吗啡依赖大鼠脊髓Ⅱ板层初级传入纤维突触性终末数量变化的电镜定量研究
作者：曾园山 吴金浪 陈穗君 张惠君
单位：曾园山(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室) 吴金浪(电镜室)；陈穗君(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)；张惠君(解剖学教研室，广州 510089)
关键词：吗啡；依赖；脊髓Ⅱ板层；初级传入纤维；突触发生；侧支出芽
解剖学报000404 【摘要】 目的 应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下，大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。 方法 用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L4脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下，直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化。 结果 吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数，明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数。其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%。来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%。尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%。 结论 吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下，大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。 方法 用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L4脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下，直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化。 结果 吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数，明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数。其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%。来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%。尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%。 结论 吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。
, 百拇医药
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-302
CHANGES OF SYNAPTIC TERMINAL NUMBER OF PRIMARY
AFFERENT FIBERS IN SPINAL CORD LAMINA Ⅱ OF
MORPHINE DEPENDENT RAT-AN EM QUANTITATIVE STUDY
ZENG Yuan-shan CHEN Sui-jun
(Division of Neurosciencens,Department of Histology and Embryology)
WU Jin-lang
, 百拇医药
(Electron Microscope Room)
ZHANG Hui-jun
(Departmeat of Anatomy,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China)
【Abstract】 Objective
Whether the primary afferent fibers given rise by sensory neuron in dorsal root ganglion of rat could make collateral sprouting and form new synapses in spinal lamina Ⅱ under the morphine dependence was explored with EM quantitative method. Methods The number of synaptic terminals in the unit area of neuropil of L4 spinal lamina Ⅱ was compared between morphine dependent and control rats,because there was no significant change in the crosscut area of L\-4 spinal lamina Ⅱ of two groups of animal,which was estimated by aid of LM stereological method. Results