去甲二氢愈创木酸对胶质瘤诱导的血管内皮细胞成型的作用
作者：孙慧勤 邹仲敏 陈意生 史景泉 卞修武
单位：孙慧勤(第三军医大学西南医院病理学研究所)；邹仲敏(复合伤研究所，重庆 400038)；陈意生(第三军医大学西南医院病理学研究所)；史景泉(第三军医大学西南医院病理学研究所)；卞修武(第三军医大学西南医院病理学研究所)
关键词：抗血管生成；去甲二氢愈创木酸；内皮；胶质瘤；细胞联合培养；形态生成
解剖学报000417 【摘要】 目的 观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞成型的影响并初步探讨其机理。 方法 采用在Ⅰ型胶原凝胶上的细胞立体培养和内皮-胶质瘤细胞的联合培养法，观测人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞或其条件培养基对人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞形成管腔样结构的影响，同时以免疫组织化学结合图像分析的方法检测SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白的表达。 结果 100μmol/L的NDGA作用1～3d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF的表达明显降低。联合培养3d左右，胶质瘤SHG-44细胞及其条件培养基均能诱导内皮细胞在Ⅰ型胶原凝胶上拉长并形成管腔样结构；而100μmol/L的NDGA可明显抑制内皮细胞变长和管腔样结构的形成(P<0.01)。 结论 NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型有抑制作用，此作用可能与瘤细胞VEGF、bFGF表达减低有关，提示NDGA具有抗血管生成的作用。
, 百拇医药
【中图分类号】 R361.3；R979.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-04-359
THE EFFECT OF NDGA ON GLIOMA-INDUCED ENDOTHELIAL
TUBULAR MORPHOGENESIS AND ITS MECHANISM
SUN Hui-qin CHEN Yi-sheng SHI Jing-quan BIAN Xiu-wu
(Institute of Pathology, Southwest Hospital)
ZOU Zhong-min
(Institute of Combined Injury,the Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective
To observe the effect of NDGA on glioma-induced tubular morphogenesis of endothelial cells, and its mechanism. Methods We applied the glioma-endothelial cell coculture and collegen I gel-based 3D culture to investigate the effect of NDGA on the formation of tubular structures of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)cell line ECV-304 cell, which was induced by human malignant glioma cell line SHG-44 or its conditioned media.Meanwhile the expression levels of VEGF and bFGF in SHG-44 cells were investigated using the techniques of immunohistochemistry and image analysis. Results The Human malignant glioma cell line SHG-44 after treated with 100μmol/L NDGA for 1 to 3 days showed that the expression of VEGF and bFGF was declined at protein levels. Either malignant glioma cell line SHG-44 or its conditioned media could induce ECV-304 cells to lengthen and form tubular structure on the gel of type I collegen. After addition of 100 μmol/L NDGA the length of endothelial cell and quantity of tubular structure, index of the glioma-induced morphogenesis of endothelial cells were significantly declined. Conclusion The above results suggest that NDGA suppresses the tubular morphogenesis and that the decreased expression of VEGF and bFGF may be the molecular mechanism of anti-angiogenesis effect of NDGA.
, http://www.100md.com
【Key words】 Anti-angiogenesis; Nordihydroguaiaretic acid(NDGA); Endothelial cells; Glioma; Coculture; Morphogenesis
