晚期糖化终产物对糖尿病大鼠主动脉平滑肌细胞的影响
作者：陶凯忠 陈尔瑜 姜宗来 张传森
单位：陶凯忠(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)；陈尔瑜(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)；姜宗来(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)；张传森(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)
关键词：糖尿病；晚期糖化终产物；血管平滑肌细胞；大鼠
解剖学报000409 【摘要】 目的 探讨血管平滑肌细胞(VSMC)在糖尿病早期的改变及其与晚期糖化终产物(AGEs)的关系。 方法 应用荧光分光光度法、免疫组织化学、计算机图像分析和透射电镜等技术，研究链脲佐菌素诱导的糖尿病(DM)大鼠血浆和腹主动脉晚期糖化终产物(AGEs)的含量以及腹主动脉VSMC的变化。 结果 从4周起，DM大鼠血浆和腹主动脉的AGEs显著增多；腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积减小，VSMC的细胞核密度增大，线粒体和粗面内质网增多。DM大鼠腹主动脉血小板源生长因子-A的免疫组织化学反应呈持续阳性。非酶糖化抑制剂氨基胍不降低血糖，但能降低血浆和组织的AGEs水平，对VSMC的改变也有减缓作用。 结论 VSMC在糖尿病早期已出现由收缩型向合成型转化的趋势，AGEs是VSMC发生改变的重要因素。
, 百拇医药
【中图分类号】 R587.202 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-327
EFFECTS OF ADVANCED GLYCATION END PRODUCTS ON AORTIC
SMOOTH MUSCLE CELL OF STZ-INDUCED DIABETIC RAT
TAO Kai-zhong CHEN Er-yu JIANG Zong-lai ZHANG Chuan-sen
(Department of Anatomy, the Second Military Medical University, Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective The changes of vascular smooth muscle cell(VSMC) in early diabetes and their relationship with advanced glycation end products(AGEs) were studied. Methods The changes of contents of AGEs in plasma and the abdominal aorta and changes of VSMC of the abdominal aorta were investigated with methods of fluorospectrophotometry, immunohistochemistry, computer image analysis and transmission electron microscopy on streptozotocin-induced diabetic rats. Results From the fourth week, in diabetic rats, the contents of AGEs in plasma and the abdominal aorta increased, the relative area of α-SM-actin in the abdominal aorta decreased, the density of nucleus of VSMC increased, and mitochondria and rough endoplasmic reticules in VSMC increased. The immunohistochemical reaction of platelet-derived growth factor-A(PDGF-A) was persistent positive in diabetic rats. The inhibitor of nonenzymatic glycosylation, aminoguanidine hydrochloride, did not decrease the level of blood glucose, but veduced plasma and tissue AGEs, and diminish the changes of VSMC at the same time. Conclusions In early diabetes, VSMC exhibits a tendency of transformation from the contractile phenotype to the synthetic one, and AGEs is an important factor for this changes.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes mellitus; Advanced gycation end products; Vascular smooth muscle cell;Rat