The number of synaptic terminals from primary afferent fibers in spinal lamina Ⅱ in morphine dependent group was significantly more than that in control group,among which the number of synaptic terminals from unmyelinated afferent fibers increased 61%.The number of synaptic terminals from myelinated afferent fibers was 70% more than that in control group.In particular,the number of synaptic terminals containing dense-core vescles from the primary afferent fibers went up 98% over that of control group. Conclusion Morphine may promote the collateral sprouting and synaptogenesis of primary afferent fibers in spinal lamina Ⅱ.
, 百拇医药
【Key words】 Morphine; Dependence;Spinal cord laminaⅡ; Primary afferent fibers; Synaptogenesis; Sprouting
Hendry等[1]发现，吗啡依赖大鼠的脊髓组织提取液能促进体外培养的背根节神经元存活与生长，并推测该脊髓产生了某种神经营养活性物质。在此基础上，我们曾用吗啡依赖大鼠制作备用根模型(即切除动物一侧腰段背根和背根节，仅保留L4背根作为备用根)，目的是观察经过吗啡作用的大鼠脊髓产生的微环境变化，对备用根初级传入纤维侧支出芽和突触重建的影响。结果发现，手术侧备用根初级传入纤维在脊髓后角Ⅱ板层内的侧支出芽和突触重建明显加快，起到代偿因切除大部分背根造成靶神经元在结构上和功能上去神经支配的作用[2]。同时发现这种慢性注射吗啡的动物，没有切除背根侧(非手术侧)的L4背根初级传入纤维也发生了侧支出芽[3，4]。但还不清楚单纯吗啡依赖大鼠(不做备用根模型手术)的背根初级传入纤维，是否也像上述吗啡作用的备用根大鼠非手术侧背根初级传入纤维那样，以侧支出芽的方式进一步支配靶区。为此，本研究应用电镜定量方法，探讨在吗啡依赖条件下，大鼠的初级传入纤维能否在脊髓后角内侧支出芽和建立新的突触。这对了解造成吗啡依赖的形态学机制有重要的理论和实际意义。
, 百拇医药
材料和方法
1. 实验动物
10只SD雄性大鼠，体重约200g，分吗啡依赖组和对照组各5只。饲养在正常光、暗周期和笼养环境。
2. 吗啡依赖动物的制备
在吗啡依赖组大鼠腹腔内注射1%盐酸吗啡(青海制药厂产品)，每天2次。吗啡用量是[1]：第1d 10mg/kg、第2d 20mg/kg,第3d 40mg/kg,第4d 60mg/kg,第5d 80mg/kg、第6d 100mg/kg，以后吗啡用量维持在每天100mg/kg。对照组大鼠仅在腹腔内注射生理盐水，每天2次。两组动物于第40d行灌注固定。
3. 取材和光镜及电镜标本的制备
用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠。将胸腔打开，经左心室主动脉插管，先快速灌注每100ml含1%亚硝酸钠0.2ml和肝素200U的生理盐水，接着用含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)灌注固定。取出连同背根的腰骶段脊髓，切取一侧L4脊髓后角，置入上述新鲜固定液，4℃过液。再入1%锇酸后固定2h，树脂包埋。用钻石刀切取包含整个Ⅱ板层的横切超薄切片，裱于400目铜网上，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。并于紧邻超薄切片处切取半薄切片，裱于载玻片上，甲苯胺蓝染色。
, http://www.100md.com
4. 测量、摄片和计数
半薄切片上辨认脊髓后角Ⅱ板层横切面的要点是：Ⅱ板层呈均匀一致的浅染区，内侧份有背腹走行的有髓纤维束(图1)。应用体视学点计数法，在光镜下测量半薄切片上Ⅱ板层横切面积。在H600透镜电镜(×300)下，按位置关系将Ⅱ板层所占的铜网孔勾划于相应的方格纸上。再于×8 000下,在Ⅱ板层每个铜网孔的上、下处各拍摄1张神经毡的照片。每例动物一侧Ⅱ板层的超薄切片上平均拍摄19张照片。在电镜照片上辨认和计数两类突触性终末，即主要来自背根初级传入纤维的复合终末(CT)和主要为非背根神经纤维来源的简单终末(ST)[5～8]。为区分两类终末，仅计数有明确突触性连接，并有3～5个以上突触小泡靠近突触前膜的终末[8]；与1个以上的突触后成分形成突触者计为CT，仅与1个突触后成分形成突触者计为ST[8]。以上各项数据均经两样本均数t检验，求出P值。
结果
, http://www.100md.com
1. 吗啡依赖大鼠的行为变化
吗啡依赖组大鼠在注射吗啡第7d后，开始对钳夹其皮肤的刺激表现出异常躁动，并随着注射吗啡的次数增加而变得更加明显。在同笼的大鼠之间受到刺激时，较容易出现打斗现象(图2)。然而对照组大鼠的行为较为温驯，即使在注射生理盐水期间，也不会因受刺激而发生攻击行为。
2. L4脊髓后角Ⅱ板层横切面积