实体瘤的生长、转移与肿瘤的血管生成(angiogenesis)有密切的关系，抗血管生成(antiangiogenesis)疗法是肿瘤治疗的新策略[1]。在肿瘤的血管生成过程中，由瘤细胞产生的血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived factor, PDGF)\,碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等，是启动和调控血管生成的重要介质。在胶质瘤，以VEGF和bFGF尤为重要[2]，它们与内皮细胞上的特异性受体相结合，通过一系列的信号传递途径与机制，引起内皮细胞的增殖、迁移、成型等，从而实现血管生成过程。其中，内皮细胞的成型是决定血管生成的关键环节之一。
, 百拇医药
去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)是从常青灌木Larrea divaricata和Guaiacum officinale中提取的一种天然成分。近年发现其具有抑制多种肿瘤发生和发展的作用[3～5]，我们既往的研究发现，NDGA对人恶性胶质瘤不但具有显著的抑制生长和诱导分化作用，而且亦能减低移植瘤和实验性胶质瘤的微血管密度[6，7]，提示NDGA可能影响胶质瘤的血管生成，但尚未得到证实。本实验拟观察NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型的影响，以探讨NDGA的抗血管生成效应，进一步阐明NDGA抗肿瘤机制。
材料和方法
1.细胞培养、胶质瘤条件培养基的制备
人脐静脉内皮细胞系ECV-304(ATCC CRI-1998)和人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞(引自苏州医学院附二院脑肿瘤研究室)，分别在含10%新生小牛血清(BS)、双抗的M199和RPMI1640培养基中常规培养。
, 百拇医药
条件培养基的制备：取等量贴壁生长的SHG-44细胞，弃去原培养基，以D-Hank液洗两次，各加入10ml 0.5%BS、M199液，其中1瓶内加入PBS(pH7.2)0.2ml，另1瓶内加入5mmol/L的NDGA 0.2ml(终浓度为100μmol/L)，培养24h后分别取上清，离心，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别标记为条件培养基1、2(CM1，CM2)，-20℃无菌保存备用。
2.NDGA对SHG-44细胞血管生成因子VEGF、bFGF蛋白表达的影响
经NDGA(终浓度为100μmol/L)或PBS(pH7.2)处理后1～3d的SHG-44细胞，经4%多聚甲醛固定，采用SP法(Zymed公司产品)进行VEGF、bFGF(PcAb,1:20,Santa Cruz公司产品)的免疫组织化学染色。结果的判定与分析：以细胞浆呈明确的棕黄色为阳性染色，并用德国Leica公司MD20型真彩色图像分析仪进行图像分析。测定条件：目镜及物镜放大倍数各为×10、×25，随机测定100个细胞，分别测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(ⅠA)，然后求出平均光密度(A)值。
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3.NDGA对胶质瘤细胞诱导内皮细胞成型的影响
3.1 微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统：双室联合培养是近年发展起来的一种新技术，采用该技术可观察两种细胞间的相互作用。本研究上室为PET微孔(孔径8μm)滤膜培养小室(falcon cell culture insert, Becton Dickinson产品)，用于接种内皮细胞；下室为12孔培养板，用于接种胶质瘤细胞。
3.2 成型实验：(1)胶原凝胶的制备：胶原S(Boehringer Mannheim产品，Ⅰ型胶原>95%)8份、10×M199培养基(pH7.3)1份、0.2 mol/L N-2-羟乙基呱嗪N′-2-乙磺酸(pH7.3)液1份于冰浴下迅速混合，涂布于所需的培养器皿底部，置37℃内形成凝胶，4℃无菌备用；(2)胶质瘤-内皮细胞联合培养及成型试验：SHG-44细胞传入12孔培养板内生长，ECV-304细胞传入铺有胶原凝胶的微孔滤膜小室内生长，近铺平时，装配小室(上室)于长有胶质瘤细胞的培养板(下室)内，在含有或不含NDGA(100μmol/L)的0.5%BS M199液中共同培养，观察细胞的变化并摄像记录成型情况；(3)条件培养基的成型试验：生长良好的内皮细胞传入铺有胶原凝胶的12孔板内生长，次日近80%铺平时，按50%和100%的比例各换为CM1、CM2，补加0.5%BS M199液至2ml/孔，后续观察处理方法同上；(4)管腔样结构数目及内皮细胞长度的测定：培养3d后，于倒置显微镜下随机计数每1视野(×160)内的管腔结构数。每孔计数10个视野，每组3孔，并重复试验3次。部分滤膜上的细胞，以4%多聚甲醛固定、HE染色后，用德国Leica公司MD20型真彩色图像分析仪测量分析，每1视野(×160)随机测定20个内皮细胞的长度，每1滤膜测量10个视野。
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4.数据统计学处理
所有计量数据均以均值±标准差(
±s)表示，采用Microsoft Excel提供的统计程序，进行两样本均数间显著性检验即t检验；计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异显著，Ρ<0.01为差异非常显著。
结果
1.NDGA对SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响
SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达均较强，主要定位于瘤细胞的胞浆。NDGA处理细胞1～3d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的阳性减弱，平均光密度(A)较对照组明显减少，统计学差异显著(P<0.05)，如图1示。
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图1 NDGA处理不同时间后VEGF(左)、bFGF(右)蛋白的表达
Fig.1 The changes of VEGF(Left) and bFGF(Right) expression after NDGA treatment.
