人红细胞老化过程中花生凝集素和Con A受体电镜细胞化学研究
作者：刘胜洪 杨木兰 张春明 张亦农 刘冰 官阳 郝刚 刘能保 阮幼冰
单位：刘胜洪(同济医科大学组织学胚胎学教研室)；杨木兰(超微病理学教研室)；张春明(超微病理学教研室)；张亦农(同济医科大学组织学胚胎学教研室)；刘冰(超微病理学教研室)；官阳(超微病理学教研室)；郝刚(老年医学教研室，武汉 430030)；刘能保(同济医科大学组织学胚胎学教研室)；阮幼冰(超微病理学教研室)
关键词：红细胞；细胞老化；刀豆凝集素；花生凝集素；细胞化学
解剖学报000319 【摘要】 目的 观察人血液中，老化红细胞膜上花生凝集素(PNA)和刀豆凝集素(Con A)受体细胞化学反应的变化。 方法 应用金标花生凝集素(PNAg)和刀豆凝集素(Con Ag)，对早期和老化红细胞膜上PNA和Con A受体进行电镜细胞化学显示，并用计算机图像分析系统对电镜照片进行定量处理。 结果 与早期红细胞相比，老化红细胞膜上PNAg颗粒和Con Ag颗粒均有明显增多。 结论 老化红细胞膜上唾液酸的丢失导致半乳糖基和甘露糖基暴露的相应增加，这种变化可能与巨噬细胞对老化红细胞的识别和吞噬机制有关。观察人血液中，老化红细胞膜上花生凝集素(PNA)和刀豆凝集素(Con A)受体细胞化学反应的变化。 方法 应用金标花生凝集素(PNAg)和刀豆凝集素(Con Ag)，对早期和老化红细胞膜上PNA和Con A受体进行电镜细胞化学显示，并用计算机图像分析系统对电镜照片进行定量处理。 结果 与早期红细胞相比，老化红细胞膜上PNAg颗粒和Con Ag颗粒均有明显增多。 结论 老化红细胞膜上唾液酸的丢失导致半乳糖基和甘露糖基暴露的相应增加，这种变化可能与巨噬细胞对老化红细胞的识别和吞噬机制有关。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R331.1；R329.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-268
AN ELECTRON MICROSCOPIC STUDY FOR CYTOCHEMICAL CHANGE
OF CONCANAVALIN A RECEPTORS AND PEANUT AGGLUTININ
RECEPTORS OF AGED HUMAN ERYTHROCYTES
LIU Sheng-hong YANG Mu-lan ZHANG Chun-min ZHANG Yi-nong
LIU Bing GUAN Yang HAO Gang LIU Neng-bao RUAN You-bing
, 百拇医药
Department of Histology and Embryology
Department of Ultrapathology,Department of Senile Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030，China
【Abstract】 Objective To observe the cytochemical changes of peanut agglutinin (PNA)receptors and concanavalin A(Con A)receptors of aged human erythrocytes. Methods Cytochemistry of Con A and PNA labelled with colloid gold (Con Ag and PNAg)on the surface of young and aged erythrocytes was observed under electron microscope,and the micrographs were processed by computer image analysis system. Results The number of Con Ag and PNAg particles of aged erythrocytes was significantly increased in comparison with that of young erythrocytes. Conclusion The desialylation of aged erythrocytes may result in increasing exposure of galactose and mannose,which may lead to the aged erythrocytes phagocytosed by macrophages.
