与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态学和生长增殖
作者：姜宗来 陈双红 张炎 张传森 李玉泉 丛兴忠
单位：姜宗来(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；陈双红(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；张炎(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；张传森(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；李玉泉(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)
关键词：血管；内皮细胞；平滑肌细胞；联合培养；形态学
解剖学报000321 【摘要】 目的 探讨平滑肌细胞对内皮细胞形态和增殖的影响，为内皮细胞种植的组织工程学提供理论基础。 方法 模拟血管壁的内层结构及内皮细胞平滑肌细胞间的相互影响途径，建立内皮细胞与平滑肌细胞联合培养的模型，应用形态学、细胞计数对内皮细胞的结构和增殖进行研究。 结果 联合培养的新内皮细胞呈伸长性生长，沿细胞长轴排列的微丝增多，增殖受抑制。 结论 内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的新模型是目前研究这两种细胞间相互影响的最佳方式。联合培养的内皮细胞的形态结构更接近于在体生理状态，这一变化可能更有利于其抗应力功能的调节。
, 百拇医药
【中图分类号】 R318.01；R318.11 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-274
MORPHOLOGY,STRUCTURE,GROWTH AND PROLIFERATION
OF Ecs CO-CULTURED WITH SMCs
JIANG Zong-lai, CHEN Shuang-hong, ZHANG Yan, ZHANG Chuan-sen, LI Yu-quan, CONG Xing-zhong
(Department of Anatomy, Institute of Biomedical Engineering,the Second Millitary Medical University, Shanghai 200433,China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective Effects of smooth muscle cells(SMCs)on morphology and function of endothelial cells (Ecs) has been studied in order to support the basic theory for tissue engineering. Methods A new co-culture model of Ecs-SMCs which mimicked the interior architecture of vessel and also imitated the interaction patterns between Ecs and SMCs was established. Morphological observation, cell calculating were applied in the research of morphology, proliferation of the Ecs. Results The results showed that the shape of co-culturing Ecs tended to elongating, the micro-filaments paralleling the cell membrane increased, the proliferation of the Ecs was inhibited. Conclusions The new co-culture model of Ecs-SMCs is the best one to reveal the interaction of the two kinds of the cells. The morphology of the co-culture Ecs is more similar to that in vivo. The change of the Ecs is beneficial to regulating the functions stress-resistance of the Ecs in co-culture model.
, 百拇医药
【Key words】 Vessel; Endothelial cells; Smooth muscle cells; Co-culture; Morphology
平滑肌细胞是内皮细胞的周细胞，在体内两者间的相互影响是血管壁自身结构稳定性得以维持的关键。内皮细胞的生长状态受细胞外基质和平滑肌细胞的调节，体外培养的内皮细胞中加入平滑肌细胞会出现调节影响。Jonnes、Davies、Sannders等人先后构建联合培养模型，直到1997年Mark[1]将多孔PET膜(polyethylene-terephthalate)作为联合培养的载体，才建立了更为简单实用的模型。国外联合培养的研究主要集中在平滑肌细胞，对联合培养的内皮细胞只有零星报道。国内内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的工作目前只有我们的初步报道[2]。
材料和方法
1.内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及联合培养模型的建立
, http://www.100md.com
新生小牛胸主动脉5～10cm，去除外膜，用0.1%胶原酶和0.125%胰酶(Sigma公司)的混合液(1∶4)消化，收集消化液将细胞以5×104个/ml浓度种植于培养瓶中。将上述血管的中膜剪成1×1mm的小块，置于胰蛋白酶中消化，细胞悬液用含血清培养基稀释并种植于培养瓶中，2～3d换液1次。
传代至2～10代的平滑肌细胞经胰酶消化，调整细胞浓度到5×104个/ml，种植于PET膜(美国Falcon公司)的外面，12h后细胞贴壁完全，将膜翻转，在膜的内面以同样的浓度种植2～10代的内皮细胞，然后将PET膜插入配套的6孔培养板(美国Falcon公司)中，进行联合培养，观察到细胞贴壁时为长三角形或长梭形，即为模型建立成功。同时，以单独培养的内皮细胞和在平滑肌细胞的条件培养基中培养内皮细胞分别作为对照，见图1。
图1 内皮细胞的培养模式图
, 百拇医药
A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；
C：联合培养的内皮细胞
Fig.1 culture model of Ecs
A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media;
C,Co-cultured Ecs.