2.NDGA对胶质瘤-内皮细胞联合培养时内皮细胞成型的影响
当下室无胶质瘤细胞时，上室胶原凝胶层上的内皮细胞生长旺盛，多呈卵石样排列(图2a)；有NDGA存在时，则细胞较显稀疏，易见悬浮细胞及细胞碎片，未见明显的管腔样结构形成(图2b)。当下室有胶质瘤细胞存在并培养2～3d时，内皮细胞渐变长并可侵入凝胶层内，同时可见内皮细胞成线状排列或围成腔样，随培养时间的延长，线状排列的细胞间可出现空腔(图3a1)；管腔样结构增多似网状或呈蜂巢样，5～7d时最易见(图3a2)；而有NDGA时，上述变化则明显减少(图3b)。图像分析显示，两者在内皮细胞变长的平均长度及形成管腔样结构的数目上存在明显差异(P<0.01)，表1，2示。
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在Ⅰ型胶原凝胶培养的ECV-304细胞
图2 内皮细胞单独培养3d。
2a.无NDGA组，细胞密集呈卵石状镶嵌排列。 ×200
2b.有NDGA组，细胞稀疏，悬浮细胞及细胞碎片增多。×100
ECV-304 cells cultured on type Ⅰ colleagen gel.
Fig.2 ECs cultured alone for 3 days. 2a, In the absence of NDGA, ECs exhibited a cobblestone-like appearance. ×200
2b, In the presence of NDGA, few cells survived, debris often seen. ×100.
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图3 与胶质瘤细胞共同培养。
3a1. 无NDGA组3d，细胞拉长，几个细胞呈线状排列或围成腔样。 ×200
3a2.无NDGA组5d，易见蜂巢样或网状结构。 ×200
3b.有NDGA组5d，细胞拉长、网状或腔样结构少。 ×200
Fig.3 EC cocultured with GC. 3al, In the absence of NDGA and cultured 3d, ECs elongated and align themselves end to end or in tube-like appearence.
3a2, Cultured 5d, More honeycomb pattern or net-like structures. ×200
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3b, In the presence of NDGA and cultrued 5d, few of honeycomb pattern or net-like structures. ×200
图4 与胶质瘤条件培养基培养5d。
4a.与CM1培养，细胞易见蜂巢样或网状结构。 ×100
4b.与CM2培养，细胞网状或腔样结构少。 ×100
Fig.4 Cultured 5d with conditioned media of glioma cells.
, 百拇医药 4a, With CM1, cells showed more honeycomb pattern or net-like structures. ×100
4b, With CM2, less honeycomb pattern or net-like structures formed than with CM2, ×100
表1 NDGA对内皮细胞长度(μm)的影响
Table 1 The effect of NDGA on the
length of endothelial cells
无NDGA
No NDGA
, 百拇医药 有 NDGA
with NDGA
无胶质瘤细胞
no GC
16.063±1.156
14.479±0.902
有胶质瘤细胞with GC
32.765±5.740△
26.531±4.426*△
*与无胶质瘤细胞组相比，P<0.05；△与无NDGA组相比，P<0.01
, 百拇医药 *P<0.05 vs GC-matched group；△ P<0.01 vs NDGA-matched group表2 NDGA对内皮细胞形成管腔样结构
数目的影响(个/×100视野)
Table 2 The effect of NDGA on the number
of EC-formed tubular structures
无NDGA
no NDGA
有 NDGA
with NDGA
无胶质瘤细胞
, 百拇医药
no GC
0.80±0.79
0.70±0.67
有胶质瘤细胞with GC
11.85±5.14△
7.90±2.88*△
*与无胶质瘤细胞组相比，P<0.01；△与无NDGA组相比，P<0.01
*P<0.01 vs GC-matched group；△ P<0.01 vs NDGA-matched group
3.NDGA对胶质瘤细胞条件培养基诱导的内皮细胞成型的影响
, 百拇医药
培养3d后，均见有管腔样结构形成，其中在CM1中培养的细胞拉长、形成管腔样结构的变化最明显(图4a)，而全部为条件培养基的较50%含量的形成管腔样结构要多；在CM2(含NDGA)中培养的细胞形成管腔样结构的较少，细胞拉长减少，并易见悬浮细胞及细胞碎片(图4b)，50%与100%体积含量对培养情况的影响未表现出明显差异。讨论