, 百拇医药
【Key words】 Erythrocytes;Aging;Concanavalin A;Peanut agglutinin;Cytochemistry
随着红细胞老化，膜上糖蛋白所含半乳糖和甘露糖呈下降趋势。然而，文献报道，机体内巨噬细胞和某些抗体能够识别处理老化红细胞或使这些细胞凝集，其机理可能与老化红细胞膜上半乳糖基和甘露糖基的增加有关[1]。本实验应用PNAg和Con Ag细胞化学的方法，对人早期红细胞和老化红细胞膜上半乳糖基和甘露醇糖基进行电镜细胞化学定量观察，旨在为这一问题的探讨提供依据。
材料和方法
1. 人周围血红细胞的搜集和分离
取8例健康成人O型血。早期红细胞和老化红细胞分离方法如下：(1)1ml血液标本去血浆，生理盐水换洗，离心，反复3次，生理盐水等体积稀释后备用；(2)生理盐水将27%聚蔗糖(Ficol 400)分别配成23%，22%，21%，20%，19%5个浓度组，每组各取1ml按先高后低的浓度顺序，依次缓慢加入离心管，建立浓度梯度；(3)各例红细胞样本缓慢加入上述离心管，2 000r/min离心1h，收取每个样本上段聚蔗糖内的早期红细胞和下段聚蔗糖内的老化红细胞，生理盐水换洗，稀释备用。
, 百拇医药
2. PNAg和Con Ag的制备按Horrisberger方法[2]
(1)枸椽酸还原法配制7 nm胶体金；(2)胶体金分别与PNA(北京中山生物技术公司产品)和Con A(上海华美生物技术公司)稀释液按一定比例搅拌结合；(3)超速离心，4℃，36 000r/min 45min；(4)收集PNAg和Con Ag结合物，用0.2mol/L TB缓冲液(pH7.4)保存备用。
3. 红细胞膜PNAg和Con Ag细胞化学反应
红细胞经2.5%戊二醛固定4h后，用生理盐水换洗3次，转入0.2 mol/L Tris缓冲液pH7.4，换洗2次，调整细胞浓度至4×107/ml。取早期的和老化的红细胞各1ml分别与0.2mlPNAg液或Con Ag液混合孵育，37℃2h。对照组用D-半乳糖和α-甲基甘露糖作抑制对照实验。细胞化学反应后，细胞经2.5%戊二醛后固定30min，0.5%醋酸铀染色30min。常规电镜包埋，超薄切片，电镜观察，摄片。
, 百拇医药
4. 电镜图像处理及统计
每例标本在超薄切片上连续选取相邻网格右上角红细胞8个，在20 000倍电镜下摄片。用图像分析仪(HPLAS-1000，同济医科大学千屏影像公司产)对所选图片红细胞膜边缘长度进行画线(半自动)测量，并对相应膜上PNAg和Con Ag反应颗粒进行自动识别计数，计算出红细胞膜单位(μm)长度上PNAg和Con Ag颗粒数，所测结果用t检验进行统计学处理。
结果和讨论
早期红细胞膜表面平滑(图1)，老化红细胞表面可见不规则突起，膜边缘较模糊(图2)。早期红细胞和老化红细胞PNAg和Con Ag电镜细胞化学显示结果如图3～6。电镜照片经图橡分析和统计处理，各组红细胞膜上PNAg和Con Ag密度比较见附表。对照组PNAg和Con Ag呈阴性显示。
附表 早期红细胞与老化红细胞金标刀豆凝集素
, 百拇医药
A(Con Ag)和花生凝集素(PNAg)标记颗粒密度均值
Table Mean value of ConAg and PNAg particles on
young aged and old aged erythrocytes
早期红细胞
young aged
erythrocyte
老化红细胞
old aged
erythrocyte
P值
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P value
Con Ag
PNAg
13.4±2.8
16.1±3.5
25.9±3.6
57.5±12.9
<0.01
<0.01
单位＝平均每μm红细胞膜长度上Con Ag和PNAg颗粒数
Unit=the mean number of Con Ag and PNAg particles on
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1μm length of erythrocyte membrane
实验结果显示，老化红细胞膜上PNAg和Con Ag颗粒数均明显高于早期红细胞，揭示老化红细胞膜上半乳糖基和甘露糖基反应增加。文献报道，红细胞膜上复合多糖末端三糖常见的构成顺序从内向外依次为乙酰半乳糖胺-半乳糖-唾液酸或乙酰半乳糖胺-甘露糖-唾液酸[3]。细胞膜上复合多糖末端糖基唾液酸，常从表面覆盖着其下方的半乳糖或苷露糖。早期红细胞表面唾液酸较多，膜上其他糖基被其掩蔽不能充分暴露。但随着红细胞老化，膜上唾液酸含量可能受神经氨酸酶的作用明显下降，被其掩蔽的糖基相对暴露增加。因此，本实验老化红细胞膜上Con Ag和PNAg颗粒增加的结果可能与膜上复合多糖末端分子上较多唾液酸脱落以后暴露出相对较多PNA受体和Con A受体(即半乳糖基或甘露糖基)有关。
