猪体外成熟卵母细胞卵质膜电场行为的研究
作者：李光鹏 兰国成 孟庆刚 于元松 谭景和
单位：李光鹏(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；兰国成(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；孟庆刚(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；于元松(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；谭景和(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)
关键词：卵质膜；电融合；抗电击能力；猪
解剖学报000413 【摘要】 目的 研究体外成熟不同时间猪卵母细胞卵质膜的抗电击和电融合能力。 方法 利用电刺激，显微操作与电融合方法分别对体外成熟不同时间猪卵母细胞的抗电击和电融合能力进行了研究。 结果 1.培养48h卵母细胞质膜的抗电击能力显著高于培养24h和36h的未成熟卵以及培养60h和72h的老化卵；2.体外成熟48h的卵母细胞，在进行同卵或异卵核体移值时，其融合能力最强(融合率90%以上)；3.将小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球分别移入IVM 48h去核猪卵母细胞，电融合率(75%～88.6%)无统计学差异。 结论 同细胞核与细胞质成熟一样，细胞膜也存在成熟问题。培养48h的猪卵母细胞质膜的抗电击能力和发生电融合的能力达到最强。研究体外成熟不同时间猪卵母细胞卵质膜的抗电击和电融合能力。 方法 利用电刺激，显微操作与电融合方法分别对体外成熟不同时间猪卵母细胞的抗电击和电融合能力进行了研究。 结果 1.培养48h卵母细胞质膜的抗电击能力显著高于培养24h和36h的未成熟卵以及培养60h和72h的老化卵；2.体外成熟48h的卵母细胞，在进行同卵或异卵核体移值时，其融合能力最强(融合率90%以上)；3.将小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球分别移入IVM 48h去核猪卵母细胞，电融合率(75%～88.6%)无统计学差异。 结论 同细胞核与细胞质成熟一样，细胞膜也存在成熟问题。培养48h的猪卵母细胞质膜的抗电击能力和发生电融合的能力达到最强。
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【中图分类号】 Q132 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-04-343
THE BEHAVIOR OF THE CELL MEMBRANE OF PORCINE
OOCYTES MATURED IN VITRO IN THE ELECTRIC FIELD
LI Guang-peng LAN Guo-cheng MENG Qing-gang YU Yuan-song TAN Jing-he
(Department of Biotechnology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)
【Abstract】 Objective
, 百拇医药
To study the tolerance of oocyte's plasm membrane(oolemma) to electrical pulse, and its fusion ability by the pulse in the in vitro matured porcine oocytes. Methods The tolerance to electric pulse and its fusion ability were observed by using electric pulses or micro-manipulation and electrofusion Results (1)The plasm membrane of IVM 48h oocytes had the strongest tolerance to electrical pulse compared with the oocytes of IVM 24h, 36h, or 60h and 72h;(2)The fusion rate of IVM 48h oocytes was also significantly higher than those in vitro cultured for 60h and 72h. when reconstituted by nuclear transfer and pulsed, the fusion rates were over 90% between the karyoplasts and the enucleated oocytes from the same oocyte, also between those from two different oocytes cultured in vitro for 48h;(3)When the blastomeres from mouse 2,4,8 cell, or morula embryos were transferred into enucleated IVM 48h porcine oocytes, the fusion rates were 75%-88.6%,with no statistical differences among those groups. Conclusions As the maturation of nucleus and cytoplasm, oolemma is also matured progressively. Tolerance and fusion ability of porcine oocyte's plasm membrane are the highest when the oocytes are cultured for 48h