2.内皮细胞形态学观察
每天在倒置相差显微镜下观察细胞的贴壁时间、生长状态和形态，并摄片记录。取标本各1组，苏木素、伊红染色，倒置显微镜下观察并摄片记录。3种培养条件下的内皮细胞，各取其2、4、6d的细胞标本，按常规透射电镜切片操作，观察并摄片记录。
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3.内皮细胞计数
上述3种培养条件下的内皮细胞，每天各取3孔，经胰酶消化后，用细胞计数板计数，取其均值，所得数值绘制成曲线。
结果和讨论
1.内皮细胞和平滑肌细胞联合培养新模型的特点
本实验建立的内皮细胞和平滑肌细联合培养新模型的关键是以多孔PET膜作为内皮细胞和平滑肌细胞间基质层的替代物。PET膜不仅可作为支持载体，能在其两侧分别种植内皮细胞和平滑肌细胞，还具有生理基质的两个结构特点：(1)厚度40～80nm，利于内皮细胞和平滑肌细胞间形成连接；(2)窗孔样结构(孔径0.45μm)：一方面可溶性分泌因子可以相互交流，另一方面内皮细胞与平滑肌细胞胞质间的连接又能通过窗孔形成，同时还能限制细胞通过窗孔伸延到移植物的另一侧。虽然替代物只能部分模拟生理基质的特点，但它所具有的两个结构特征允许细胞间基本的信息联系顺利进行，因此为研究内皮细胞和平滑肌细胞的相互关系提供必要条件。同时，PET膜又是一种无机合成材料，自身不参与影响细胞的生活状态，它的应用使得联合培养模型更为简单、实用。我们认为，与以往的培养方式相比，内皮细胞和平滑肌细胞在膜两侧接触联合培养的新模型是目前体外研究这两种细胞间作用的最佳模型。
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2.与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态结构特点
在体环境中，受血流切应力的影响，内皮细胞的形态将发生与其所受力学环境相适应的改变，主要表现为，随血流方向的极性排列，伸长的流线形外观，这种改变主要使细胞表面受力有梯度的变化，以增强其抗变形抗应变能力。本实验观察到，单独培养的内皮细胞，开始贴壁时细胞呈多边形，细胞微丝大多散在分布于胞质中，也有少量成束分布，排列无方向性。加入平滑肌细胞或平滑肌细胞的条件培养基进行培养，24h后内皮细胞呈明显伸长的改变，单层、排列无极性，细胞边界清楚，细胞胞质中微丝大多数为束状与细胞长轴平行排列，见图2，3。这种形态特征与体内生理状态下的内皮细胞形态更为接近。与单独培养的内皮细胞相比，联合培养的内皮细胞内部结构的改变主要表现在微丝的形态和分布，单独培养内皮细胞的微丝多为散在分布无方向，联合培养的内皮细胞大多呈束状与细胞长轴平行分布。这与体内应力状态下内皮细胞中微丝的状态相似，应力环境会使细胞骨架系统发生变构和重排，以求能更好地适应力学环境。
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3.与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的生长增殖特点
平滑肌细胞是内皮细胞的周细胞之一，两细胞之间存在生长和代谢等方面的相互影响。平滑肌细胞主要通过两种方式参与影响内皮细胞，一种方式是远距离的细胞通讯，另一种是细胞间的连接通讯[3]。本实验连续12d观察3种培养条件的内皮细胞的生长增殖状态，发现平滑肌细胞抑制内皮细胞的生长增殖能力，平滑肌细胞的条件培养基也能抑制内皮细胞的增殖，但较联合培养的方式作用弱，见图4。结果表明，平滑肌细胞通过上述两条途径都参与调节内皮细胞的生长和增殖等系列活动。
图4 内皮细胞的生长曲线
注：A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；
C：联合培养的内皮细胞
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Fig.4 The growth cure of Ecs
A，Ecs cultured alone; B，Ecs cultured in condition media;
C，Co-cultured Ecs.