Kay等[4]人认为，红细胞老化时，红细胞膜上的band-3蛋白末端糖基结构的改变可能演变形成老化抗原，并刺激机体产生相应抗体。另有研究发现，血液中的抗老化红细胞抗体对新鲜血红细胞不起反应，却能使储存21d后的老化红细胞凝集。但经半乳糖或苷露糖处理，则抗体对老化红细胞的凝集作用消失[5]。这说明老化细胞抗原与带3蛋白上甘露糖基或半乳糖基有关，它们的暴露增加可能是激起机体对老化红细胞的免疫反应机制之一。此外，也有文献报道，体内巨噬细胞对老化红细胞有很强的识别和吞噬能力，这种能力可能是借助巨噬细胞膜上半乳糖基受体与老化红细胞膜上暴露出来的半乳糖基直接结合，或借助巨噬细胞膜上Fc受体与老化红细胞膜上的抗体结合，从而完成对老化红细胞识别和吞噬[1]。因此，本实验应用电镜凝集素细胞化学方法，证实了老化红细胞膜上甘露糖基和半乳糖基的暴露相对增加，这就为解释老化红细胞易被机体内某些抗体识别和被巨噬细胞吞噬的机理，提供了重要的实验依据。
, 百拇医药
图1 早期红细胞电镜显示，细胞膜平滑×1000
图2 老化红细胞电镜显示，细胞膜上可见微绒毛状突起×10000
图3 显示早期红细胞Con Ag电镜细胞化学×60000
图4 显示老化红细胞Con Ag电镜细胞化学×60000
图5 显示早期红细胞PNAg电镜细胞化学×60000
图6 显示老化红细胞PNA g电镜细胞化学×60000
Fig.1 Demonstration of electron microscopy for young age red blood cell with smooth membrane ×10000
, http://www.100md.com
Fig.2 Demonstrationof electron microscopy for old age red blood cell ,some protrusion can be seen on teh surface of the cells ×10000
Fig.3 Transmission electron micrograph of young aged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
Fig.4Transmission electron micrograph of young aged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
Fig.5 Transmission electron micrograph of young aged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
, 百拇医药
Fig.6 Transmission electron micrograph of oldaged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39270295)
【作者简介】 刘胜洪(1954—)，男，湖南人，副教授
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
[1]Schlepper-schafer J,Kolb-Bachofen V.Red cell aging results in a change of cell surface carbohydrate epitopes allowing for recognition by galectose-specific receptors of rat liver macrophages[J].Blood Cell,1988,14(1):259-274.
, 百拇医药
[2]Horrisberger M,Rosset J.Colloid gold, a useful marker for transmission and scaning electron mioroscopy[J].J Histochem and Cytochem,1977,25(4):295-305.
[3]Hirohiko Iwatsuki,Kazunobu Sasaki,Masumi Suda.Membrane-bound glycoconjugates of fetal mouse erythropoietic cells with special reference to phagocytosis by hepatic macrophages[J].Histochem Cell Biology,1995,104(4):277-286.
[4]Kay MM.Localization of senescent cell antigen on band 3[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:5753-5757.
[5]Krugluger W,Koller M,Hopmeier P.Development of a carbohydrate antigen during storage of red cells[J].Transfusion,1994,30(6):496-500.