表1显示，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的横切面积与对照组大鼠的比较，没有显著性差异。因此，直接比较两组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层恒定单位面积(相当于108μm2)神经毡内突触性终末的数量变化，应能反映整个Ⅱ板层神经毡内突触性终末的数目变化，这为本研究抽样定量的可比性提供了依据。
3. Ⅱ板层神经毡突触性终末
, 百拇医药
两组动物L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡内，常见各种形态的ST(图3)和CT(图4～6)。还可见轴突、轴突终末、树突和树突棘之间的间隙填充着神经胶质细胞的胞突。此外，一些突触性终末内含致密核芯小泡在非突触部位紧靠轴膜分布。本研究在实际面积为108μm2的照片上，对Ⅱ板层神经毡单位面积内各类突触性终末的数目作了定量分析。
表1 两组大鼠脊髓Ⅱ板层横切面积(
±s，测试点数)的比较
Table 1 Comparison of crosscut area of spinal lamina Ⅱ
in two groups of rat (±s,test point number) 组别
, http://www.100md.com
groups
例数
(n)
Ⅱ板层横切面积(μm2)
crosscut area of lamina Ⅱ
对照组
control group
5
31.40±1.36
吗啡依赖组
morphine dependent group
, 百拇医药
5
31.20±1.24
P
>0.05
3.1 复合终末(CT)数：CT是来自背根初级传入纤维投射到脊髓后角Ⅱ板层的突触性终末，因结构和功能的不同分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型复合终末[9]。从表2可见，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的CT数，明显多于对照组大鼠(多69%，P<0.02)，表明吗啡能够促进新的CT形成。表2 两组大鼠脊髓Ⅱ板层CT数、ST数和突触性终末数
(±s个/108μm2)的比较
, http://www.100md.com
Table 2 Comparison of the number of CT,ST and
synaptic terminal in spinal lamina Ⅱ in two groups of rat
(±s/108μm2) 组别
groups
例数
(n)
CT数
number of
, http://www.100md.com
CT
ST数
number of
ST
突触性终末数
(CT+ST)
number of
synaptic terminal
对照组
control
5
3.79±0.58
, 百拇医药
11.38±0.50
15.16±1.04
吗啡依赖组
morphine
dependent group
5
6.42±0.89
13.90±0.68
20.33±1.39
(69%↑)
(22%↑)
(34%↑)
, http://www.100md.com
P
<0.02
<0.01
<0.01
3.1.1 Ⅰ型复合终末(CⅠ)数：CⅠ是CT中数量最多的一类，是来自背根无髓传入纤维的突触性终末。这种终末的轮廓不规则，轴质电子密度较高，含有较密集、大小不一、但分布较均一的圆形突触小泡，线粒体数量较少(图4)。吗啡依赖组大鼠L\-4脊髓后角Ⅱ板层的CI数目比对照组大鼠的增多61%(P<0.05，表3)，表明吗啡能够促进无髓传入纤维的侧支出芽和建立新的突触。
3.1.2 Ⅱ型复合终末(CⅡ)数：此类终末数量较CⅠ少，是来自背根有髓传入纤维的突触性终末。CⅡ的轮廓较为规则，轴质电子密度较低，其中含有密集程度不一，但大小较均一的圆形突触小泡，线粒体数量较多(图5)。吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的CⅡ数量与对照组大鼠比较，增多70%(P<0.05，表3)，表明吗啡能够促进有髓传入纤维的侧支出芽和建立新的突触。表3 两组大鼠脊髓Ⅱ板层CⅠ数、CⅡ数和CⅢ数
, 百拇医药
(±s个/108μm2)的比较
Table 3 Comparison of the number of CⅠ、CⅡ and CⅢ
at spinal lamina Ⅱ in two groups of rat(±s/108μm2) 组别
groups
例数
, 百拇医药
(n)
CⅠ数
number of
CⅠ
CⅡ数
numbdr of
CⅡ
CⅢ数
number of
CⅢ
对照组
control group
5
, 百拇医药
2.03±0.31
1.12±0.21
0.63±0.14
吗啡依赖组
morphine
dependent group
5
3.27±0.55
1.90±0.26
1.25±0.23
(61%↑)
(70%↑)
, http://www.100md.com
(98%↑)
P
<0.05
<0.05
<0.05
3.1.3 Ⅲ型复合终末(CⅢ)数：CⅢ的轮廓亦较为规则，含有较密集的圆形突触小泡，其中有些突触小泡较大，并含有较致密核芯(图6)。CⅢ是来自背根含有肽类突触小泡的初级传入纤维的突触性终末，是数量较少的一类CT。吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的CⅢ数明显比对照组大鼠增多98%(P<0.05，表3)，表明吗啡能够促进含肽类突触小泡的初级传入纤维侧支出芽和建立新的突触。