近30年来，大量的研究已揭示了血管生成在肿瘤生长、发展和转移中的重要地位，同时抗血管生成(antiangiogenesis)治疗肿瘤已成为治疗肿瘤的新策略并正逐渐过渡到临床应用，这些进展都得益于对血管生成过程的深入了解。在肿瘤血管生成过程中，从最初内皮细胞激活形成血管生成表型开始，到内皮细胞发芽、增生、迁移，直至新生血管腔的形成及连通，内皮细胞由单一的细胞增殖、迁移行为发展为成型(即形成管腔结构)，成为有组织的与细胞外基质相关的整体事件，因此，内皮细胞的成型是较增殖和迁移更为复杂的过程，同时也是决定血管生成的关键环节之一，当肿瘤血管形成管腔及连通之后，血液才得以进入瘤组织，为瘤细胞生长提供养分；同时由于肿瘤血管的非成熟性、其结构的不完整性也打开了肿瘤转移的通道。毫无疑问，阻止肿瘤血管的成型，不但能有效控制肿瘤的生长，同时对防止转移也具有重要意义。
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细胞外基质(ECM)在基因调节、翻译和血管结构之间起重要作用，当内皮细胞在基质上运动时，内皮细胞产生的对基质的持续牵拉力，是使其由平面转变为立体的索网状结构的重要原因[8，9]。因此，研究体外血管生成的过程，首先要求细胞要在有细胞外基质提供的三维条件下生长，即在Ⅰ型胶原凝胶(type Ⅰ collagen gels)或基质凝胶(matrigel)上培养[10]，才使得内皮细胞在立体空间有形成腔样结构的可能；其次要有促血管生成因子的存在，这就必须有肿瘤细胞共同培养或添加血管生成因子。已有的研究证实大血管源性的内皮细胞同微血管来源的内皮一样，都具有形成腔样结构的潜能[11]。
血管的成型受多种血管生成因子如bFGF,VEGF,PDGF,EGF,TGF[7，12]等的调控。本实验联合培养所用的胶质瘤细胞系SHG-44细胞由于有强的促内皮细胞成型的因子——bFGF,VEGF表达，从而提供了引起内皮细胞成型的必要刺激，使本研究在无血清条件下联合培养和条件培养基诱导内皮细胞形成管腔结构成为可能。当SHG-44细胞或其条件培养基与人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞，在Ⅰ型胶原凝胶层形成的三维空间内共同培养，2～3d后，可见内皮细胞拉长，侵入凝胶层内，并形成线状或腔样排列结构；至5d左右，线状排列的细胞间可见腔隙，细胞围成的腔样结构增多呈网状或蜂巢样，说明该细胞系具有同原代培养的人脐静脉内皮细胞一样成型的潜能，可用于有关的研究。
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NDGA是花生四稀酸代谢过程中脂氧化酶的强抑制剂。在花生四稀酸代谢过程中，其通过环氧化酶(cyclooxygenase, COX)途径产生前列腺素、前列环腺素等；通过脂氧化酶(lipoxygenase, LOX)通路产生HETES、白三稀，这些代谢产物已证明在肿瘤的增生、转移和免疫抑制等方面发挥作用从而促肿瘤生长。当存在NDGA时，NDGA显著抑制了胶质瘤细胞的增殖、生长[5，7，13]，同时使瘤细胞从形态与表达(主要是胶质原纤维酸性蛋白GFAP)上向成熟胶质细胞转化(即分化)[6，7]，因而使瘤细胞从数量上减少，表达、合成相关的血管生长因子如bFGF、VEGF也降低，从整体(同一培养皿内总的细胞分泌量)和局部(同一细胞分泌量)均减少，其相应的条件培养基中生长因子的含量也降低，从而对内皮细胞的刺激减少，影响内皮细胞的成型。另一方面，由于NDGA是脂氧化酶的强抑制剂，我们的其他研究发现，它可影响内皮细胞的生长(另文发表)，此外也可能影响了内皮细胞本身的膜系统功能及形成，对细胞外基质组分的形成、分泌，乃至细胞与基质结合可能也有影响，这些尚需有关的实验来证实。所有的这些因素，都可影响内皮细胞的成型，所以给药组内皮细胞除显稀疏外，形成的腔样结构亦减少。本实验结果表明NDGA对胶质瘤诱导的内皮细胞成型有明显抑制作用影响，结合以往的研究，进一步提示NDGA在抗肿瘤血管生成及胶质瘤治疗中具有潜在的应用价值。
, 百拇医药
本文图2～4见插图第14页
【基金项目】 重庆市应用基础研究基金资助项目
【作者简介】 孙慧勤(1964—)，女(汉族)，云南昆明人，博士，讲师
参考文献
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【收稿日期】 1999-09-07
【修回日期】 1999-12-14, 百拇医药
单位：孙慧勤(第三军医大学西南医院病理学研究所)；邹仲敏(复合伤研究所，重庆 400038)；陈意生(第三军医大学西南医院病理学研究所)；史景泉(第三军医大学西南医院病理学研究所)；卞修武(第三军医大学西南医院病理学研究所)
关键词：抗血管生成；去甲二氢愈创木酸；内皮；胶质瘤；细胞联合培养；形态生成
解剖学报000417 【摘要】 目的 观察去甲二氢愈创木酸(NDGA)对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞成型的影响并初步探讨其机理。 方法 采用在Ⅰ型胶原凝胶上的细胞立体培养和内皮-胶质瘤细胞的联合培养法，观测人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞或其条件培养基对人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞形成管腔样结构的影响，同时以免疫组织化学结合图像分析的方法检测SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白的表达。 结果 100μmol/L的NDGA作用1～3d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF的表达明显降低。联合培养3d左右，胶质瘤SHG-44细胞及其条件培养基均能诱导内皮细胞在Ⅰ型胶原凝胶上拉长并形成管腔样结构；而100μmol/L的NDGA可明显抑制内皮细胞变长和管腔样结构的形成(P<0.01)。 结论 NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型有抑制作用，此作用可能与瘤细胞VEGF、bFGF表达减低有关，提示NDGA具有抗血管生成的作用。