【收稿日期】1999-07-13 【修稿日期】1999-11-30, 百拇医药
单位：刘胜洪(同济医科大学组织学胚胎学教研室)；杨木兰(超微病理学教研室)；张春明(超微病理学教研室)；张亦农(同济医科大学组织学胚胎学教研室)；刘冰(超微病理学教研室)；官阳(超微病理学教研室)；郝刚(老年医学教研室，武汉 430030)；刘能保(同济医科大学组织学胚胎学教研室)；阮幼冰(超微病理学教研室)
关键词：红细胞；细胞老化；刀豆凝集素；花生凝集素；细胞化学
解剖学报000319 【摘要】 目的 观察人血液中，老化红细胞膜上花生凝集素(PNA)和刀豆凝集素(Con A)受体细胞化学反应的变化。 方法 应用金标花生凝集素(PNAg)和刀豆凝集素(Con Ag)，对早期和老化红细胞膜上PNA和Con A受体进行电镜细胞化学显示，并用计算机图像分析系统对电镜照片进行定量处理。 结果 与早期红细胞相比，老化红细胞膜上PNAg颗粒和Con Ag颗粒均有明显增多。 结论 老化红细胞膜上唾液酸的丢失导致半乳糖基和甘露糖基暴露的相应增加，这种变化可能与巨噬细胞对老化红细胞的识别和吞噬机制有关。观察人血液中，老化红细胞膜上花生凝集素(PNA)和刀豆凝集素(Con A)受体细胞化学反应的变化。 方法 应用金标花生凝集素(PNAg)和刀豆凝集素(Con Ag)，对早期和老化红细胞膜上PNA和Con A受体进行电镜细胞化学显示，并用计算机图像分析系统对电镜照片进行定量处理。 结果 与早期红细胞相比，老化红细胞膜上PNAg颗粒和Con Ag颗粒均有明显增多。 结论 老化红细胞膜上唾液酸的丢失导致半乳糖基和甘露糖基暴露的相应增加，这种变化可能与巨噬细胞对老化红细胞的识别和吞噬机制有关。
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【中图分类号】 R331.1；R329.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)03-268
AN ELECTRON MICROSCOPIC STUDY FOR CYTOCHEMICAL CHANGE
OF CONCANAVALIN A RECEPTORS AND PEANUT AGGLUTININ
RECEPTORS OF AGED HUMAN ERYTHROCYTES
LIU Sheng-hong YANG Mu-lan ZHANG Chun-min ZHANG Yi-nong
LIU Bing GUAN Yang HAO Gang LIU Neng-bao RUAN You-bing
, 百拇医药
Department of Histology and Embryology
Department of Ultrapathology,Department of Senile Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030，China
【Abstract】 Objective To observe the cytochemical changes of peanut agglutinin (PNA)receptors and concanavalin A(Con A)receptors of aged human erythrocytes. Methods Cytochemistry of Con A and PNA labelled with colloid gold (Con Ag and PNAg)on the surface of young and aged erythrocytes was observed under electron microscope,and the micrographs were processed by computer image analysis system. Results The number of Con Ag and PNAg particles of aged erythrocytes was significantly increased in comparison with that of young erythrocytes. Conclusion The desialylation of aged erythrocytes may result in increasing exposure of galactose and mannose,which may lead to the aged erythrocytes phagocytosed by macrophages.