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【Key words】 Plasm membrane; Electrofusion; Tolerance to electric current; Porcine
卵母细胞的成熟包括细胞核成熟、细胞质成熟和细胞膜成熟[1，2]。细胞核成熟可通过染色质(体)的变化观察到；细胞质成熟可通过体外受精及受精后的胚胎发育得到验证[1，3]，而细胞膜的成熟变化，目前尚未见到一种有效的检测方式。电脉冲刺激可以从一个侧面反映出卵质膜的成熟及其行为变化，这方面的报道仅见于小鼠[4]。
本研究以体外成熟不同时间的猪卵母细胞为实验材料，观察了其质膜抗电击能力及电融合能力的变化，以期为提高猪细胞核移植的效率提供必要的技术数据。
材料和方法
1.猪卵母细胞的获得与培养
, 百拇医药
卵巢卵母细胞的收集和培养见参考文献[5]。培养滴为200μl，每滴放入25～30枚具致密卵丘的卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COC)。培养条件为38.5～39℃，5%CO2，100%湿度。在培养液中加入10%(V/V)胎牛血清(FCS， Sigma)，10IU/ml PMSG(天津实验动物中心)，10IU/ml hCG(宁波激素制品厂)和10%(V/V)猪卵泡液(porcine follicular fluid,pFF)。pFF的制备方法是，从2～6mm卵泡中抽取并捡出COC后，将卵泡液置于离心管中，经3 000r/min(750×g)离心30min。收集上清液，分装后于-20℃冷冻保存备用。
2. 卵质膜抗电击能力检测
2.1 电刺激：在培养24,36,48,60和72h后，用含0.05%的透明质酸酶的杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco PBS ,DPBS)去除卵丘细胞。洗涤3次后，选取具有明确卵周隙的形态良好的卵母细胞进行电刺激。先在0.3 mol/L的甘露醇融合液中让卵沉至底部，再将其转入电融合仪(BTX ECM2001)的电极间的融合液滴中，然后给与电刺激。电击结束后，经TL液[6]洗涤3～5次，转入Whitten液(WM)中培养2h，观察结果。
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2.2 卵母细胞卵质膜完整性鉴定：经电击及培养之后，在倒置镜下检查卵母细胞存活情况。卵质膜破碎、卵周隙消失者为死亡。卵质膜完整，且具有明显卵周隙者为活卵。对不好判定的卵则放入高渗液(0.3 mol/L甘露醇)中处理2min。出现卵周隙者，说明卵质膜完整；无卵周隙者，则为死卵。
3.猪卵母细胞核体互换后的电融合
3.1 同卵或异卵间核体互换后的电融合：分别取培养48、60和72h的卵母细胞，去除卵丘细胞后，在含7.5mg/L细胞松驰素B(CB)的改进的DPBS中作用30min，进行显微操作。固定针外径为200μm，内径为30～40μm；注射针内径为30～40μm。将固定针从极体对侧面固定住，用注射针将极体连同其下方的约1/3的胞质[其中应包含染色质物质，故称之为核体(karyoplast)]吸出。如果吸出的核体部分仍保持形态完整，随即又将其送入卵周隙中，进行同卵质膜融合。将一个卵的核体移入另一个去核卵内，即完成不同卵间的核体互换，然后进行电融合。
, 百拇医药
3.2 小鼠卵裂球与猪卵母细胞的融合：先用台氏液(pH2.5)去除小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的透明带，再用无Ca2+、Mg2+的DPBS将其分成游离的卵裂球作为核供体。然后分别将不同时期胚胎的卵裂球注射入去核的体外成熟(in vitro maturation, IVM)48h的猪卵母细胞的卵周隙中，进行电融合。
对照组处理：分别把两个2、4或8细胞小鼠胚胎的卵裂球注射入猪的空透明带中，然后进行电融合。空透明带制作方法是，将废弃的猪卵母细胞以去核的方式把其内容物全部吸出，即得到空透明带。
3.3 电融合方法：电融合方法见参考文献[7，8]。
4.数据处理
对实验所得数据利用t检验进行统计学分析。
, http://www.100md.com 结 果
1.不同时期IVM卵母细胞的抗电击能力
表1 不同时期猪IVM卵母细胞的抗电击能力
Table 1 Tolerance of porcine oocytes cultured in
vitro for different time to electric currents 卵母细胞时期
oocyte stage
电激条件
electric pulses
(kV/cm,μs)
, http://www.100md.com 处理卵数
No.oocytes
treated
活卵数(%)
No.oocytes
survived(%)
1.2 30
48
31(64.6)
1.5 30
51
25(49)
, 百拇医药
24h
2.0 30
43
18(41.8)
3.0 30
40
10(25)
5.0 30
17
0
1.2 30
73
63(86.3)
, http://www.100md.com
2.0 30
61
48(78.7)
36h
3.0 30
45
38(84.4)
4.0 30
33
10(30.3)
5.0 30
19
0
, 百拇医药
2.5 30
73
59(80.8)
3.0 30
69
58(84.1)
48h
5.0 30
39
12(30.8)
6.0 30
21
3(14.2)
, 百拇医药
1.5 30
27
19(70.4)
2.0 30
51
28(54.9)
60h
3.0 30