3.2 简单终末(ST)数：表2显示，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的ST数比对照组大鼠增多22%(P<0.01)，表明吗啡也能促进来自非背根神经纤维的侧支出芽和建立新的突触。
, 百拇医药
3.3 Ⅱ板层突触性终末数：此突触性终末数是指Ⅱ板层复合终末与简单终末相加的数目。从表2可见，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层突触性终末数，比对照组大鼠增多34%(P<0.01)。讨论
以往的研究结果已表明，经过7d递增性注射吗啡的大鼠已对吗啡产生依赖性[10]。本研究的实验组大鼠是经历了连续40d的吗啡注射，因此能够观察到吗啡依赖大鼠的一些行为发生异常变化。虽然每天给药两次，但是由于两次给药相隔的时间为12h，动物有可能在没有及时得到吗啡的情况下，脑内多巴胺能神经系统功能亢进[11]，以及脊髓代偿性建立的一些新的初级感觉传入通路可能增加了信息的传入。本研究发现，长时间处于吗啡依赖状态的大鼠，来自背根节神经元发出的初级传入纤维终末与脊髓后角Ⅱ板层的靶神经元建立的突触数量明显增多。在这些情况下，当受到一般性刺激后，动物有可能表现出躁动或攻击行为，如大鼠之间发生打斗或主动攻击钳夹它们的器具等。这些行为可能随着应用吗啡的次数增多而变得明显。
, 百拇医药
我们先前的研究报道[12]，吗啡依赖大鼠靠近背根节的背根内初级传入纤维没有发生侧支出芽，同时也提出需要进一步探讨吗啡依赖大鼠脊髓后角内是否有初级传入纤维的侧支出芽和建立新的突触联系。本研究的结果已经对这个问题做出了肯定的回答，并提示在吗啡作用下，背根节神经元发出的初级传入纤维是在其支配的靶神经元附近(即脊髓后角内)发生了侧支出芽。至于吗啡是如何促进初级传入纤维在脊髓后角Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触联系?目前还不清楚。我们推测有两种可能性：1.长时间应用吗啡，抑制初级传入纤维的信息输入，使其支配的靶神经元不断处于功能上去神经支配状态，就好像结构上去神经支配的那样，有可能导致去神经支配的靶区星形胶质细胞或靶神经元分泌一些神经营养活性物质[11，13，14]，诱导初级传入纤维侧支出芽以及建立突触联系，代偿靶神经元在功能上去神经支配的作用。2.吗啡直接作用带有阿片受体的背根节神经元，促使其发出的初级传入纤维出现侧支出芽，并与靶神经元建立更多的突触联系，企图摆脱吗啡长时间抑制其信息的输入。由此可见，第2种可能性只能促使含有阿片受体的初级传入纤维的突触性终末数目增多。但实际上本研究观察到初级传入纤维其他类型的复合终末数目都有增加，不过有程度上的不同。我们设想，功能上去神经支配的靶组织或细胞分泌的一些神经营养活性物质[1]，可能对不同类型的初级传入纤维的侧支出芽和建立新突触都有促进作用。但是，各类型的初级传入纤维终末之间在与靶神经元建立新突触方面可能存在竞争性[8]。本研究结果表明，吗啡明显促进含肽类神经递质或神经调质的突触小泡的初级传入纤维侧支出芽和建立新突触。因为CⅢ的数量增加将近一倍(98%)，而CⅠ和CⅡ的数量只分别增加61%和70%。一般认为[15]，吗啡能够阻断初级传入纤维终末释放P物质，这种肽类物质存在于含致密核芯的突触小泡内。在吗啡依赖条件下，脊髓后角的微环境变化可能优先促进CⅢ的形成，代偿这类突触性终末对靶神经元的影响。上述仅是我们的推测，还有待研究证实。
, 百拇医药
本研究还观察到，吗啡依赖大鼠脊髓后角Ⅱ板层的简单终末(ST)数增加了22%，表明来自脊髓内中间神经元轴突和下行传导束纤维也有可能侧支出芽和建立新的突触。其意义现在还不清楚，但提示了在吗啡依赖的条件下，脊髓内可能会形成更多的神经环路，对吗啡造成脊髓后角靶神经元在功能上去神经支配起代偿作用。
本文图1～6见插图第5页
图1 大鼠L4脊髓后角横断面的半薄切片；示Ⅰ(Ⅰ)、Ⅱ(Ⅱ)和Ⅲ(Ⅲ)板层。甲苯胺蓝染色 ×100
Fig.1 Observation of behavior of rats in morphine dependent group(L) and control group;showing morphine dependent rats(arrowhead) were fighting each other before morphine injected
, http://www.100md.com
图2 吗啡依赖组(L)和对照组(R)大鼠的行为观察；示在注射吗啡前，吗啡依赖组大鼠正在发生打斗行为(箭头)。 ×100
Fig.2 Crosscut area of L4 spinal dorsal horn of rat;showing laminaⅠ(Ⅰ),laminaⅡ(Ⅱ) and laminaⅢ(Ⅲ).Semithin section stained with toluidine blue ×100
图3 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示简单终末(ST)和树突(D)。(图3～6，×22 667，标尺示0.5μm)
Fig.3 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat;showing simple terminal(ST) and dendrite(D).(Fig.3-6,×22 667,scale Bar=0.5μm)
, 百拇医药
图4 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示Ⅰ型复合终末(CⅠ)和树突(D)。
Fig.4 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type Ⅰ complex terminal (CⅠ) and dendrite(D).