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【中图分类号】 R361.3；R979.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-04-359
THE EFFECT OF NDGA ON GLIOMA-INDUCED ENDOTHELIAL
TUBULAR MORPHOGENESIS AND ITS MECHANISM
SUN Hui-qin CHEN Yi-sheng SHI Jing-quan BIAN Xiu-wu
(Institute of Pathology, Southwest Hospital)
ZOU Zhong-min
(Institute of Combined Injury,the Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective
To observe the effect of NDGA on glioma-induced tubular morphogenesis of endothelial cells, and its mechanism. Methods We applied the glioma-endothelial cell coculture and collegen I gel-based 3D culture to investigate the effect of NDGA on the formation of tubular structures of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)cell line ECV-304 cell, which was induced by human malignant glioma cell line SHG-44 or its conditioned media.Meanwhile the expression levels of VEGF and bFGF in SHG-44 cells were investigated using the techniques of immunohistochemistry and image analysis. Results The Human malignant glioma cell line SHG-44 after treated with 100μmol/L NDGA for 1 to 3 days showed that the expression of VEGF and bFGF was declined at protein levels. Either malignant glioma cell line SHG-44 or its conditioned media could induce ECV-304 cells to lengthen and form tubular structure on the gel of type I collegen. After addition of 100 μmol/L NDGA the length of endothelial cell and quantity of tubular structure, index of the glioma-induced morphogenesis of endothelial cells were significantly declined. Conclusion The above results suggest that NDGA suppresses the tubular morphogenesis and that the decreased expression of VEGF and bFGF may be the molecular mechanism of anti-angiogenesis effect of NDGA.
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【Key words】 Anti-angiogenesis; Nordihydroguaiaretic acid(NDGA); Endothelial cells; Glioma; Coculture; Morphogenesis
实体瘤的生长、转移与肿瘤的血管生成(angiogenesis)有密切的关系，抗血管生成(antiangiogenesis)疗法是肿瘤治疗的新策略[1]。在肿瘤的血管生成过程中，由瘤细胞产生的血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived factor, PDGF)\,碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等，是启动和调控血管生成的重要介质。在胶质瘤，以VEGF和bFGF尤为重要[2]，它们与内皮细胞上的特异性受体相结合，通过一系列的信号传递途径与机制，引起内皮细胞的增殖、迁移、成型等，从而实现血管生成过程。其中，内皮细胞的成型是决定血管生成的关键环节之一。