血管病变是糖尿病慢性并发症的主要病理表现，包括微血管病变和大血管病变。后者在早期主要是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和胶原纤维增多，弹性纤维减少，动脉增厚等，引起动脉的顺应性降低，舒张功能减弱[1～3];晚期主要表现为动脉粥样硬化和动脉硬化，其中以VSMC的增生和迁移较为突出，其表型也由收缩型转化为合成型[4，5]。VSMC的表型转化是血管病变发展为动脉粥样硬化的重要步骤，这种转化在糖尿病早期是否已经发生，未见报道。晚期糖化终产物(advanced glycation end products, AGEs)与糖尿病主动脉重建密切相关[6，7]，但AGEs对VSMC的结构和功能，特别是表型有何影响，目前少有研究。为此，本实验拟观察糖尿病大鼠早期腹主动脉VSMC的超微结构、α-SM-肌动蛋白和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor-A, PDGF-A)的变化及其与AGEs的关系，研究VSMC在糖尿病早期结构和功能的改变，探讨糖尿病血管重建的机制。
, 百拇医药
材料和方法
1.动物模型的建立和分组
体重195±10g的雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)60只，随机分为对照组(C组，n=20)、糖尿病组(diabetes mellitus,DM组，n=20)和糖尿病盐酸氨基胍治疗组(aminoguanidine hydrochloride,AG组，n=20)。DM组和AG组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,美国Sigma公司)60mg/kg(临用前以0.1 mol/L，pH4.0枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制)，对照组注射相同缓冲液。48h后，取尾静脉血，One Touch Ⅱ血糖仪(美国Lifescan公司)测空腹血糖，以空腹血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型；AG组开始于饮水中给予非酶糖化抑制剂盐酸氨基胍(美国Sigma公司)100mg/(kg*d)。每周及实验前测空腹血糖，STZ注射后1、4、8、12周，每组各取5只进行检测。
, 百拇医药
2.取材和固定
1%戊巴比妥钠麻醉，颈总动脉插管，收集血液，肝素抗凝；每小组以3例灌注生理盐水和4%多聚甲醛，另外2例灌注生理盐水和2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，在左肾动脉起点下方切取腹主动脉，分别保存于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛。
3.血浆AGEs的测定
血液离心，取上清液0.2ml，蒸馏水稀释至2ml，Hitachi 850荧光分光光度计测定荧光值，激发光和发射光波长分别为370nm和440nm；考马斯亮蓝法测定稀释液的蛋白质浓度；用U/mg表示血浆AGEs水平。
4.腹主动脉的免疫组织化学观察
取4%多聚甲醛保存的标本，常规石蜡切片，片厚5μm。SP法显示腹主动脉的AGEs、α-SM-肌动蛋白和PDGF-A。兔抗AGE-HSA多克隆抗体(1∶200)为本室制备，即用型SP试剂盒和即用型兔抗鼠平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，兔抗人PDGF-A单克隆抗体(1∶150)购自美国Gene公司。用计算机图像分析系统计算动脉壁内α-SM-肌动蛋白阳性面积占视窗面积的百分比。AGEs和PDGF-A结果的判断是，基本无染色者为阴性，染色呈点状分布者为弱阳性，呈散在的片状分布者为中度阳性，呈连续的片状分布者为强阳性。
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5.腹主动脉的显微结构
取石蜡切片进行HE染色，在光镜下用目镜网格测微尺计算腹主动脉平滑肌的细胞核密度，每例标本取3张切片，每张切片取动脉环的3、6、9、12点共4个视野进行观察。取2.5%戊二醛保存的标本，常规超薄切片，片厚50mm，醋酸铀和枸橡酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜观察VSMC的超微结构。
6. 数据处理
所得数据进行统计学处理，定量资料用t检验，半定量资料用χ2检验。
结 果
1.空腹血糖
C组血糖保持正常。DM组和AG组处于持续的高血糖状态，两组之间在各时相点均无显著差异(P>0.05)(表1)。
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2.血浆和腹主动脉的AGEs
2.1 血浆AGEs：C组在各时相点之间均无显著差异。DM组从4周起，AG组从12周起，血浆AGEs均显著高于C组；DM组到12周时又高于AG组(表1)。
2.2 腹主动脉AGEs的免疫组织化学反应：C组在各时相点基本为阴性。DM组从4周起，AG组从8周起多呈阳性。AG组的反应介于DM组和C组之间(表2，图1)。
3.腹主动脉的VSMC
3.1 细胞核密度：C组在各时相点之间均无显著差异。DM组从4周起，AG组从8周起，其细胞核密度显著大于C组。DM组从4周起大于AG组，在4周和12周时具有显著差异(表3)。表1 空腹血糖和血浆AGEs(
±s)