48
12(25)
4.0 30
41
0
, 百拇医药
0.8 30
39
26(66.7)
1.2 30
29
21(72.4)
72h
1.5 30
34
22(64.7)
2.0 30
31
13(41.9)
, 百拇医药
3.0 30
44
6(13.6)
培养不同时间的猪卵母细胞对电场刺激的反应存在较大差异。培养48h的卵母细胞的抗电击能力最强，在5.0kV/cm、30μs和6.0kV/cm\,30μs刺激条件下，仍分别有30.8%和14.2%的卵存活，卵质膜保持完好。显著高于IVM 24h、36h的未成熟卵和IVM 60h和72h的老化卵(表1)。
从表1还可以看出，不同电刺激强度对同一时期卵母细胞的电击效果也不相同。超过一定刺激强度时，卵母细胞存活率下降，卵质膜的抗电击能力减弱。如IVM 48h的卵母细胞，当将电击强度由3.0kV/cm,30μs提高到5.0kV/cm,30μs时，卵母细胞存活率从84.1%下降到30.8%。
2.猪IVM卵母细胞质膜的融合能力
, 百拇医药
2.1 体外成熟不同时间猪卵母细胞的同卵或异卵间融合：同卵融合(电击条件为1.2kV/cm，30μs，刺激1次)时，IVM 48h的卵母细胞的融合率为90.3%(28/31)，显著高于IVM 60h(75%，27/36)和72h(62.6%，17/27)的融合率(P<0.05)。相同电击条件下进行异卵融合时，IVM 48h卵的融合率(92.8%，26/28)显著(P<0.05)高于IVM 60h卵的融合率(75%，21/28)，极显著(P<0.01)高于IVM 72h卵的融合率(47.3%，9/19)。
2.2 小鼠胚胎卵裂球与猪卵母细胞间的融合：把小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球移入去核的猪IVM 48h的卵中，在不同电脉冲条件下，重组卵的融合率均在80%以上，与对照组亦无显著差异，见表2。表2 小鼠胚胎卵裂球与猪卵母细胞间的核质融合
Table 2 Fusion between blastomeres of mouse embryos and porcine enucleated oocytes 待融细胞对类型
, http://www.100md.com
types of cell pairs to be fused
电脉冲条件
electric pulses
待融合胚数
No.of cell pairs
to be fused
融合数(%)
No.of fused (%)
死亡(%)
No.of lysed(%)
小鼠两个2-细胞卵裂球
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2 blastomeres of mouse 2-cell stage embryo
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
56
47
(83.9)a
0
小鼠2-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
2-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
0.8 kV/cm,30μs
, 百拇医药
1次，once
22
18
(81.8)a
2
(9.1)
小鼠2-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
2-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
1次，once
15
, 百拇医药
12
(80)a
2
(13.3)
小鼠两个4-细胞卵裂球
2 blastomeres of mouse 4-cell stage embryo
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
19
16
(84.2)a
, 百拇医药
0
小鼠4-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
4-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
1次，once
21
17
(81)a
3
(14.3)
小鼠两个8-细胞卵裂球
, 百拇医药
2-blastomeres of mouse 8-cell stage embryo
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
26
22
(84.6)a
0
小鼠两个8-细胞卵裂球
2-blastomeres of mouse 8-cell stage embryo
1.2 kV/cm,30μs
, 百拇医药
1次，once
21
18
(85.7)a
0
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
18
15
, 百拇医药
(83.3)a
3
(16.7)
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
1次，once
36
31
(88.6)a
, 百拇医药 5
(13.9)
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
2次，Twice
38
29
(76.3)a
9
(31)
, 百拇医药
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.6 kV/cm,30μs
1次，once
36
27
(75)a
7
(25.9)
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
, http://www.100md.com