图5 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示Ⅱ型复合终末(CⅡ)和树突(D)。
Fig.5 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type Ⅱ complex terminal (CⅡ) and dendrite(D).
, http://www.100md.com
图6 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示Ⅲ型复合终末(CⅢ)和树突(D)。
Fig.6 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type Ⅲ complex terminal (CⅢ) and dendrite(D).
【基金项目】 广东省自然科学基金项目(970093)和教育部回国人员科研启动基金资助项目
【作者简介】 曾园山(1955—)，男(汉族)，广东梅县人，医学博士，教授
参考文献
[1]Hendry IA,Duggan AW,Hall JG.Morphine dependence in the rat:the appearance in the spinal cord of a dorsal root ganglion cell neurotrophic factor[J].J Neurosci Res,1987,18(3):439-442.
, 百拇医药
[2]曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠脊髓Ⅱ板层突触重建的影响——电镜定量研究[J].解剖学报，1993，24(2)：191～196.
[3]曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠背根内神经纤维侧支出芽的影响——电镜定量研究[J].神经解剖学杂志，1992，8(1)：53～56.
[4]曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠脊髓Ⅱ板层背根终末的影响——抗氟化物酸性磷酸酶组化定量研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1992，1(2)：203～209.
[5]Knyihar-Csillik E,Csillik B,Pakie P.Ultrastructure of normal and degenerating glomerular terminals of dorsal root axons in the substantia gelationsa of the Rhesus monkey[J]. J Comp Neurol,1982,210(4):357-375.
, 百拇医药
[6]Snyder RL.Light and electron microscopic autoradiographic study of the dorsal root projections to the cat dorsal horn[J].Neurosci,1982,7(6):1417-1437.
[7]Ralston HJ,Ralston DP.The distribution of dorsal root axons in laminae Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ of the macaque spinal cord.A quantitative electron microscopic study[J].J Comp Neurol,1979,184(4):643-684.
[8]Murray M,Goldberger ME.Replacement of synaptic terminals in lamina Ⅱ and Clark's nucleus after unilateral lumbosacral dorsal rhizotomy in adult cats[J].J Neurosci,1986,6(11):3205-3217.
, 百拇医药
[9]Ribeiro-Da-Silva A,Pignatelli D,Coimbra A.Synaptic architecture of glomeruli in superficial dorsal horn of rat spinal cord,as shown in serial reconstruction[J].J Neurocytol,1985,14(2):203-220.
[10]曾园山.吗啡对大鼠背根节和脊髓抗氟化物酸性磷酸酶活性的影响.中山医科大学学报，1995，16(1)：13～16.
[11]金文桥，金国章，洪庚辛.麻醉性镇痛剂的成瘾性实验.见徐叔云，卞如濂，陈修(主编).药理实验方法学[M].第2版，北京：人民卫生出版社，1991：707～712.
[12]曾园山，吴金浪.吗啡依赖大鼠背根神经纤维数量变化的电镜定量研究[J].神经解剖学杂志，1997，13(4)：367～370.
, 百拇医药
[13]曾园山，章尧，郭畹华，等.吗啡增强备用根大鼠脊髓后角组织提取液对培养鸡胚背根节的促神经突起生长的作用[J].解剖学报，1996，27(3)：238～242.