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Talble 1 Fast blood glucose and plasma AGEs(±s)
空腹血糖(mmol/L)
fast blood glucose(mmol/L)
血浆 AGEs(10-3U/mg)
plasma AGEs(10-3U/mg)
C组
DM组
AG组
C组
, 百拇医药
DM组
AG组
1周
3.18±0.38
22.20±3.56△△
21.68±2.00△△
0.61±0.16
0.80±0.08
0.66±0.15
4周
3.14±0.40
19.90±1.41△△
, 百拇医药
19.68±3.93△△
0.47±0.38
0.90±0.14△
0.63±0.13
8周
3.60±0.10
24.00±7.44△△
24.80±3.47△△
0.62±0.30
1.07±0.11△
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0.71±0.24
12周
3.24±0.25
23.00±7.78△△
27.42±2.77△△
0.62±0.17
1.52±0.36△△
1.04±0.13△△＃
注：△.vs C组，P<0.05；△△.vs C组，P<0.01；＃.vs DM组，P<0.05表2 腹主动脉AGEs免疫组织化学反应的比较(%)
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Table 2 Comparation of immunohistochemical reaction of
AGEs in the abdominal aorta(%)
1周
4周
8周
12周
C组
阴性negative
100.0
93.3
86.7
, 百拇医药
86.7
弱阳性weak positive
0
6.7
13.3
13.3
中度阳性moderate positive
0
0
0
0
强阳性strong positive
, 百拇医药
0
0
0
0
DM组
阴性negative
73.3
26.7
6.7
0
弱阳性weak positive
26.7
60.0
, 百拇医药
40.0
13.3
中度阳性moderate positive
0
13.3
40.0
40.0
强阳性strong positive
0
0
13.3
46.7
, 百拇医药 AG组
阴性negative
93.3
66.7
20.0
0
弱阳性weak positive
6.7
33.3
46.7
60.0
中度阳性moderate positive
, http://www.100md.com
0
0
33.3
26.7
强阳性strong positive
0
0
0
13.3
表3 腹主动脉平滑肌的细胞核密度
(±s×103个/mm2)
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Table 3 Density of nucleus of smooth muscle cell
in the abdominal aorta (±s×103个/mm)
C组
DM组
AG组
1周
2.63±0.73
2.77±0.80
2.96±0.57
, 百拇医药 4周
2.22±0.45
3.44±0.85△
2.91±0.72＃
8周
2.24±0.58
3.76±1.01△
3.73±0.61△
12周
2.04±0.49
4.16±0.97△
, 百拇医药
3.73±0.77△＃
注：△.vs C组，P<0.05；＃.vs DM组，P<0.05
3.2 超微结构：C组VSMC的胞质含肌丝为主，其他细胞器较少。DM组VSMC的线粒体和粗面内质网4周时开始增多，12周时明显增多，分布范围可达细胞中层以至外层；AG组VSMC的线粒体和粗面内质网多于C组，少于DM组。
4.腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积
C组的α-SM-肌动蛋白的阳性面积随时间逐步增大，DM组和AG组则在4周以后才开始增大；DM组从4周起显著低于AG组和C组；AG组低于C组但无显著差异(表4)。
表4 腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积(±s %)
, 百拇医药
Table 4 Relative area of α-SM-actin of the
abdominal aorta (±s %)
C组
DM组
AG组
1周
16.7±4.9
13.0±2.5
15.8±1.9
4周
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19.0±5.4
10.8±2.8△
15.7±3.6＃
8周
22.6±5.3
17.1±2.7△
21.6±5.0＃
12周
26.4±7.4
19.9±2.9△
23.9±5.5＃
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注：△.vs C组；P<0.05；＃.vs DM组，P<0.05
5.腹主动脉PDGF-A的免疫组织化学反应
1周时，各组均以阳性为主；C组从4周起转为以阴性为主；DM组基本上呈持续的阳性反应且逐步增强，染色强度和范围从4周起大于C组(P<0.01)；AG组在4周多数转为阴性，从8周起恢复以阳性为主，其变化介于DM组和C组之间(表5，图2)。
表5 腹主动脉PDGF-A免疫组织化学反应的比较(%)
Table 5 Comparation of immunohistochemical reaction of
