囊干细胞的研究提供基础。
材料和方法
, 百拇医药 1.免疫原的制备和免疫过程
按我们[1]改进的方法从10只3月龄雄性Wistar大鼠(Charles River Lab)分离出毛囊DP，并培养在本实验室标准的含Chang液的毛囊培养液中，4～7d后待培养的DP汇合后传代[1]。用同样方法培养大鼠真皮成纤维细胞(Fb)备用。取培养的第2代DP经胰酶消化，加入PBS为单细胞悬液(6×107/次)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(雄性，2只)，两个月中共5次，最后1次倍量加强免疫。定期测定免疫小鼠的血清效价。最后一次免疫后第3d，按单抗标准方法进行细胞融合。制备小鼠脾淋巴细胞悬液，同鼠Sp2/0杂交瘤细胞按4∶1比例在50%的PEG1450(JT Baker Chemical Co)1ml中混合，融合后的细胞被移入含有HAT培养液(DME，15%热失活FBS，10%NU血清，100μmol/L hypoxanthine,40nmol/L aminopterin,16μmol/L thymidine, 100μmol/L gentamicin)的96孔板中培养。
, 百拇医药
2.单克隆抗体的筛选和研究[2]
采用双重免疫细胞化学法筛选相应的单克隆抗体。第1次用96孔板中培养的Fb为对照，用免疫细胞化学法筛选出DP阳性的克隆；第2次用大鼠冰冻皮肤组织切片的免疫细胞化学法筛选出感兴趣的单克隆抗体。产生特异性的杂交瘤细胞按常规方法被限制性稀释法再克隆3～4次以获得稳定的克隆。
筛选出的单克隆抗体作了荧光染色和激光共聚焦扫描观察。
结果和讨论
关于DP的分离和培养，文献中有多种方法，但实践的结果均不理想。我们改良了DP的分离和原代培养法[1]，DP生长良好，4～7d汇合，传代后生长速度加快。对照的真皮Fb生长正常。
本实验中筛选的90%的以上的克隆均呈DP和Fb阳性，这也证实了同为间充质起源这两类细胞的共性。以下3种单克隆抗体具有毛囊细胞的类型特异性：
, http://www.100md.com
RT37：为DP阳性的单抗，镜下可见毛囊纵切面上整个DP均匀呈阳性染色，无极性分布。阳性反应物见于DP表面。RT37也同时显示毛囊中下部(从毛囊的皮脂腺下方起到毛球基部)的结缔组织鞘细胞，鞘外的真皮Fb也有阳性染色(图1)。
WE65：特异性地显示毛囊的毛母质细胞(matrix cell)，镜下可见紧邻DP上方的全部毛母质细胞均呈强阳性染色，染色均匀，位于细胞表面。同时，下1/2的外根鞘(ORS)的全部鞘细胞呈稍淡的阳性染色，但毛囊上1/2的鞘细胞无阳性反应(图2)。
H4：仅染毛囊的隆突(Bulge)区域，皮肤和毛囊的其他结构均未被染色。荧光染色高倍镜下可见毛囊上段的Bulge的所有ORS细胞表面均呈强阳性染色(图3及其插图)，提示H4所结合的是细胞表面抗原。光镜和激光共聚焦研究发现，大鼠的Bulge为ORS细胞在皮脂腺和立毛肌间的一团突起，包绕此段毛发，H4显示整个Bulge细胞的分布，上部Bulge细胞较少，下部较多，阳性染色在细胞表面，较强、均匀，胞质内未见阳性反应(图4)。小鼠毛囊H4染色同上。
, 百拇医药
毛囊是由6～8种不同类型的细胞组成成层的同心圆结构，在毛囊的周期的不同时期中，DP有明显的形态学、生物化学和位置的变化，被认为是毛发生长和毛囊周期的重要调控部件[3]。
关于毛囊DP的单克隆抗体研究很少，至今尚未有DP特异性的单抗。本研究的大鼠DP单抗显示表面抗原，不与细胞骨架成分反应，而且对体内和体外培养的同样细胞类型均有标记特异性。
RT37显示大鼠的DP，同时也显示毛囊的结缔组织鞘细胞和鞘外的真皮Fb。这提示DP和Fb由于其共同起源而具有相当多的分子水平的共性，这也是寻找DP特异性的标记物的难点所在。