图版说明
图2 内皮细胞的形态HE染色，×40。A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；C：联合培养的内皮细胞。
图3 内皮细胞的电镜观察 ×15 000，示微丝。A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；C：联合培养的内皮细胞。
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Explanation of figures
Fig.2 Morphology of Ecs HE, ×40.A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media; C,Co-cultured Ecs.
Fig.3 Transmicroscope of Ecs×15 000, microfilamemt. A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media; C,Co-cultured Ecs.
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39670200)和军队“九五”科研基金资助项目(96M068)
【作者简介】 姜宗来(1949—)，男，浙江人，医学博士，教授
, http://www.100md.com
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
作者单位：丛兴忠(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)
参考文献
[1]Mark FF, Fillinger MD, Sampson CN. Co-culture of Ecs and SMCS in bilater and conditioned media models[J]. J Surg Res,1997,67(2):169-178.
[2]姜宗来，陈双红，张炎.内皮细胞平滑肌细胞联合培养的新模型[J].中国学术期刊文摘，1999，5(1)：80～81.
[3]张嵘，楼定安.培养的内皮细胞和平滑肌细胞之间间隙连接形成及连接通讯的研究[J].实验生物学报.1993,6(2):199～123.
【收稿日期】1999-07-23 【修稿日期】2000-01-18, http://www.100md.com
单位：姜宗来(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；陈双红(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；张炎(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；张传森(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)；李玉泉(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)
关键词：血管；内皮细胞；平滑肌细胞；联合培养；形态学
解剖学报000321 【摘要】 目的 探讨平滑肌细胞对内皮细胞形态和增殖的影响，为内皮细胞种植的组织工程学提供理论基础。 方法 模拟血管壁的内层结构及内皮细胞平滑肌细胞间的相互影响途径，建立内皮细胞与平滑肌细胞联合培养的模型，应用形态学、细胞计数对内皮细胞的结构和增殖进行研究。 结果 联合培养的新内皮细胞呈伸长性生长，沿细胞长轴排列的微丝增多，增殖受抑制。 结论 内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的新模型是目前研究这两种细胞间相互影响的最佳方式。联合培养的内皮细胞的形态结构更接近于在体生理状态，这一变化可能更有利于其抗应力功能的调节。
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【中图分类号】 R318.01；R318.11 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-274
MORPHOLOGY,STRUCTURE,GROWTH AND PROLIFERATION
OF Ecs CO-CULTURED WITH SMCs
JIANG Zong-lai, CHEN Shuang-hong, ZHANG Yan, ZHANG Chuan-sen, LI Yu-quan, CONG Xing-zhong
(Department of Anatomy, Institute of Biomedical Engineering,the Second Millitary Medical University, Shanghai 200433,China)
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【Abstract】 Objective Effects of smooth muscle cells(SMCs)on morphology and function of endothelial cells (Ecs) has been studied in order to support the basic theory for tissue engineering. Methods A new co-culture model of Ecs-SMCs which mimicked the interior architecture of vessel and also imitated the interaction patterns between Ecs and SMCs was established. Morphological observation, cell calculating were applied in the research of morphology, proliferation of the Ecs. Results The results showed that the shape of co-culturing Ecs tended to elongating, the micro-filaments paralleling the cell membrane increased, the proliferation of the Ecs was inhibited. Conclusions The new co-culture model of Ecs-SMCs is the best one to reveal the interaction of the two kinds of the cells. The morphology of the co-culture Ecs is more similar to that in vivo. The change of the Ecs is beneficial to regulating the functions stress-resistance of the Ecs in co-culture model.