PDGF in the abdominal aorta(%)
1周
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4周
8周
12周
C组
阴性negative
20.0
73.3
93.3
93.3
弱阳性weak positive
66.7
26.7
6.7
, 百拇医药
6.7
中度阳性moderate positive
13.3
0
0
0
强阳性strong positive
0
0
0
0
DM组
阴性negative
, http://www.100md.com
13.3
13.3
6.7
0
弱阳性weak positive
66.7
33.3
33.3
20.0
中度阳性moderate positive
13.3
53.3
, http://www.100md.com
33.3
46.7
强阳性strong positive
6.7
0
26.7
33.3
AG组
阴性negative
20.0
80.0
26.7
13.3
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弱阳性weak positive
46.7
20.0
3.3
46.7
中度阳性moderate positive
26.7
0
20.0
6.7
强阳性strong positive
6.7
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0
0
13.3
讨论
VSMC有两种表型。成年个体为收缩型，细胞呈梭形，无分裂增殖现象。Bagby将其三维结构分为3层，内层为核心区，含线粒体等少量细胞器；中层为轴心区，主要由细胞骨架组成；外层为周围区，是肌丝的集中地，以α-SM-肌动蛋白为主。在生长发育时期或疾病状态，VSMC的结构呈合成型，细胞形态与成纤维细胞相似，细胞内肌丝较少，以β、γ-肌动蛋白为主，含有大量线粒体和粗面内质网，能进行活跃的分裂增殖。α-SM-肌动蛋白是VSMC的一种标志蛋白，其相对含量是判断VSMC表型的重要指标[8]。α-SM-肌动蛋白的合成受某些生长因子的调节，PDGF就具有下调作用。PDGF由A、B 2条肽链构成，形成AA、AB、BB 3种二聚体。VSMC的表面有PDGF受体，并含有PDGF-A的mRNA，在PDGF或其他因素的作用下能合成自身的PDGF，并以自分泌方式抑制α-SM-肌动蛋白的合成，促进VSMC的增殖与合成，最终导致VSMC由收缩型转化为合成型[9]。本实验结果显示，糖尿病大鼠早期腹主动脉VSMC的细胞形态虽未出现明显变化，但腹主动脉的细胞核密度增大，VSMC的线粒体、粗面内质网明显增多，α-SM-肌动蛋白减少，PDGF-A的免疫组织化学反应也有相应的变化，提示糖尿病早期VSMC的增殖能力有所提高，并已出现由收缩型向合成型转化的趋势。
, 百拇医药
非酶糖化(nonenzymatic glycosylation)是还原糖(如葡萄糖)的醛基与蛋白质的游离氨基之间发生的非酶促反应，可分为可逆的早期反应和不可逆的晚期反应2个阶段，AGEs即是晚期反应形成的不可逆产物。AGEs可引起蛋白质的分子间交联增多，并通过受体介导使内皮细胞、单核细胞等发生增殖与合成等功能的改变，从而导致糖尿病血管重建[10，11]。氨基胍可通过抑制非酶糖化早期反应减少AGEs的形成。本实验结果表明，VSMC的结构改变与血浆和组织AGEs动态变化的出现时间相一致，盐酸氨基胍不降低血糖，但能减少循环和组织AGEs的含量，同时对VSMC的改变有抑制作用，参与调节VSMC表型转化的PDGF-A的含量也发生了相应的变化。因此AGEs是糖尿病大鼠VSMC发生改变，尤其是表型转化的重要原因。
图1 12周腹主动脉AGEs的免疫组织化学反应。C组基本为阴性，DM组多数为中、强阳性，AG组以弱阳性为主 3.3×40
, 百拇医药
Fig.1 Immunohistochemical reaction of AGEs in the abdominal aorta at the 12th week. It was mainly negative in C group, and mainly moderate and strong positive in DM group, and mainly weak positive in AG group. 3.3×40
图2 12周腹主动脉PDGF-A的免疫组织化学反应。C组基本为阴性，DM组为强阳性，AG组为阳性但弱于DM组 3.3×40
Fig.2 Immunohistochemical reaction of PDGF-A in the abdominal aorta at the 12th week. It was negative on the whole in C group, and strong positive in DM group. In AG group, it was positive but was weaker than DM group. 3.3×40
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【作者简介】 陶凯忠(1969—)，男(土家族)，重庆市石柱县人，医学博士，讲师
参考文献
[1] Liu SQ, Fung YC. Influence of STZ-induced diabetes on zero-stress state of rat pulmonary and systemic arteries[J]. Diabetes, 1992,41(2)：136-146.