, 百拇医药
【Key words】 Erythrocytes;Aging;Concanavalin A;Peanut agglutinin;Cytochemistry
随着红细胞老化，膜上糖蛋白所含半乳糖和甘露糖呈下降趋势。然而，文献报道，机体内巨噬细胞和某些抗体能够识别处理老化红细胞或使这些细胞凝集，其机理可能与老化红细胞膜上半乳糖基和甘露糖基的增加有关[1]。本实验应用PNAg和Con Ag细胞化学的方法，对人早期红细胞和老化红细胞膜上半乳糖基和甘露醇糖基进行电镜细胞化学定量观察，旨在为这一问题的探讨提供依据。
材料和方法
1. 人周围血红细胞的搜集和分离
取8例健康成人O型血。早期红细胞和老化红细胞分离方法如下：(1)1ml血液标本去血浆，生理盐水换洗，离心，反复3次，生理盐水等体积稀释后备用；(2)生理盐水将27%聚蔗糖(Ficol 400)分别配成23%，22%，21%，20%，19%5个浓度组，每组各取1ml按先高后低的浓度顺序，依次缓慢加入离心管，建立浓度梯度；(3)各例红细胞样本缓慢加入上述离心管，2 000r/min离心1h，收取每个样本上段聚蔗糖内的早期红细胞和下段聚蔗糖内的老化红细胞，生理盐水换洗，稀释备用。
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2. PNAg和Con Ag的制备按Horrisberger方法[2]
(1)枸椽酸还原法配制7 nm胶体金；(2)胶体金分别与PNA(北京中山生物技术公司产品)和Con A(上海华美生物技术公司)稀释液按一定比例搅拌结合；(3)超速离心，4℃，36 000r/min 45min；(4)收集PNAg和Con Ag结合物，用0.2mol/L TB缓冲液(pH7.4)保存备用。
3. 红细胞膜PNAg和Con Ag细胞化学反应
红细胞经2.5%戊二醛固定4h后，用生理盐水换洗3次，转入0.2 mol/L Tris缓冲液pH7.4，换洗2次，调整细胞浓度至4×107/ml。取早期的和老化的红细胞各1ml分别与0.2mlPNAg液或Con Ag液混合孵育，37℃2h。对照组用D-半乳糖和α-甲基甘露糖作抑制对照实验。细胞化学反应后，细胞经2.5%戊二醛后固定30min，0.5%醋酸铀染色30min。常规电镜包埋，超薄切片，电镜观察，摄片。
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4. 电镜图像处理及统计
每例标本在超薄切片上连续选取相邻网格右上角红细胞8个，在20 000倍电镜下摄片。用图像分析仪(HPLAS-1000，同济医科大学千屏影像公司产)对所选图片红细胞膜边缘长度进行画线(半自动)测量，并对相应膜上PNAg和Con Ag反应颗粒进行自动识别计数，计算出红细胞膜单位(μm)长度上PNAg和Con Ag颗粒数，所测结果用t检验进行统计学处理。
结果和讨论
早期红细胞膜表面平滑(图1)，老化红细胞表面可见不规则突起，膜边缘较模糊(图2)。早期红细胞和老化红细胞PNAg和Con Ag电镜细胞化学显示结果如图3～6。电镜照片经图橡分析和统计处理，各组红细胞膜上PNAg和Con Ag密度比较见附表。对照组PNAg和Con Ag呈阴性显示。
附表 早期红细胞与老化红细胞金标刀豆凝集素
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A(Con Ag)和花生凝集素(PNAg)标记颗粒密度均值
Table Mean value of ConAg and PNAg particles on
young aged and old aged erythrocytes
早期红细胞
young aged
erythrocyte
老化红细胞
old aged
erythrocyte
P值
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P value
Con Ag
PNAg
13.4±2.8
16.1±3.5
25.9±3.6
57.5±12.9
<0.01
<0.01
单位＝平均每μm红细胞膜长度上Con Ag和PNAg颗粒数
Unit=the mean number of Con Ag and PNAg particles on
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1μm length of erythrocyte membrane
实验结果显示，老化红细胞膜上PNAg和Con Ag颗粒数均明显高于早期红细胞，揭示老化红细胞膜上半乳糖基和甘露糖基反应增加。文献报道，红细胞膜上复合多糖末端三糖常见的构成顺序从内向外依次为乙酰半乳糖胺-半乳糖-唾液酸或乙酰半乳糖胺-甘露糖-唾液酸[3]。细胞膜上复合多糖末端糖基唾液酸，常从表面覆盖着其下方的半乳糖或苷露糖。早期红细胞表面唾液酸较多，膜上其他糖基被其掩蔽不能充分暴露。但随着红细胞老化，膜上唾液酸含量可能受神经氨酸酶的作用明显下降，被其掩蔽的糖基相对暴露增加。因此，本实验老化红细胞膜上Con Ag和PNAg颗粒增加的结果可能与膜上复合多糖末端分子上较多唾液酸脱落以后暴露出相对较多PNA受体和Con A受体(即半乳糖基或甘露糖基)有关。