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去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)是从常青灌木Larrea divaricata和Guaiacum officinale中提取的一种天然成分。近年发现其具有抑制多种肿瘤发生和发展的作用[3～5]，我们既往的研究发现，NDGA对人恶性胶质瘤不但具有显著的抑制生长和诱导分化作用，而且亦能减低移植瘤和实验性胶质瘤的微血管密度[6，7]，提示NDGA可能影响胶质瘤的血管生成，但尚未得到证实。本实验拟观察NDGA对胶质瘤细胞诱导的血管成型的影响，以探讨NDGA的抗血管生成效应，进一步阐明NDGA抗肿瘤机制。
材料和方法
1.细胞培养、胶质瘤条件培养基的制备
人脐静脉内皮细胞系ECV-304(ATCC CRI-1998)和人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞(引自苏州医学院附二院脑肿瘤研究室)，分别在含10%新生小牛血清(BS)、双抗的M199和RPMI1640培养基中常规培养。
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条件培养基的制备：取等量贴壁生长的SHG-44细胞，弃去原培养基，以D-Hank液洗两次，各加入10ml 0.5%BS、M199液，其中1瓶内加入PBS(pH7.2)0.2ml，另1瓶内加入5mmol/L的NDGA 0.2ml(终浓度为100μmol/L)，培养24h后分别取上清，离心，经0.22μm微孔滤膜过滤，分别标记为条件培养基1、2(CM1，CM2)，-20℃无菌保存备用。
2.NDGA对SHG-44细胞血管生成因子VEGF、bFGF蛋白表达的影响
经NDGA(终浓度为100μmol/L)或PBS(pH7.2)处理后1～3d的SHG-44细胞，经4%多聚甲醛固定，采用SP法(Zymed公司产品)进行VEGF、bFGF(PcAb,1:20,Santa Cruz公司产品)的免疫组织化学染色。结果的判定与分析：以细胞浆呈明确的棕黄色为阳性染色，并用德国Leica公司MD20型真彩色图像分析仪进行图像分析。测定条件：目镜及物镜放大倍数各为×10、×25，随机测定100个细胞，分别测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(ⅠA)，然后求出平均光密度(A)值。
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3.NDGA对胶质瘤细胞诱导内皮细胞成型的影响
3.1 微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统：双室联合培养是近年发展起来的一种新技术，采用该技术可观察两种细胞间的相互作用。本研究上室为PET微孔(孔径8μm)滤膜培养小室(falcon cell culture insert, Becton Dickinson产品)，用于接种内皮细胞；下室为12孔培养板，用于接种胶质瘤细胞。
3.2 成型实验：(1)胶原凝胶的制备：胶原S(Boehringer Mannheim产品，Ⅰ型胶原>95%)8份、10×M199培养基(pH7.3)1份、0.2 mol/L N-2-羟乙基呱嗪N′-2-乙磺酸(pH7.3)液1份于冰浴下迅速混合，涂布于所需的培养器皿底部，置37℃内形成凝胶，4℃无菌备用；(2)胶质瘤-内皮细胞联合培养及成型试验：SHG-44细胞传入12孔培养板内生长，ECV-304细胞传入铺有胶原凝胶的微孔滤膜小室内生长，近铺平时，装配小室(上室)于长有胶质瘤细胞的培养板(下室)内，在含有或不含NDGA(100μmol/L)的0.5%BS M199液中共同培养，观察细胞的变化并摄像记录成型情况；(3)条件培养基的成型试验：生长良好的内皮细胞传入铺有胶原凝胶的12孔板内生长，次日近80%铺平时，按50%和100%的比例各换为CM1、CM2，补加0.5%BS M199液至2ml/孔，后续观察处理方法同上；(4)管腔样结构数目及内皮细胞长度的测定：培养3d后，于倒置显微镜下随机计数每1视野(×160)内的管腔结构数。每孔计数10个视野，每组3孔，并重复试验3次。部分滤膜上的细胞，以4%多聚甲醛固定、HE染色后，用德国Leica公司MD20型真彩色图像分析仪测量分析，每1视野(×160)随机测定20个内皮细胞的长度，每1滤膜测量10个视野。
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4.数据统计学处理
所有计量数据均以均值±标准差(
±s)表示，采用Microsoft Excel提供的统计程序，进行两样本均数间显著性检验即t检验；计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异显著，Ρ<0.01为差异非常显著。结果
1.NDGA对SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响
SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达均较强，主要定位于瘤细胞的胞浆。NDGA处理细胞1～3d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的阳性减弱，平均光密度(A)较对照组明显减少，统计学差异显著(P<0.05)，如图1示。
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图1 NDGA处理不同时间后VEGF(左)、bFGF(右)蛋白的表达
Fig.1 The changes of VEGF(Left) and bFGF(Right) expression after NDGA treatment.