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【收稿日期】 1999-07-23
【修回日期】 2000-03-14, 百拇医药
单位：陶凯忠(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)；陈尔瑜(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)；姜宗来(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)；张传森(第二军医大学解剖学教研室，上海 200433)
关键词：糖尿病；晚期糖化终产物；血管平滑肌细胞；大鼠
解剖学报000409 【摘要】 目的 探讨血管平滑肌细胞(VSMC)在糖尿病早期的改变及其与晚期糖化终产物(AGEs)的关系。 方法 应用荧光分光光度法、免疫组织化学、计算机图像分析和透射电镜等技术，研究链脲佐菌素诱导的糖尿病(DM)大鼠血浆和腹主动脉晚期糖化终产物(AGEs)的含量以及腹主动脉VSMC的变化。 结果 从4周起，DM大鼠血浆和腹主动脉的AGEs显著增多；腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积减小，VSMC的细胞核密度增大，线粒体和粗面内质网增多。DM大鼠腹主动脉血小板源生长因子-A的免疫组织化学反应呈持续阳性。非酶糖化抑制剂氨基胍不降低血糖，但能降低血浆和组织的AGEs水平，对VSMC的改变也有减缓作用。 结论 VSMC在糖尿病早期已出现由收缩型向合成型转化的趋势，AGEs是VSMC发生改变的重要因素。
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【中图分类号】 R587.202 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-327
EFFECTS OF ADVANCED GLYCATION END PRODUCTS ON AORTIC
SMOOTH MUSCLE CELL OF STZ-INDUCED DIABETIC RAT
TAO Kai-zhong CHEN Er-yu JIANG Zong-lai ZHANG Chuan-sen
(Department of Anatomy, the Second Military Medical University, Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective The changes of vascular smooth muscle cell(VSMC) in early diabetes and their relationship with advanced glycation end products(AGEs) were studied. Methods The changes of contents of AGEs in plasma and the abdominal aorta and changes of VSMC of the abdominal aorta were investigated with methods of fluorospectrophotometry, immunohistochemistry, computer image analysis and transmission electron microscopy on streptozotocin-induced diabetic rats. Results From the fourth week, in diabetic rats, the contents of AGEs in plasma and the abdominal aorta increased, the relative area of α-SM-actin in the abdominal aorta decreased, the density of nucleus of VSMC increased, and mitochondria and rough endoplasmic reticules in VSMC increased. The immunohistochemical reaction of platelet-derived growth factor-A(PDGF-A) was persistent positive in diabetic rats. The inhibitor of nonenzymatic glycosylation, aminoguanidine hydrochloride, did not decrease the level of blood glucose, but veduced plasma and tissue AGEs, and diminish the changes of VSMC at the same time. Conclusions In early diabetes, VSMC exhibits a tendency of transformation from the contractile phenotype to the synthetic one, and AGEs is an important factor for this changes.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes mellitus; Advanced gycation end products; Vascular smooth muscle cell;Rat