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
2.0 kV/cm,30μs
1次，once
40
31
(77.5)a
8
(20)
小鼠桑葚胚细胞-猪卵去核胞质blastomere of mouse
morula-porcine enucleated cytoplasm
, 百拇医药
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
20
17
(85)a
2
(10)
对照组(control)讨 论
1.猪卵母细胞成熟过程中质膜抗电击能力的变化
体外成熟培养44～48h的猪卵母细胞，一般认为已经达到成熟状态，可以进行体外受精[9，10]。从表1可以看出，IVM 48h卵母细胞的卵质膜抗电击能力最强。IVM 36h的卵母细胞经3.0kV/cm，30μs电击后，卵母细胞存活率为84.4%，与经同等强度刺激后IVM 48h卵母细胞的存活率(84.1%)一致。说明IVM 36h的猪卵母细胞的卵质膜的抗电击能力与IVM 48h的卵母细胞相当。但是，继续提高刺激强度，IVM 36h卵母细胞的存活率大大下降，其抗电击能力低于IVM 48h的卵母细胞。说明，随卵母细胞的成熟，卵质膜也发生相应的成熟变化，至少表现出质膜的抗电击能力增强。而随卵母细胞在体外的老化(IVM 60h和72h)，卵质膜的抗电击能力也逐渐减弱。同一时期的卵母细胞，在一定的刺激强度范围内，存活率较高；高于这一强度，卵母细胞存活率明显下降。说明卵母细胞的抗电击能力是有一定限度的(表1)。
, 百拇医药
2.猪体外成熟卵母细胞质膜的电融合能力
卵子质膜赋有融合的能力[11]。IVM 48h猪卵母细胞的卵质膜的同卵或异卵融合能力显著高于IVM 60h和72h卵的融合能力。说明随卵母细胞的卵龄增加，其质膜的融合能力显著下降；这一点在其他动物也有报道[12]。
实验中发现，IVM 48h猪卵母细胞的卵质膜与小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎细胞进行融合时，融合率无显著差异。说明不同时期的小鼠胚胎细胞与猪卵母细胞(异种动物)之间是可以融合的，而且融合能力基本一致。这为开展哺乳动物异种间的核移植提供了可行性依据。
【基金项目】 国家教育部跨世纪优秀人才计划基金资助项目(1994)和黑龙江省杰出青年科学基金资助项目(95004)
【作者简介】 李光鹏(1963—)，男(汉族)，山东省人，博士，副教授。现在中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室工作 北京 100080
, 百拇医药
参考文献
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[2]Eppig JJ,Schroeder AC, van de Sandt JJM, et al.Developmental capacity of mouse oocytes that grow and mature in culture:The effect of modification of the protocol[J].Theriogenology,1990,33(1):89-100.
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【收稿日期】 1999-07-09
【修回日期】 1999-10-22, 百拇医药
单位：李光鹏(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；兰国成(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；孟庆刚(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；于元松(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)；谭景和(东北农业大学生物工程系，哈尔滨 150030)
关键词：卵质膜；电融合；抗电击能力；猪
解剖学报000413 【摘要】 目的 研究体外成熟不同时间猪卵母细胞卵质膜的抗电击和电融合能力。 方法 利用电刺激，显微操作与电融合方法分别对体外成熟不同时间猪卵母细胞的抗电击和电融合能力进行了研究。 结果 1.培养48h卵母细胞质膜的抗电击能力显著高于培养24h和36h的未成熟卵以及培养60h和72h的老化卵；2.体外成熟48h的卵母细胞，在进行同卵或异卵核体移值时，其融合能力最强(融合率90%以上)；3.将小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球分别移入IVM 48h去核猪卵母细胞，电融合率(75%～88.6%)无统计学差异。 结论 同细胞核与细胞质成熟一样，细胞膜也存在成熟问题。培养48h的猪卵母细胞质膜的抗电击能力和发生电融合的能力达到最强。研究体外成熟不同时间猪卵母细胞卵质膜的抗电击和电融合能力。 方法 利用电刺激，显微操作与电融合方法分别对体外成熟不同时间猪卵母细胞的抗电击和电融合能力进行了研究。 结果 1.培养48h卵母细胞质膜的抗电击能力显著高于培养24h和36h的未成熟卵以及培养60h和72h的老化卵；2.体外成熟48h的卵母细胞，在进行同卵或异卵核体移值时，其融合能力最强(融合率90%以上)；3.将小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球分别移入IVM 48h去核猪卵母细胞，电融合率(75%～88.6%)无统计学差异。 结论 同细胞核与细胞质成熟一样，细胞膜也存在成熟问题。培养48h的猪卵母细胞质膜的抗电击能力和发生电融合的能力达到最强。
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【中图分类号】 Q132 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)-04-343