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【Key words】 Vessel; Endothelial cells; Smooth muscle cells; Co-culture; Morphology
平滑肌细胞是内皮细胞的周细胞，在体内两者间的相互影响是血管壁自身结构稳定性得以维持的关键。内皮细胞的生长状态受细胞外基质和平滑肌细胞的调节，体外培养的内皮细胞中加入平滑肌细胞会出现调节影响。Jonnes、Davies、Sannders等人先后构建联合培养模型，直到1997年Mark[1]将多孔PET膜(polyethylene-terephthalate)作为联合培养的载体，才建立了更为简单实用的模型。国外联合培养的研究主要集中在平滑肌细胞，对联合培养的内皮细胞只有零星报道。国内内皮细胞和平滑肌细胞联合培养的工作目前只有我们的初步报道[2]。
材料和方法
1.内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及联合培养模型的建立
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新生小牛胸主动脉5～10cm，去除外膜，用0.1%胶原酶和0.125%胰酶(Sigma公司)的混合液(1∶4)消化，收集消化液将细胞以5×104个/ml浓度种植于培养瓶中。将上述血管的中膜剪成1×1mm的小块，置于胰蛋白酶中消化，细胞悬液用含血清培养基稀释并种植于培养瓶中，2～3d换液1次。
传代至2～10代的平滑肌细胞经胰酶消化，调整细胞浓度到5×104个/ml，种植于PET膜(美国Falcon公司)的外面，12h后细胞贴壁完全，将膜翻转，在膜的内面以同样的浓度种植2～10代的内皮细胞，然后将PET膜插入配套的6孔培养板(美国Falcon公司)中，进行联合培养，观察到细胞贴壁时为长三角形或长梭形，即为模型建立成功。同时，以单独培养的内皮细胞和在平滑肌细胞的条件培养基中培养内皮细胞分别作为对照，见图1。
图1 内皮细胞的培养模式图
, 百拇医药
A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；
C：联合培养的内皮细胞
Fig.1 culture model of Ecs
A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media;
C,Co-cultured Ecs.
2.内皮细胞形态学观察
每天在倒置相差显微镜下观察细胞的贴壁时间、生长状态和形态，并摄片记录。取标本各1组，苏木素、伊红染色，倒置显微镜下观察并摄片记录。3种培养条件下的内皮细胞，各取其2、4、6d的细胞标本，按常规透射电镜切片操作，观察并摄片记录。
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3.内皮细胞计数
上述3种培养条件下的内皮细胞，每天各取3孔，经胰酶消化后，用细胞计数板计数，取其均值，所得数值绘制成曲线。
结果和讨论
1.内皮细胞和平滑肌细胞联合培养新模型的特点
本实验建立的内皮细胞和平滑肌细联合培养新模型的关键是以多孔PET膜作为内皮细胞和平滑肌细胞间基质层的替代物。PET膜不仅可作为支持载体，能在其两侧分别种植内皮细胞和平滑肌细胞，还具有生理基质的两个结构特点：(1)厚度40～80nm，利于内皮细胞和平滑肌细胞间形成连接；(2)窗孔样结构(孔径0.45μm)：一方面可溶性分泌因子可以相互交流，另一方面内皮细胞与平滑肌细胞胞质间的连接又能通过窗孔形成，同时还能限制细胞通过窗孔伸延到移植物的另一侧。虽然替代物只能部分模拟生理基质的特点，但它所具有的两个结构特征允许细胞间基本的信息联系顺利进行，因此为研究内皮细胞和平滑肌细胞的相互关系提供必要条件。同时，PET膜又是一种无机合成材料，自身不参与影响细胞的生活状态，它的应用使得联合培养模型更为简单、实用。我们认为，与以往的培养方式相比，内皮细胞和平滑肌细胞在膜两侧接触联合培养的新模型是目前体外研究这两种细胞间作用的最佳模型。
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2.与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态结构特点