血管病变是糖尿病慢性并发症的主要病理表现，包括微血管病变和大血管病变。后者在早期主要是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和胶原纤维增多，弹性纤维减少，动脉增厚等，引起动脉的顺应性降低，舒张功能减弱[1～3];晚期主要表现为动脉粥样硬化和动脉硬化，其中以VSMC的增生和迁移较为突出，其表型也由收缩型转化为合成型[4，5]。VSMC的表型转化是血管病变发展为动脉粥样硬化的重要步骤，这种转化在糖尿病早期是否已经发生，未见报道。晚期糖化终产物(advanced glycation end products, AGEs)与糖尿病主动脉重建密切相关[6，7]，但AGEs对VSMC的结构和功能，特别是表型有何影响，目前少有研究。为此，本实验拟观察糖尿病大鼠早期腹主动脉VSMC的超微结构、α-SM-肌动蛋白和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor-A, PDGF-A)的变化及其与AGEs的关系，研究VSMC在糖尿病早期结构和功能的改变，探讨糖尿病血管重建的机制。
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材料和方法
1.动物模型的建立和分组
体重195±10g的雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)60只，随机分为对照组(C组，n=20)、糖尿病组(diabetes mellitus,DM组，n=20)和糖尿病盐酸氨基胍治疗组(aminoguanidine hydrochloride,AG组，n=20)。DM组和AG组腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,美国Sigma公司)60mg/kg(临用前以0.1 mol/L，pH4.0枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制)，对照组注射相同缓冲液。48h后，取尾静脉血，One Touch Ⅱ血糖仪(美国Lifescan公司)测空腹血糖，以空腹血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型；AG组开始于饮水中给予非酶糖化抑制剂盐酸氨基胍(美国Sigma公司)100mg/(kg*d)。每周及实验前测空腹血糖，STZ注射后1、4、8、12周，每组各取5只进行检测。
, 百拇医药
2.取材和固定
1%戊巴比妥钠麻醉，颈总动脉插管，收集血液，肝素抗凝；每小组以3例灌注生理盐水和4%多聚甲醛，另外2例灌注生理盐水和2%多聚甲醛-2.5%戊二醛，在左肾动脉起点下方切取腹主动脉，分别保存于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛。
3.血浆AGEs的测定
血液离心，取上清液0.2ml，蒸馏水稀释至2ml，Hitachi 850荧光分光光度计测定荧光值，激发光和发射光波长分别为370nm和440nm；考马斯亮蓝法测定稀释液的蛋白质浓度；用U/mg表示血浆AGEs水平。
4.腹主动脉的免疫组织化学观察
取4%多聚甲醛保存的标本，常规石蜡切片，片厚5μm。SP法显示腹主动脉的AGEs、α-SM-肌动蛋白和PDGF-A。兔抗AGE-HSA多克隆抗体(1∶200)为本室制备，即用型SP试剂盒和即用型兔抗鼠平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，兔抗人PDGF-A单克隆抗体(1∶150)购自美国Gene公司。用计算机图像分析系统计算动脉壁内α-SM-肌动蛋白阳性面积占视窗面积的百分比。AGEs和PDGF-A结果的判断是，基本无染色者为阴性，染色呈点状分布者为弱阳性，呈散在的片状分布者为中度阳性，呈连续的片状分布者为强阳性。
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5.腹主动脉的显微结构
取石蜡切片进行HE染色，在光镜下用目镜网格测微尺计算腹主动脉平滑肌的细胞核密度，每例标本取3张切片，每张切片取动脉环的3、6、9、12点共4个视野进行观察。取2.5%戊二醛保存的标本，常规超薄切片，片厚50mm，醋酸铀和枸橡酸铅染色，JEM-1200EX透射电镜观察VSMC的超微结构。
6. 数据处理
所得数据进行统计学处理，定量资料用t检验，半定量资料用χ2检验。
结 果
1.空腹血糖
C组血糖保持正常。DM组和AG组处于持续的高血糖状态，两组之间在各时相点均无显著差异(P>0.05)(表1)。
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2.血浆和腹主动脉的AGEs
2.1 血浆AGEs：C组在各时相点之间均无显著差异。DM组从4周起，AG组从12周起，血浆AGEs均显著高于C组；DM组到12周时又高于AG组(表1)。
2.2 腹主动脉AGEs的免疫组织化学反应：C组在各时相点基本为阴性。DM组从4周起，AG组从8周起多呈阳性。AG组的反应介于DM组和C组之间(表2，图1)。
3.腹主动脉的VSMC
3.1 细胞核密度：C组在各时相点之间均无显著差异。DM组从4周起，AG组从8周起，其细胞核密度显著大于C组。DM组从4周起大于AG组，在4周和12周时具有显著差异(表3)。表1 空腹血糖和血浆AGEs(