WE65强染毛母质细胞，也显示毛囊中下部的ORS细胞，但邻近的DP、内外根鞘细胞和周围的结缔组织细胞以及皮肤中的其他细胞(内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、脂肪细胞、表皮KC等)均为阴性反应。WE65的意义在于新近的研究表明毛母质细胞可能是毛囊生长和分化的TA细胞，即短暂扩增细胞(transient amplifying cell)[3]。
, 百拇医药
H4是毛囊Bulge区的特异性单抗。它仅显示完整的毛囊的Bulge区域，皮肤和毛囊的其他所有结构均无免疫细胞化学阳性染色，因此是Bulge细胞的特异性分子标记物。Bulge是毛囊皮脂腺部ORS的环形膨大，以往的研究曾发现多种动物和人的毛囊具有Bulge区，但一直无法在形态学上证实大鼠存在该区。研究证明，Bulge细胞具有正常慢循环性(slowcycling)、生物化学和超微结构等的原始性和未分化性。新近的毛囊干细胞的“隆突激活假说”(bulge activation hypothesis)指出，虽然成熟毛囊的形成涉及到20多种细胞群体，但Bulge细胞和DP对于维持正常的毛囊周期是最必要的，它们之间的相互诱导合作活动是大量的和重要的；Bulge细胞是毛囊的干细胞[3]。
“隆突激活假说”近来得到越来越多的实验证据的支持，并形成了表皮、皮脂腺和毛囊可能有共同的Bulge干细胞来源的“表皮-毛囊-皮脂腺单位(epidermopilosebaceous unit)学说”[4]。研究证明，不同的致癌剂和移植实验提示皮肤癌发生与毛囊密切有关；毛囊结构是表皮肿瘤的主要来源。已知肿瘤发生主要涉及到长寿的细胞群体(干细胞)，因此最近关于毛囊周期中表皮和真皮之间的相互作用和皮肤癌的研究重点集中于拟议的毛囊干细胞的Bulge区域[5]。
, 百拇医药
H4单克隆抗体的发现可能有以下意义：1.确认了Bulge存在的普遍性；2.是目前唯一的毛囊Bulge细胞的标记物；3.提示Bulge细胞虽然属于KC，但它明显的在生物学性质上不同于其他的皮肤和毛囊的KC。本研究结果明显有利于“隆突激活假说”，并对纯化、鉴定和特化毛囊细胞的前体到最终分化的皮肤和毛囊细胞以及对于阐明这些过程的调节因子有一定的价值。
图版说明
图1 单克隆抗体RT37在6μm冰冻切片的免疫细胞化学染色。示毛囊DP呈均匀阳性染色。RT37也同时显示毛囊中下部的结缔组织鞘细胞，鞘外的真皮成纤维细胞也有阳性染色。标记示20μm。
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图2 单克隆抗体WE65，6μm冰冻切片，免疫细胞化学染色。示毛囊的毛母质细胞和ORS的鞘细胞呈阳性染色。标记示20μm。
图3 冰冻切片免疫荧光染色示单克隆抗体H4。H4仅染毛囊的Bulge区域，皮肤和毛囊的其他结构均未染色。荧光染色高倍镜下(右上插图)可见毛囊上段的Bulge的细胞表面呈强阳性染色。
图4 单克隆抗体H4的一组激光共聚焦图片。示大鼠毛囊的一个完整的Bulge的H4的分布。80 UHAFZ3，Zoom 1.2，Accumulate 12,F=1
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39870690)
【作者简介】 杨恬(1947—)，男(汉族)，重庆市人，医学博士，教授(博士生导师)
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
, http://www.100md.com
参考文献
[1]DW Yu, Yang T, Sohoda T, et al. Message of nexin 1, a serine protease inhibitor, is accumulated in the follicular papilla during anagen of the hair cycle[J]. J Cell Sci, 1995,108(5):3867.