[14]Gage FH,Olejniczak P,Armstrong DM.Astrocytes are important for sprouting in the septohippocampal circuit[J].Exp Nearol,1988,102(1):2-13.
[15]Jessell TM,Iversen IL.Opiate analgesics inhibit substance P release from rat trigeminal nucleas[J].Nature,1977,268(5620):549-551.
【收稿日期】 1999-09-30
【修回日期】 2000-02-25, 百拇医药
单位：曾园山(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室) 吴金浪(电镜室)；陈穗君(中山医科大学组织学胚胎学教研室神经科学研究室)；张惠君(解剖学教研室，广州 510089)
关键词：吗啡；依赖；脊髓Ⅱ板层；初级传入纤维；突触发生；侧支出芽
解剖学报000404 【摘要】 目的 应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下，大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。 方法 用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L4脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下，直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化。 结果 吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数，明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数。其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%。来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%。尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%。 结论 吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。应用电镜定量方法探讨在吗啡依赖条件下，大鼠背根节感觉神经元发出的初级传入纤维能否在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。 方法 用光镜体视学方法测知吗啡依赖组和对照组大鼠L4脊髓Ⅱ板层横切面积没有差异的情况下，直接比较了两组动物脊髓Ⅱ板层神经毡单位面积内突触性终末的数量变化。 结果 吗啡依赖组脊髓Ⅱ板层来自初级传入纤维的突触性终末数，明显多于对照组的初级传入纤维突触性终末数。其中来自无髓传入纤维的突触性终末数与对照组同类型的突触性终末数比较增加61%。来自有髓传入纤维的突触性终末数比对照组增多70%。尤其是来自含有致密核芯小泡的初级传入纤维突触性终末数比对照组多98%。 结论 吗啡可能促进初级传入纤维在脊髓Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触。
, 百拇医药
【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-302
CHANGES OF SYNAPTIC TERMINAL NUMBER OF PRIMARY
AFFERENT FIBERS IN SPINAL CORD LAMINA Ⅱ OF
MORPHINE DEPENDENT RAT-AN EM QUANTITATIVE STUDY
ZENG Yuan-shan CHEN Sui-jun
(Division of Neurosciencens,Department of Histology and Embryology)
WU Jin-lang
, 百拇医药
(Electron Microscope Room)
ZHANG Hui-jun
(Departmeat of Anatomy,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089,China)
【Abstract】 Objective
Whether the primary afferent fibers given rise by sensory neuron in dorsal root ganglion of rat could make collateral sprouting and form new synapses in spinal lamina Ⅱ under the morphine dependence was explored with EM quantitative method. Methods The number of synaptic terminals in the unit area of neuropil of L4 spinal lamina Ⅱ was compared between morphine dependent and control rats,because there was no significant change in the crosscut area of L\-4 spinal lamina Ⅱ of two groups of animal,which was estimated by aid of LM stereological method. Results The number of synaptic terminals from primary afferent fibers in spinal lamina Ⅱ in morphine dependent group was significantly more than that in control group,among which the number of synaptic terminals from unmyelinated afferent fibers increased 61%.The number of synaptic terminals from myelinated afferent fibers was 70% more than that in control group.In particular,the number of synaptic terminals containing dense-core vescles from the primary afferent fibers went up 98% over that of control group. Conclusion Morphine may promote the collateral sprouting and synaptogenesis of primary afferent fibers in spinal lamina Ⅱ.