2.NDGA对胶质瘤-内皮细胞联合培养时内皮细胞成型的影响
当下室无胶质瘤细胞时，上室胶原凝胶层上的内皮细胞生长旺盛，多呈卵石样排列(图2a)；有NDGA存在时，则细胞较显稀疏，易见悬浮细胞及细胞碎片，未见明显的管腔样结构形成(图2b)。当下室有胶质瘤细胞存在并培养2～3d时，内皮细胞渐变长并可侵入凝胶层内，同时可见内皮细胞成线状排列或围成腔样，随培养时间的延长，线状排列的细胞间可出现空腔(图3a1)；管腔样结构增多似网状或呈蜂巢样，5～7d时最易见(图3a2)；而有NDGA时，上述变化则明显减少(图3b)。图像分析显示，两者在内皮细胞变长的平均长度及形成管腔样结构的数目上存在明显差异(P<0.01)，表1，2示。
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在Ⅰ型胶原凝胶培养的ECV-304细胞
图2 内皮细胞单独培养3d。
2a.无NDGA组，细胞密集呈卵石状镶嵌排列。 ×200
2b.有NDGA组，细胞稀疏，悬浮细胞及细胞碎片增多。×100
ECV-304 cells cultured on type Ⅰ colleagen gel.
Fig.2 ECs cultured alone for 3 days. 2a, In the absence of NDGA, ECs exhibited a cobblestone-like appearance. ×200
2b, In the presence of NDGA, few cells survived, debris often seen. ×100.
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图3 与胶质瘤细胞共同培养。
3a1. 无NDGA组3d，细胞拉长，几个细胞呈线状排列或围成腔样。 ×200
3a2.无NDGA组5d，易见蜂巢样或网状结构。 ×200
3b.有NDGA组5d，细胞拉长、网状或腔样结构少。 ×200
Fig.3 EC cocultured with GC. 3al, In the absence of NDGA and cultured 3d, ECs elongated and align themselves end to end or in tube-like appearence.
3a2, Cultured 5d, More honeycomb pattern or net-like structures. ×200
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3b, In the presence of NDGA and cultrued 5d, few of honeycomb pattern or net-like structures. ×200
图4 与胶质瘤条件培养基培养5d。
4a.与CM1培养，细胞易见蜂巢样或网状结构。 ×100
4b.与CM2培养，细胞网状或腔样结构少。 ×100
Fig.4 Cultured 5d with conditioned media of glioma cells.
, 百拇医药 4a, With CM1, cells showed more honeycomb pattern or net-like structures. ×100
4b, With CM2, less honeycomb pattern or net-like structures formed than with CM2, ×100
表1 NDGA对内皮细胞长度(μm)的影响
Table 1 The effect of NDGA on the
length of endothelial cells
无NDGA
No NDGA
, 百拇医药 有 NDGA
with NDGA
无胶质瘤细胞
no GC
16.063±1.156
14.479±0.902
有胶质瘤细胞with GC
32.765±5.740△
26.531±4.426*△
*与无胶质瘤细胞组相比，P<0.05；△与无NDGA组相比，P<0.01
, 百拇医药 *P<0.05 vs GC-matched group；△ P<0.01 vs NDGA-matched group表2 NDGA对内皮细胞形成管腔样结构
数目的影响(个/×100视野)
Table 2 The effect of NDGA on the number
of EC-formed tubular structures
无NDGA
no NDGA
有 NDGA
with NDGA
无胶质瘤细胞
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no GC
0.80±0.79
0.70±0.67
有胶质瘤细胞with GC
11.85±5.14△
7.90±2.88*△
*与无胶质瘤细胞组相比，P<0.01；△与无NDGA组相比，P<0.01
*P<0.01 vs GC-matched group；△ P<0.01 vs NDGA-matched group