[2]Harlow E, Lane D. Antibodies. A Laboratory Manual[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1988:237-285.
[3]Wilson C, Sun T T, Lavker RM. Cells in the buldge of the mouse telogen follicle give rise to the lower anagen follicle[J]. Skin Pharma,1994,7(1):8-11.
, 百拇医药
[4]Cotsarelis G,Sun T T,Lavker R M, et al. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit:implicationfor follicular setm cells hair cycle and skin carcinogenesis[J]. Cell,1990,61(6):1329-1337.
[5]Lavker RM. Hair follicle stem cells:their location, role in hair cycle, and involvemrnt in tumor fomation[J]. J Invest Derm, 1993,101(1):16-25.
【收稿日期】1999-03-26 【修稿日期】1999-08-27, 百拇医药
单位：杨恬(第三军医大学细胞生物学教研室)；向明明(西南医院皮肤科，重庆 400038)
关键词：毛囊；真皮乳头；单克隆抗体
解剖学报000322 【摘要】 目的 研究真皮乳头细胞(DP)在毛发的生长和细胞分化中的作用。 方法 细胞培养、单克隆抗体和激光共聚焦显微技术。结果 发现一组能识别毛囊某些特异细胞类型和区域的单克隆抗体，其中一个为毛囊干细胞——隆突细胞的标记物。 结论 为鉴定和分离毛囊特异性的细胞群体以及对毛囊周期调控途径和毛囊干细胞的研究提供了基础。
【中图分类号】 R392.11 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-277
A GROUP OF MONOCLONAL ANTIBODIES OF
, http://www.100md.com
DERMAL PAPILLARY CELLS OF HAIR FOLLICLE
YANG Tian XIANG Ming-ming
Department of Cell Biology
Department of Dermatology of the Southwestern Hospital,the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
【Abstract】 Objective To investigate the functions of dermal papillary cell(DP) in the regulation processes of hair growth and differentiation. Methods The techniques of cell culture, monoclonal antibody and Laser Co-focus light microscopy were used. Results A set of mAbs that recognized surface antigens on cells that comprise specific regions or cells of hair follicle were developed and characterized, one of which marked the Bulge cell, which is the stem cell of hair follicle according to the recent papers. Conclusion The result in this study will be helpful in purification, identification, and characterization of different cell types of hair follicle and elucidation the features of hair stem cell and factors that regulate different phases of hair cycle.
, 百拇医药
【Key words】 Hair follicle; Dermal papilla; Monoclonal antibody