, 百拇医药
【Key words】 Morphine; Dependence;Spinal cord laminaⅡ; Primary afferent fibers; Synaptogenesis; Sprouting
Hendry等[1]发现，吗啡依赖大鼠的脊髓组织提取液能促进体外培养的背根节神经元存活与生长，并推测该脊髓产生了某种神经营养活性物质。在此基础上，我们曾用吗啡依赖大鼠制作备用根模型(即切除动物一侧腰段背根和背根节，仅保留L4背根作为备用根)，目的是观察经过吗啡作用的大鼠脊髓产生的微环境变化，对备用根初级传入纤维侧支出芽和突触重建的影响。结果发现，手术侧备用根初级传入纤维在脊髓后角Ⅱ板层内的侧支出芽和突触重建明显加快，起到代偿因切除大部分背根造成靶神经元在结构上和功能上去神经支配的作用[2]。同时发现这种慢性注射吗啡的动物，没有切除背根侧(非手术侧)的L4背根初级传入纤维也发生了侧支出芽[3，4]。但还不清楚单纯吗啡依赖大鼠(不做备用根模型手术)的背根初级传入纤维，是否也像上述吗啡作用的备用根大鼠非手术侧背根初级传入纤维那样，以侧支出芽的方式进一步支配靶区。为此，本研究应用电镜定量方法，探讨在吗啡依赖条件下，大鼠的初级传入纤维能否在脊髓后角内侧支出芽和建立新的突触。这对了解造成吗啡依赖的形态学机制有重要的理论和实际意义。
, 百拇医药
材料和方法
1. 实验动物
10只SD雄性大鼠，体重约200g，分吗啡依赖组和对照组各5只。饲养在正常光、暗周期和笼养环境。
2. 吗啡依赖动物的制备
在吗啡依赖组大鼠腹腔内注射1%盐酸吗啡(青海制药厂产品)，每天2次。吗啡用量是[1]：第1d 10mg/kg、第2d 20mg/kg,第3d 40mg/kg,第4d 60mg/kg,第5d 80mg/kg、第6d 100mg/kg，以后吗啡用量维持在每天100mg/kg。对照组大鼠仅在腹腔内注射生理盐水，每天2次。两组动物于第40d行灌注固定。
3. 取材和光镜及电镜标本的制备
用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠。将胸腔打开，经左心室主动脉插管，先快速灌注每100ml含1%亚硝酸钠0.2ml和肝素200U的生理盐水，接着用含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)灌注固定。取出连同背根的腰骶段脊髓，切取一侧L4脊髓后角，置入上述新鲜固定液，4℃过液。再入1%锇酸后固定2h，树脂包埋。用钻石刀切取包含整个Ⅱ板层的横切超薄切片，裱于400目铜网上，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。并于紧邻超薄切片处切取半薄切片，裱于载玻片上，甲苯胺蓝染色。
, http://www.100md.com
4. 测量、摄片和计数
半薄切片上辨认脊髓后角Ⅱ板层横切面的要点是：Ⅱ板层呈均匀一致的浅染区，内侧份有背腹走行的有髓纤维束(图1)。应用体视学点计数法，在光镜下测量半薄切片上Ⅱ板层横切面积。在H600透镜电镜(×300)下，按位置关系将Ⅱ板层所占的铜网孔勾划于相应的方格纸上。再于×8 000下,在Ⅱ板层每个铜网孔的上、下处各拍摄1张神经毡的照片。每例动物一侧Ⅱ板层的超薄切片上平均拍摄19张照片。在电镜照片上辨认和计数两类突触性终末，即主要来自背根初级传入纤维的复合终末(CT)和主要为非背根神经纤维来源的简单终末(ST)[5～8]。为区分两类终末，仅计数有明确突触性连接，并有3～5个以上突触小泡靠近突触前膜的终末[8]；与1个以上的突触后成分形成突触者计为CT，仅与1个突触后成分形成突触者计为ST[8]。以上各项数据均经两样本均数t检验，求出P值。
结果
, http://www.100md.com
1. 吗啡依赖大鼠的行为变化
吗啡依赖组大鼠在注射吗啡第7d后，开始对钳夹其皮肤的刺激表现出异常躁动，并随着注射吗啡的次数增加而变得更加明显。在同笼的大鼠之间受到刺激时，较容易出现打斗现象(图2)。然而对照组大鼠的行为较为温驯，即使在注射生理盐水期间，也不会因受刺激而发生攻击行为。
2. L4脊髓后角Ⅱ板层横切面积
表1显示，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的横切面积与对照组大鼠的比较，没有显著性差异。因此，直接比较两组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层恒定单位面积(相当于108μm2)神经毡内突触性终末的数量变化，应能反映整个Ⅱ板层神经毡内突触性终末的数目变化，这为本研究抽样定量的可比性提供了依据。
3. Ⅱ板层神经毡突触性终末
, 百拇医药