3.NDGA对胶质瘤细胞条件培养基诱导的内皮细胞成型的影响
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培养3d后，均见有管腔样结构形成，其中在CM1中培养的细胞拉长、形成管腔样结构的变化最明显(图4a)，而全部为条件培养基的较50%含量的形成管腔样结构要多；在CM2(含NDGA)中培养的细胞形成管腔样结构的较少，细胞拉长减少，并易见悬浮细胞及细胞碎片(图4b)，50%与100%体积含量对培养情况的影响未表现出明显差异。讨论
近30年来，大量的研究已揭示了血管生成在肿瘤生长、发展和转移中的重要地位，同时抗血管生成(antiangiogenesis)治疗肿瘤已成为治疗肿瘤的新策略并正逐渐过渡到临床应用，这些进展都得益于对血管生成过程的深入了解。在肿瘤血管生成过程中，从最初内皮细胞激活形成血管生成表型开始，到内皮细胞发芽、增生、迁移，直至新生血管腔的形成及连通，内皮细胞由单一的细胞增殖、迁移行为发展为成型(即形成管腔结构)，成为有组织的与细胞外基质相关的整体事件，因此，内皮细胞的成型是较增殖和迁移更为复杂的过程，同时也是决定血管生成的关键环节之一，当肿瘤血管形成管腔及连通之后，血液才得以进入瘤组织，为瘤细胞生长提供养分；同时由于肿瘤血管的非成熟性、其结构的不完整性也打开了肿瘤转移的通道。毫无疑问，阻止肿瘤血管的成型，不但能有效控制肿瘤的生长，同时对防止转移也具有重要意义。
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细胞外基质(ECM)在基因调节、翻译和血管结构之间起重要作用，当内皮细胞在基质上运动时，内皮细胞产生的对基质的持续牵拉力，是使其由平面转变为立体的索网状结构的重要原因[8，9]。因此，研究体外血管生成的过程，首先要求细胞要在有细胞外基质提供的三维条件下生长，即在Ⅰ型胶原凝胶(type Ⅰ collagen gels)或基质凝胶(matrigel)上培养[10]，才使得内皮细胞在立体空间有形成腔样结构的可能；其次要有促血管生成因子的存在，这就必须有肿瘤细胞共同培养或添加血管生成因子。已有的研究证实大血管源性的内皮细胞同微血管来源的内皮一样，都具有形成腔样结构的潜能[11]。
血管的成型受多种血管生成因子如bFGF,VEGF,PDGF,EGF,TGF[7，12]等的调控。本实验联合培养所用的胶质瘤细胞系SHG-44细胞由于有强的促内皮细胞成型的因子——bFGF,VEGF表达，从而提供了引起内皮细胞成型的必要刺激，使本研究在无血清条件下联合培养和条件培养基诱导内皮细胞形成管腔结构成为可能。当SHG-44细胞或其条件培养基与人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞，在Ⅰ型胶原凝胶层形成的三维空间内共同培养，2～3d后，可见内皮细胞拉长，侵入凝胶层内，并形成线状或腔样排列结构；至5d左右，线状排列的细胞间可见腔隙，细胞围成的腔样结构增多呈网状或蜂巢样，说明该细胞系具有同原代培养的人脐静脉内皮细胞一样成型的潜能，可用于有关的研究。
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NDGA是花生四稀酸代谢过程中脂氧化酶的强抑制剂。在花生四稀酸代谢过程中，其通过环氧化酶(cyclooxygenase, COX)途径产生前列腺素、前列环腺素等；通过脂氧化酶(lipoxygenase, LOX)通路产生HETES、白三稀，这些代谢产物已证明在肿瘤的增生、转移和免疫抑制等方面发挥作用从而促肿瘤生长。当存在NDGA时，NDGA显著抑制了胶质瘤细胞的增殖、生长[5，7，13]，同时使瘤细胞从形态与表达(主要是胶质原纤维酸性蛋白GFAP)上向成熟胶质细胞转化(即分化)[6，7]，因而使瘤细胞从数量上减少，表达、合成相关的血管生长因子如bFGF、VEGF也降低，从整体(同一培养皿内总的细胞分泌量)和局部(同一细胞分泌量)均减少，其相应的条件培养基中生长因子的含量也降低，从而对内皮细胞的刺激减少，影响内皮细胞的成型。另一方面，由于NDGA是脂氧化酶的强抑制剂，我们的其他研究发现，它可影响内皮细胞的生长(另文发表)，此外也可能影响了内皮细胞本身的膜系统功能及形成，对细胞外基质组分的形成、分泌，乃至细胞与基质结合可能也有影响，这些尚需有关的实验来证实。所有的这些因素，都可影响内皮细胞的成型，所以给药组内皮细胞除显稀疏外，形成的腔样结构亦减少。本实验结果表明NDGA对胶质瘤诱导的内皮细胞成型有明显抑制作用影响，结合以往的研究，进一步提示NDGA在抗肿瘤血管生成及胶质瘤治疗中具有潜在的应用价值。
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本文图2～4见插图第14页
【基金项目】 重庆市应用基础研究基金资助项目
【作者简介】 孙慧勤(1964—)，女(汉族)，云南昆明人，博士，讲师
参考文献
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【收稿日期】 1999-09-07
【修回日期】 1999-12-14, 百拇医药