THE BEHAVIOR OF THE CELL MEMBRANE OF PORCINE
OOCYTES MATURED IN VITRO IN THE ELECTRIC FIELD
LI Guang-peng LAN Guo-cheng MENG Qing-gang YU Yuan-song TAN Jing-he
(Department of Biotechnology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China)
【Abstract】 Objective
, 百拇医药
To study the tolerance of oocyte's plasm membrane(oolemma) to electrical pulse, and its fusion ability by the pulse in the in vitro matured porcine oocytes. Methods The tolerance to electric pulse and its fusion ability were observed by using electric pulses or micro-manipulation and electrofusion Results (1)The plasm membrane of IVM 48h oocytes had the strongest tolerance to electrical pulse compared with the oocytes of IVM 24h, 36h, or 60h and 72h;(2)The fusion rate of IVM 48h oocytes was also significantly higher than those in vitro cultured for 60h and 72h. when reconstituted by nuclear transfer and pulsed, the fusion rates were over 90% between the karyoplasts and the enucleated oocytes from the same oocyte, also between those from two different oocytes cultured in vitro for 48h;(3)When the blastomeres from mouse 2,4,8 cell, or morula embryos were transferred into enucleated IVM 48h porcine oocytes, the fusion rates were 75%-88.6%,with no statistical differences among those groups. Conclusions As the maturation of nucleus and cytoplasm, oolemma is also matured progressively. Tolerance and fusion ability of porcine oocyte's plasm membrane are the highest when the oocytes are cultured for 48h
, http://www.100md.com
【Key words】 Plasm membrane; Electrofusion; Tolerance to electric current; Porcine
卵母细胞的成熟包括细胞核成熟、细胞质成熟和细胞膜成熟[1，2]。细胞核成熟可通过染色质(体)的变化观察到；细胞质成熟可通过体外受精及受精后的胚胎发育得到验证[1，3]，而细胞膜的成熟变化，目前尚未见到一种有效的检测方式。电脉冲刺激可以从一个侧面反映出卵质膜的成熟及其行为变化，这方面的报道仅见于小鼠[4]。
本研究以体外成熟不同时间的猪卵母细胞为实验材料，观察了其质膜抗电击能力及电融合能力的变化，以期为提高猪细胞核移植的效率提供必要的技术数据。
材料和方法
1.猪卵母细胞的获得与培养
, 百拇医药
卵巢卵母细胞的收集和培养见参考文献[5]。培养滴为200μl，每滴放入25～30枚具致密卵丘的卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COC)。培养条件为38.5～39℃，5%CO2，100%湿度。在培养液中加入10%(V/V)胎牛血清(FCS， Sigma)，10IU/ml PMSG(天津实验动物中心)，10IU/ml hCG(宁波激素制品厂)和10%(V/V)猪卵泡液(porcine follicular fluid,pFF)。pFF的制备方法是，从2～6mm卵泡中抽取并捡出COC后，将卵泡液置于离心管中，经3 000r/min(750×g)离心30min。收集上清液，分装后于-20℃冷冻保存备用。
2. 卵质膜抗电击能力检测
2.1 电刺激：在培养24,36,48,60和72h后，用含0.05%的透明质酸酶的杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco PBS ,DPBS)去除卵丘细胞。洗涤3次后，选取具有明确卵周隙的形态良好的卵母细胞进行电刺激。先在0.3 mol/L的甘露醇融合液中让卵沉至底部，再将其转入电融合仪(BTX ECM2001)的电极间的融合液滴中，然后给与电刺激。电击结束后，经TL液[6]洗涤3～5次，转入Whitten液(WM)中培养2h，观察结果。
, http://www.100md.com