±s), http://www.100md.com
Talble 1 Fast blood glucose and plasma AGEs(
±s)空腹血糖(mmol/L)
fast blood glucose(mmol/L)
血浆 AGEs(10-3U/mg)
plasma AGEs(10-3U/mg)
C组
DM组
AG组
C组
, 百拇医药
DM组
AG组
1周
3.18±0.38
22.20±3.56△△
21.68±2.00△△
0.61±0.16
0.80±0.08
0.66±0.15
4周
3.14±0.40
19.90±1.41△△
, 百拇医药
19.68±3.93△△
0.47±0.38
0.90±0.14△
0.63±0.13
8周
3.60±0.10
24.00±7.44△△
24.80±3.47△△
0.62±0.30
1.07±0.11△
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0.71±0.24
12周
3.24±0.25
23.00±7.78△△
27.42±2.77△△
0.62±0.17
1.52±0.36△△
1.04±0.13△△＃
注：△.vs C组，P<0.05；△△.vs C组，P<0.01；＃.vs DM组，P<0.05表2 腹主动脉AGEs免疫组织化学反应的比较(%)
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Table 2 Comparation of immunohistochemical reaction of
AGEs in the abdominal aorta(%)
1周
4周
8周
12周
C组
阴性negative
100.0
93.3
86.7
, 百拇医药
86.7
弱阳性weak positive
0
6.7
13.3
13.3
中度阳性moderate positive
0
0
0
0
强阳性strong positive
, 百拇医药
0
0
0
0
DM组
阴性negative
73.3
26.7
6.7
0
弱阳性weak positive
26.7
60.0
, 百拇医药
40.0
13.3
中度阳性moderate positive
0
13.3
40.0
40.0
强阳性strong positive
0
0
13.3
46.7
, 百拇医药 AG组
阴性negative
93.3
66.7
20.0
0
弱阳性weak positive
6.7
33.3
46.7
60.0
中度阳性moderate positive
, http://www.100md.com
0
0
33.3
26.7
强阳性strong positive
0
0
0
13.3
表3 腹主动脉平滑肌的细胞核密度
(
±s×103个/mm2), http://www.100md.com
Table 3 Density of nucleus of smooth muscle cell
in the abdominal aorta (
±s×103个/mm)C组
DM组
AG组
1周
2.63±0.73
2.77±0.80
2.96±0.57
, 百拇医药 4周
2.22±0.45
3.44±0.85△
2.91±0.72＃
8周
2.24±0.58
3.76±1.01△
3.73±0.61△
12周
2.04±0.49
4.16±0.97△
, 百拇医药
3.73±0.77△＃
注：△.vs C组，P<0.05；＃.vs DM组，P<0.05
3.2 超微结构：C组VSMC的胞质含肌丝为主，其他细胞器较少。DM组VSMC的线粒体和粗面内质网4周时开始增多，12周时明显增多，分布范围可达细胞中层以至外层；AG组VSMC的线粒体和粗面内质网多于C组，少于DM组。
4.腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积
C组的α-SM-肌动蛋白的阳性面积随时间逐步增大，DM组和AG组则在4周以后才开始增大；DM组从4周起显著低于AG组和C组；AG组低于C组但无显著差异(表4)。
表4 腹主动脉α-SM-肌动蛋白的相对面积(
±s %), 百拇医药
Table 4 Relative area of α-SM-actin of the
abdominal aorta (
±s %)C组
DM组
AG组
1周
16.7±4.9
13.0±2.5
15.8±1.9
4周
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19.0±5.4
10.8±2.8△
15.7±3.6＃
8周
22.6±5.3
17.1±2.7△
21.6±5.0＃
12周
26.4±7.4
19.9±2.9△
23.9±5.5＃
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注：△.vs C组；P<0.05；＃.vs DM组，P<0.05
5.腹主动脉PDGF-A的免疫组织化学反应
1周时，各组均以阳性为主；C组从4周起转为以阴性为主；DM组基本上呈持续的阳性反应且逐步增强，染色强度和范围从4周起大于C组(P<0.01)；AG组在4周多数转为阴性，从8周起恢复以阳性为主，其变化介于DM组和C组之间(表5，图2)。
表5 腹主动脉PDGF-A免疫组织化学反应的比较(%)
Table 5 Comparation of immunohistochemical reaction of