Kay等[4]人认为，红细胞老化时，红细胞膜上的band-3蛋白末端糖基结构的改变可能演变形成老化抗原，并刺激机体产生相应抗体。另有研究发现，血液中的抗老化红细胞抗体对新鲜血红细胞不起反应，却能使储存21d后的老化红细胞凝集。但经半乳糖或苷露糖处理，则抗体对老化红细胞的凝集作用消失[5]。这说明老化细胞抗原与带3蛋白上甘露糖基或半乳糖基有关，它们的暴露增加可能是激起机体对老化红细胞的免疫反应机制之一。此外，也有文献报道，体内巨噬细胞对老化红细胞有很强的识别和吞噬能力，这种能力可能是借助巨噬细胞膜上半乳糖基受体与老化红细胞膜上暴露出来的半乳糖基直接结合，或借助巨噬细胞膜上Fc受体与老化红细胞膜上的抗体结合，从而完成对老化红细胞识别和吞噬[1]。因此，本实验应用电镜凝集素细胞化学方法，证实了老化红细胞膜上甘露糖基和半乳糖基的暴露相对增加，这就为解释老化红细胞易被机体内某些抗体识别和被巨噬细胞吞噬的机理，提供了重要的实验依据。
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图1 早期红细胞电镜显示，细胞膜平滑×1000
图2 老化红细胞电镜显示，细胞膜上可见微绒毛状突起×10000
图3 显示早期红细胞Con Ag电镜细胞化学×60000
图4 显示老化红细胞Con Ag电镜细胞化学×60000
图5 显示早期红细胞PNAg电镜细胞化学×60000
图6 显示老化红细胞PNA g电镜细胞化学×60000
Fig.1 Demonstration of electron microscopy for young age red blood cell with smooth membrane ×10000
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Fig.2 Demonstrationof electron microscopy for old age red blood cell ,some protrusion can be seen on teh surface of the cells ×10000
Fig.3 Transmission electron micrograph of young aged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
Fig.4Transmission electron micrograph of young aged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
Fig.5 Transmission electron micrograph of young aged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
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Fig.6 Transmission electron micrograph of oldaged red blood cell stained with Con Ag cytochemistry ×60000
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39270295)
【作者简介】 刘胜洪(1954—)，男，湖南人，副教授
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
参考文献
[1]Schlepper-schafer J,Kolb-Bachofen V.Red cell aging results in a change of cell surface carbohydrate epitopes allowing for recognition by galectose-specific receptors of rat liver macrophages[J].Blood Cell,1988,14(1):259-274.
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[2]Horrisberger M,Rosset J.Colloid gold, a useful marker for transmission and scaning electron mioroscopy[J].J Histochem and Cytochem,1977,25(4):295-305.
[3]Hirohiko Iwatsuki,Kazunobu Sasaki,Masumi Suda.Membrane-bound glycoconjugates of fetal mouse erythropoietic cells with special reference to phagocytosis by hepatic macrophages[J].Histochem Cell Biology,1995,104(4):277-286.
[4]Kay MM.Localization of senescent cell antigen on band 3[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:5753-5757.
[5]Krugluger W,Koller M,Hopmeier P.Development of a carbohydrate antigen during storage of red cells[J].Transfusion,1994,30(6):496-500.
【收稿日期】1999-07-13 【修稿日期】1999-11-30, 百拇医药