2.2 卵母细胞卵质膜完整性鉴定：经电击及培养之后，在倒置镜下检查卵母细胞存活情况。卵质膜破碎、卵周隙消失者为死亡。卵质膜完整，且具有明显卵周隙者为活卵。对不好判定的卵则放入高渗液(0.3 mol/L甘露醇)中处理2min。出现卵周隙者，说明卵质膜完整；无卵周隙者，则为死卵。
3.猪卵母细胞核体互换后的电融合
3.1 同卵或异卵间核体互换后的电融合：分别取培养48、60和72h的卵母细胞，去除卵丘细胞后，在含7.5mg/L细胞松驰素B(CB)的改进的DPBS中作用30min，进行显微操作。固定针外径为200μm，内径为30～40μm；注射针内径为30～40μm。将固定针从极体对侧面固定住，用注射针将极体连同其下方的约1/3的胞质[其中应包含染色质物质，故称之为核体(karyoplast)]吸出。如果吸出的核体部分仍保持形态完整，随即又将其送入卵周隙中，进行同卵质膜融合。将一个卵的核体移入另一个去核卵内，即完成不同卵间的核体互换，然后进行电融合。
, 百拇医药
3.2 小鼠卵裂球与猪卵母细胞的融合：先用台氏液(pH2.5)去除小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的透明带，再用无Ca2+、Mg2+的DPBS将其分成游离的卵裂球作为核供体。然后分别将不同时期胚胎的卵裂球注射入去核的体外成熟(in vitro maturation, IVM)48h的猪卵母细胞的卵周隙中，进行电融合。
对照组处理：分别把两个2、4或8细胞小鼠胚胎的卵裂球注射入猪的空透明带中，然后进行电融合。空透明带制作方法是，将废弃的猪卵母细胞以去核的方式把其内容物全部吸出，即得到空透明带。
3.3 电融合方法：电融合方法见参考文献[7，8]。
4.数据处理
对实验所得数据利用t检验进行统计学分析。
, http://www.100md.com 结 果
1.不同时期IVM卵母细胞的抗电击能力
表1 不同时期猪IVM卵母细胞的抗电击能力
Table 1 Tolerance of porcine oocytes cultured in
vitro for different time to electric currents 卵母细胞时期
oocyte stage
电激条件
electric pulses
(kV/cm,μs)
, http://www.100md.com 处理卵数
No.oocytes
treated
活卵数(%)
No.oocytes
survived(%)
1.2 30
48
31(64.6)
1.5 30
51
25(49)
, 百拇医药
24h
2.0 30
43
18(41.8)
3.0 30
40
10(25)
5.0 30
17
0
1.2 30
73
63(86.3)
, http://www.100md.com
2.0 30
61
48(78.7)
36h
3.0 30
45
38(84.4)
4.0 30
33
10(30.3)
5.0 30
19
0
, 百拇医药
2.5 30
73
59(80.8)
3.0 30
69
58(84.1)
48h
5.0 30
39
12(30.8)
6.0 30
21
3(14.2)
, 百拇医药
1.5 30
27
19(70.4)
2.0 30
51
28(54.9)
60h
3.0 30
48
12(25)
4.0 30
41
0
, 百拇医药
0.8 30
39
26(66.7)
1.2 30
29
21(72.4)
72h
1.5 30
34
22(64.7)
2.0 30
31
13(41.9)
, 百拇医药
3.0 30
44
6(13.6)
培养不同时间的猪卵母细胞对电场刺激的反应存在较大差异。培养48h的卵母细胞的抗电击能力最强，在5.0kV/cm、30μs和6.0kV/cm\,30μs刺激条件下，仍分别有30.8%和14.2%的卵存活，卵质膜保持完好。显著高于IVM 24h、36h的未成熟卵和IVM 60h和72h的老化卵(表1)。
从表1还可以看出，不同电刺激强度对同一时期卵母细胞的电击效果也不相同。超过一定刺激强度时，卵母细胞存活率下降，卵质膜的抗电击能力减弱。如IVM 48h的卵母细胞，当将电击强度由3.0kV/cm,30μs提高到5.0kV/cm,30μs时，卵母细胞存活率从84.1%下降到30.8%。
2.猪IVM卵母细胞质膜的融合能力
, 百拇医药
2.1 体外成熟不同时间猪卵母细胞的同卵或异卵间融合：同卵融合(电击条件为1.2kV/cm，30μs，刺激1次)时，IVM 48h的卵母细胞的融合率为90.3%(28/31)，显著高于IVM 60h(75%，27/36)和72h(62.6%，17/27)的融合率(P<0.05)。相同电击条件下进行异卵融合时，IVM 48h卵的融合率(92.8%，26/28)显著(P<0.05)高于IVM 60h卵的融合率(75%，21/28)，极显著(P<0.01)高于IVM 72h卵的融合率(47.3%，9/19)。
2.2 小鼠胚胎卵裂球与猪卵母细胞间的融合：把小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎的卵裂球移入去核的猪IVM 48h的卵中，在不同电脉冲条件下，重组卵的融合率均在80%以上，与对照组亦无显著差异，见表2。表2 小鼠胚胎卵裂球与猪卵母细胞间的核质融合
Table 2 Fusion between blastomeres of mouse embryos and porcine enucleated oocytes 待融细胞对类型
, http://www.100md.com
types of cell pairs to be fused
电脉冲条件
electric pulses
待融合胚数
No.of cell pairs
to be fused
融合数(%)
No.of fused (%)
死亡(%)
No.of lysed(%)
小鼠两个2-细胞卵裂球
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2 blastomeres of mouse 2-cell stage embryo