人和哺乳动物的毛囊周期是细胞分化、组织发育和再生过程的一个非常有意义的研究模型。虽然调节毛囊进入各期的信号尚不清楚，但是，已知其角质形成细胞(KC)和真皮乳头的间充质细胞即真皮乳头细胞(dermal papillary cell, DP)之间的双向信息交流和相互诱导活动相当频繁并呈周期性改变。但是，由于迄今缺乏毛囊分化的过程的分子标记物，毛囊周期调控因子的特化以及毛囊上皮/间充质相互关系研究难以取得重大进展。
本研究的目的是寻找和研究可识别大鼠毛囊各特异细胞类型的单克隆抗体，希望为特化毛囊的重要细胞表面，鉴定和分离毛囊特异性的细胞群体和对毛囊周期调控途径、毛囊干细胞的研究提供基础。
材料和方法
, 百拇医药 1.免疫原的制备和免疫过程
按我们[1]改进的方法从10只3月龄雄性Wistar大鼠(Charles River Lab)分离出毛囊DP，并培养在本实验室标准的含Chang液的毛囊培养液中，4～7d后待培养的DP汇合后传代[1]。用同样方法培养大鼠真皮成纤维细胞(Fb)备用。取培养的第2代DP经胰酶消化，加入PBS为单细胞悬液(6×107/次)作为免疫原免疫BALB/c小鼠(雄性，2只)，两个月中共5次，最后1次倍量加强免疫。定期测定免疫小鼠的血清效价。最后一次免疫后第3d，按单抗标准方法进行细胞融合。制备小鼠脾淋巴细胞悬液，同鼠Sp2/0杂交瘤细胞按4∶1比例在50%的PEG1450(JT Baker Chemical Co)1ml中混合，融合后的细胞被移入含有HAT培养液(DME，15%热失活FBS，10%NU血清，100μmol/L hypoxanthine,40nmol/L aminopterin,16μmol/L thymidine, 100μmol/L gentamicin)的96孔板中培养。
, 百拇医药
2.单克隆抗体的筛选和研究[2]
采用双重免疫细胞化学法筛选相应的单克隆抗体。第1次用96孔板中培养的Fb为对照，用免疫细胞化学法筛选出DP阳性的克隆；第2次用大鼠冰冻皮肤组织切片的免疫细胞化学法筛选出感兴趣的单克隆抗体。产生特异性的杂交瘤细胞按常规方法被限制性稀释法再克隆3～4次以获得稳定的克隆。
筛选出的单克隆抗体作了荧光染色和激光共聚焦扫描观察。
结果和讨论
关于DP的分离和培养，文献中有多种方法，但实践的结果均不理想。我们改良了DP的分离和原代培养法[1]，DP生长良好，4～7d汇合，传代后生长速度加快。对照的真皮Fb生长正常。
本实验中筛选的90%的以上的克隆均呈DP和Fb阳性，这也证实了同为间充质起源这两类细胞的共性。以下3种单克隆抗体具有毛囊细胞的类型特异性：
, http://www.100md.com
RT37：为DP阳性的单抗，镜下可见毛囊纵切面上整个DP均匀呈阳性染色，无极性分布。阳性反应物见于DP表面。RT37也同时显示毛囊中下部(从毛囊的皮脂腺下方起到毛球基部)的结缔组织鞘细胞，鞘外的真皮Fb也有阳性染色(图1)。
WE65：特异性地显示毛囊的毛母质细胞(matrix cell)，镜下可见紧邻DP上方的全部毛母质细胞均呈强阳性染色，染色均匀，位于细胞表面。同时，下1/2的外根鞘(ORS)的全部鞘细胞呈稍淡的阳性染色，但毛囊上1/2的鞘细胞无阳性反应(图2)。
H4：仅染毛囊的隆突(Bulge)区域，皮肤和毛囊的其他结构均未被染色。荧光染色高倍镜下可见毛囊上段的Bulge的所有ORS细胞表面均呈强阳性染色(图3及其插图)，提示H4所结合的是细胞表面抗原。光镜和激光共聚焦研究发现，大鼠的Bulge为ORS细胞在皮脂腺和立毛肌间的一团突起，包绕此段毛发，H4显示整个Bulge细胞的分布，上部Bulge细胞较少，下部较多，阳性染色在细胞表面，较强、均匀，胞质内未见阳性反应(图4)。小鼠毛囊H4染色同上。
, 百拇医药
毛囊是由6～8种不同类型的细胞组成成层的同心圆结构，在毛囊的周期的不同时期中，DP有明显的形态学、生物化学和位置的变化，被认为是毛发生长和毛囊周期的重要调控部件[3]。
关于毛囊DP的单克隆抗体研究很少，至今尚未有DP特异性的单抗。本研究的大鼠DP单抗显示表面抗原，不与细胞骨架成分反应，而且对体内和体外培养的同样细胞类型均有标记特异性。
RT37显示大鼠的DP，同时也显示毛囊的结缔组织鞘细胞和鞘外的真皮Fb。这提示DP和Fb由于其共同起源而具有相当多的分子水平的共性，这也是寻找DP特异性的标记物的难点所在。
WE65强染毛母质细胞，也显示毛囊中下部的ORS细胞，但邻近的DP、内外根鞘细胞和周围的结缔组织细胞以及皮肤中的其他细胞(内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、脂肪细胞、表皮KC等)均为阴性反应。WE65的意义在于新近的研究表明毛母质细胞可能是毛囊生长和分化的TA细胞，即短暂扩增细胞(transient amplifying cell)[3]。