PDGF in the abdominal aorta(%)
1周
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4周
8周
12周
C组
阴性negative
20.0
73.3
93.3
93.3
弱阳性weak positive
66.7
26.7
6.7
, 百拇医药
6.7
中度阳性moderate positive
13.3
0
0
0
强阳性strong positive
0
0
0
0
DM组
阴性negative
, http://www.100md.com
13.3
13.3
6.7
0
弱阳性weak positive
66.7
33.3
33.3
20.0
中度阳性moderate positive
13.3
53.3
, http://www.100md.com
33.3
46.7
强阳性strong positive
6.7
0
26.7
33.3
AG组
阴性negative
20.0
80.0
26.7
13.3
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弱阳性weak positive
46.7
20.0
3.3
46.7
中度阳性moderate positive
26.7
0
20.0
6.7
强阳性strong positive
6.7
, http://www.100md.com
0
0
13.3
讨论
VSMC有两种表型。成年个体为收缩型，细胞呈梭形，无分裂增殖现象。Bagby将其三维结构分为3层，内层为核心区，含线粒体等少量细胞器；中层为轴心区，主要由细胞骨架组成；外层为周围区，是肌丝的集中地，以α-SM-肌动蛋白为主。在生长发育时期或疾病状态，VSMC的结构呈合成型，细胞形态与成纤维细胞相似，细胞内肌丝较少，以β、γ-肌动蛋白为主，含有大量线粒体和粗面内质网，能进行活跃的分裂增殖。α-SM-肌动蛋白是VSMC的一种标志蛋白，其相对含量是判断VSMC表型的重要指标[8]。α-SM-肌动蛋白的合成受某些生长因子的调节，PDGF就具有下调作用。PDGF由A、B 2条肽链构成，形成AA、AB、BB 3种二聚体。VSMC的表面有PDGF受体，并含有PDGF-A的mRNA，在PDGF或其他因素的作用下能合成自身的PDGF，并以自分泌方式抑制α-SM-肌动蛋白的合成，促进VSMC的增殖与合成，最终导致VSMC由收缩型转化为合成型[9]。本实验结果显示，糖尿病大鼠早期腹主动脉VSMC的细胞形态虽未出现明显变化，但腹主动脉的细胞核密度增大，VSMC的线粒体、粗面内质网明显增多，α-SM-肌动蛋白减少，PDGF-A的免疫组织化学反应也有相应的变化，提示糖尿病早期VSMC的增殖能力有所提高，并已出现由收缩型向合成型转化的趋势。
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非酶糖化(nonenzymatic glycosylation)是还原糖(如葡萄糖)的醛基与蛋白质的游离氨基之间发生的非酶促反应，可分为可逆的早期反应和不可逆的晚期反应2个阶段，AGEs即是晚期反应形成的不可逆产物。AGEs可引起蛋白质的分子间交联增多，并通过受体介导使内皮细胞、单核细胞等发生增殖与合成等功能的改变，从而导致糖尿病血管重建[10，11]。氨基胍可通过抑制非酶糖化早期反应减少AGEs的形成。本实验结果表明，VSMC的结构改变与血浆和组织AGEs动态变化的出现时间相一致，盐酸氨基胍不降低血糖，但能减少循环和组织AGEs的含量，同时对VSMC的改变有抑制作用，参与调节VSMC表型转化的PDGF-A的含量也发生了相应的变化。因此AGEs是糖尿病大鼠VSMC发生改变，尤其是表型转化的重要原因。
图1 12周腹主动脉AGEs的免疫组织化学反应。C组基本为阴性，DM组多数为中、强阳性，AG组以弱阳性为主 3.3×40
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Fig.1 Immunohistochemical reaction of AGEs in the abdominal aorta at the 12th week. It was mainly negative in C group, and mainly moderate and strong positive in DM group, and mainly weak positive in AG group. 3.3×40
图2 12周腹主动脉PDGF-A的免疫组织化学反应。C组基本为阴性，DM组为强阳性，AG组为阳性但弱于DM组 3.3×40
Fig.2 Immunohistochemical reaction of PDGF-A in the abdominal aorta at the 12th week. It was negative on the whole in C group, and strong positive in DM group. In AG group, it was positive but was weaker than DM group. 3.3×40
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【作者简介】 陶凯忠(1969—)，男(土家族)，重庆市石柱县人，医学博士，讲师
参考文献
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【收稿日期】 1999-07-23
【修回日期】 2000-03-14, 百拇医药