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
56
47
(83.9)a
0
小鼠2-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
2-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
0.8 kV/cm,30μs
, 百拇医药
1次，once
22
18
(81.8)a
2
(9.1)
小鼠2-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
2-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
1次，once
15
, 百拇医药
12
(80)a
2
(13.3)
小鼠两个4-细胞卵裂球
2 blastomeres of mouse 4-cell stage embryo
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
19
16
(84.2)a
, 百拇医药
0
小鼠4-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
4-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
1次，once
21
17
(81)a
3
(14.3)
小鼠两个8-细胞卵裂球
, 百拇医药
2-blastomeres of mouse 8-cell stage embryo
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
26
22
(84.6)a
0
小鼠两个8-细胞卵裂球
2-blastomeres of mouse 8-cell stage embryo
1.2 kV/cm,30μs
, 百拇医药
1次，once
21
18
(85.7)a
0
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
18
15
, 百拇医药
(83.3)a
3
(16.7)
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
1次，once
36
31
(88.6)a
, 百拇医药 5
(13.9)
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.2 kV/cm,30μs
2次，Twice
38
29
(76.3)a
9
(31)
, 百拇医药
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
1.6 kV/cm,30μs
1次，once
36
27
(75)a
7
(25.9)
小鼠8-细胞卵裂球-猪卵去核胞质blastomere of mouse
, http://www.100md.com
8-cell stage-porcine enucleated cytoplasm
2.0 kV/cm,30μs
1次，once
40
31
(77.5)a
8
(20)
小鼠桑葚胚细胞-猪卵去核胞质blastomere of mouse
morula-porcine enucleated cytoplasm
, 百拇医药
0.8 kV/cm,30μs
1次，once
20
17
(85)a
2
(10)
对照组(control)讨 论
1.猪卵母细胞成熟过程中质膜抗电击能力的变化
体外成熟培养44～48h的猪卵母细胞，一般认为已经达到成熟状态，可以进行体外受精[9，10]。从表1可以看出，IVM 48h卵母细胞的卵质膜抗电击能力最强。IVM 36h的卵母细胞经3.0kV/cm，30μs电击后，卵母细胞存活率为84.4%，与经同等强度刺激后IVM 48h卵母细胞的存活率(84.1%)一致。说明IVM 36h的猪卵母细胞的卵质膜的抗电击能力与IVM 48h的卵母细胞相当。但是，继续提高刺激强度，IVM 36h卵母细胞的存活率大大下降，其抗电击能力低于IVM 48h的卵母细胞。说明，随卵母细胞的成熟，卵质膜也发生相应的成熟变化，至少表现出质膜的抗电击能力增强。而随卵母细胞在体外的老化(IVM 60h和72h)，卵质膜的抗电击能力也逐渐减弱。同一时期的卵母细胞，在一定的刺激强度范围内，存活率较高；高于这一强度，卵母细胞存活率明显下降。说明卵母细胞的抗电击能力是有一定限度的(表1)。
, 百拇医药
2.猪体外成熟卵母细胞质膜的电融合能力
卵子质膜赋有融合的能力[11]。IVM 48h猪卵母细胞的卵质膜的同卵或异卵融合能力显著高于IVM 60h和72h卵的融合能力。说明随卵母细胞的卵龄增加，其质膜的融合能力显著下降；这一点在其他动物也有报道[12]。
实验中发现，IVM 48h猪卵母细胞的卵质膜与小鼠2、4、8细胞和桑葚期胚胎细胞进行融合时，融合率无显著差异。说明不同时期的小鼠胚胎细胞与猪卵母细胞(异种动物)之间是可以融合的，而且融合能力基本一致。这为开展哺乳动物异种间的核移植提供了可行性依据。
【基金项目】 国家教育部跨世纪优秀人才计划基金资助项目(1994)和黑龙江省杰出青年科学基金资助项目(95004)
【作者简介】 李光鹏(1963—)，男(汉族)，山东省人，博士，副教授。现在中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室工作 北京 100080
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参考文献
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【收稿日期】 1999-07-09
【修回日期】 1999-10-22, 百拇医药