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H4是毛囊Bulge区的特异性单抗。它仅显示完整的毛囊的Bulge区域，皮肤和毛囊的其他所有结构均无免疫细胞化学阳性染色，因此是Bulge细胞的特异性分子标记物。Bulge是毛囊皮脂腺部ORS的环形膨大，以往的研究曾发现多种动物和人的毛囊具有Bulge区，但一直无法在形态学上证实大鼠存在该区。研究证明，Bulge细胞具有正常慢循环性(slowcycling)、生物化学和超微结构等的原始性和未分化性。新近的毛囊干细胞的“隆突激活假说”(bulge activation hypothesis)指出，虽然成熟毛囊的形成涉及到20多种细胞群体，但Bulge细胞和DP对于维持正常的毛囊周期是最必要的，它们之间的相互诱导合作活动是大量的和重要的；Bulge细胞是毛囊的干细胞[3]。
“隆突激活假说”近来得到越来越多的实验证据的支持，并形成了表皮、皮脂腺和毛囊可能有共同的Bulge干细胞来源的“表皮-毛囊-皮脂腺单位(epidermopilosebaceous unit)学说”[4]。研究证明，不同的致癌剂和移植实验提示皮肤癌发生与毛囊密切有关；毛囊结构是表皮肿瘤的主要来源。已知肿瘤发生主要涉及到长寿的细胞群体(干细胞)，因此最近关于毛囊周期中表皮和真皮之间的相互作用和皮肤癌的研究重点集中于拟议的毛囊干细胞的Bulge区域[5]。
, 百拇医药
H4单克隆抗体的发现可能有以下意义：1.确认了Bulge存在的普遍性；2.是目前唯一的毛囊Bulge细胞的标记物；3.提示Bulge细胞虽然属于KC，但它明显的在生物学性质上不同于其他的皮肤和毛囊的KC。本研究结果明显有利于“隆突激活假说”，并对纯化、鉴定和特化毛囊细胞的前体到最终分化的皮肤和毛囊细胞以及对于阐明这些过程的调节因子有一定的价值。
图版说明
图1 单克隆抗体RT37在6μm冰冻切片的免疫细胞化学染色。示毛囊DP呈均匀阳性染色。RT37也同时显示毛囊中下部的结缔组织鞘细胞，鞘外的真皮成纤维细胞也有阳性染色。标记示20μm。
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图2 单克隆抗体WE65，6μm冰冻切片，免疫细胞化学染色。示毛囊的毛母质细胞和ORS的鞘细胞呈阳性染色。标记示20μm。
图3 冰冻切片免疫荧光染色示单克隆抗体H4。H4仅染毛囊的Bulge区域，皮肤和毛囊的其他结构均未染色。荧光染色高倍镜下(右上插图)可见毛囊上段的Bulge的细胞表面呈强阳性染色。
图4 单克隆抗体H4的一组激光共聚焦图片。示大鼠毛囊的一个完整的Bulge的H4的分布。80 UHAFZ3，Zoom 1.2，Accumulate 12,F=1
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39870690)
【作者简介】 杨恬(1947—)，男(汉族)，重庆市人，医学博士，教授(博士生导师)
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
, http://www.100md.com
参考文献
[1]DW Yu, Yang T, Sohoda T, et al. Message of nexin 1, a serine protease inhibitor, is accumulated in the follicular papilla during anagen of the hair cycle[J]. J Cell Sci, 1995,108(5):3867.
[2]Harlow E, Lane D. Antibodies. A Laboratory Manual[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1988:237-285.
[3]Wilson C, Sun T T, Lavker RM. Cells in the buldge of the mouse telogen follicle give rise to the lower anagen follicle[J]. Skin Pharma,1994,7(1):8-11.
, 百拇医药
[4]Cotsarelis G,Sun T T,Lavker R M, et al. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit:implicationfor follicular setm cells hair cycle and skin carcinogenesis[J]. Cell,1990,61(6):1329-1337.
[5]Lavker RM. Hair follicle stem cells:their location, role in hair cycle, and involvemrnt in tumor fomation[J]. J Invest Derm, 1993,101(1):16-25.
【收稿日期】1999-03-26 【修稿日期】1999-08-27, 百拇医药