在体环境中，受血流切应力的影响，内皮细胞的形态将发生与其所受力学环境相适应的改变，主要表现为，随血流方向的极性排列，伸长的流线形外观，这种改变主要使细胞表面受力有梯度的变化，以增强其抗变形抗应变能力。本实验观察到，单独培养的内皮细胞，开始贴壁时细胞呈多边形，细胞微丝大多散在分布于胞质中，也有少量成束分布，排列无方向性。加入平滑肌细胞或平滑肌细胞的条件培养基进行培养，24h后内皮细胞呈明显伸长的改变，单层、排列无极性，细胞边界清楚，细胞胞质中微丝大多数为束状与细胞长轴平行排列，见图2，3。这种形态特征与体内生理状态下的内皮细胞形态更为接近。与单独培养的内皮细胞相比，联合培养的内皮细胞内部结构的改变主要表现在微丝的形态和分布，单独培养内皮细胞的微丝多为散在分布无方向，联合培养的内皮细胞大多呈束状与细胞长轴平行分布。这与体内应力状态下内皮细胞中微丝的状态相似，应力环境会使细胞骨架系统发生变构和重排，以求能更好地适应力学环境。
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3.与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的生长增殖特点
平滑肌细胞是内皮细胞的周细胞之一，两细胞之间存在生长和代谢等方面的相互影响。平滑肌细胞主要通过两种方式参与影响内皮细胞，一种方式是远距离的细胞通讯，另一种是细胞间的连接通讯[3]。本实验连续12d观察3种培养条件的内皮细胞的生长增殖状态，发现平滑肌细胞抑制内皮细胞的生长增殖能力，平滑肌细胞的条件培养基也能抑制内皮细胞的增殖，但较联合培养的方式作用弱，见图4。结果表明，平滑肌细胞通过上述两条途径都参与调节内皮细胞的生长和增殖等系列活动。
图4 内皮细胞的生长曲线
注：A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；
C：联合培养的内皮细胞
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Fig.4 The growth cure of Ecs
A，Ecs cultured alone; B，Ecs cultured in condition media;
C，Co-cultured Ecs.
图版说明
图2 内皮细胞的形态HE染色，×40。A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；C：联合培养的内皮细胞。
图3 内皮细胞的电镜观察 ×15 000，示微丝。A：单独培养的内皮细胞；B：条件培养的内皮细胞；C：联合培养的内皮细胞。
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Explanation of figures
Fig.2 Morphology of Ecs HE, ×40.A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media; C,Co-cultured Ecs.
Fig.3 Transmicroscope of Ecs×15 000, microfilamemt. A,Ecs cultured alone; B,Ecs cultured in condition media; C,Co-cultured Ecs.
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39670200)和军队“九五”科研基金资助项目(96M068)
【作者简介】 姜宗来(1949—)，男，浙江人，医学博士，教授
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通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
作者单位：丛兴忠(第二军医大学解剖学教研室，生物医学工程学研究所，上海 200433)
参考文献
[1]Mark FF, Fillinger MD, Sampson CN. Co-culture of Ecs and SMCS in bilater and conditioned media models[J]. J Surg Res,1997,67(2):169-178.
[2]姜宗来，陈双红，张炎.内皮细胞平滑肌细胞联合培养的新模型[J].中国学术期刊文摘，1999，5(1)：80～81.
[3]张嵘，楼定安.培养的内皮细胞和平滑肌细胞之间间隙连接形成及连接通讯的研究[J].实验生物学报.1993,6(2):199～123.
【收稿日期】1999-07-23 【修稿日期】2000-01-18, http://www.100md.com