两组动物L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡内，常见各种形态的ST(图3)和CT(图4～6)。还可见轴突、轴突终末、树突和树突棘之间的间隙填充着神经胶质细胞的胞突。此外，一些突触性终末内含致密核芯小泡在非突触部位紧靠轴膜分布。本研究在实际面积为108μm2的照片上，对Ⅱ板层神经毡单位面积内各类突触性终末的数目作了定量分析。
表1 两组大鼠脊髓Ⅱ板层横切面积(
±s，测试点数)的比较Table 1 Comparison of crosscut area of spinal lamina Ⅱ
in two groups of rat (
±s,test point number) 组别, http://www.100md.com
groups
例数
(n)
Ⅱ板层横切面积(μm2)
crosscut area of lamina Ⅱ
对照组
control group
5
31.40±1.36
吗啡依赖组
morphine dependent group
, 百拇医药
5
31.20±1.24
P
>0.05
3.1 复合终末(CT)数：CT是来自背根初级传入纤维投射到脊髓后角Ⅱ板层的突触性终末，因结构和功能的不同分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型复合终末[9]。从表2可见，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的CT数，明显多于对照组大鼠(多69%，P<0.02)，表明吗啡能够促进新的CT形成。表2 两组大鼠脊髓Ⅱ板层CT数、ST数和突触性终末数
(
±s个/108μm2)的比较, http://www.100md.com
Table 2 Comparison of the number of CT,ST and
synaptic terminal in spinal lamina Ⅱ in two groups of rat
(
±s/108μm2) 组别groups
例数
(n)
CT数
number of
, http://www.100md.com
CT
ST数
number of
ST
突触性终末数
(CT+ST)
number of
synaptic terminal
对照组
control
5
3.79±0.58
, 百拇医药
11.38±0.50
15.16±1.04
吗啡依赖组
morphine
dependent group
5
6.42±0.89
13.90±0.68
20.33±1.39
(69%↑)
(22%↑)
(34%↑)
, http://www.100md.com
P
<0.02
<0.01
<0.01
3.1.1 Ⅰ型复合终末(CⅠ)数：CⅠ是CT中数量最多的一类，是来自背根无髓传入纤维的突触性终末。这种终末的轮廓不规则，轴质电子密度较高，含有较密集、大小不一、但分布较均一的圆形突触小泡，线粒体数量较少(图4)。吗啡依赖组大鼠L\-4脊髓后角Ⅱ板层的CI数目比对照组大鼠的增多61%(P<0.05，表3)，表明吗啡能够促进无髓传入纤维的侧支出芽和建立新的突触。
3.1.2 Ⅱ型复合终末(CⅡ)数：此类终末数量较CⅠ少，是来自背根有髓传入纤维的突触性终末。CⅡ的轮廓较为规则，轴质电子密度较低，其中含有密集程度不一，但大小较均一的圆形突触小泡，线粒体数量较多(图5)。吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的CⅡ数量与对照组大鼠比较，增多70%(P<0.05，表3)，表明吗啡能够促进有髓传入纤维的侧支出芽和建立新的突触。表3 两组大鼠脊髓Ⅱ板层CⅠ数、CⅡ数和CⅢ数
, 百拇医药
(
±s个/108μm2)的比较Table 3 Comparison of the number of CⅠ、CⅡ and CⅢ
at spinal lamina Ⅱ in two groups of rat(
±s/108μm2) 组别groups
例数
, 百拇医药
(n)
CⅠ数
number of
CⅠ
CⅡ数
numbdr of
CⅡ
CⅢ数
number of
CⅢ
对照组
control group
5
, 百拇医药
2.03±0.31
1.12±0.21
0.63±0.14
吗啡依赖组
morphine
dependent group
5
3.27±0.55
1.90±0.26
1.25±0.23
(61%↑)
(70%↑)
, http://www.100md.com
(98%↑)
P
<0.05
<0.05
<0.05
3.1.3 Ⅲ型复合终末(CⅢ)数：CⅢ的轮廓亦较为规则，含有较密集的圆形突触小泡，其中有些突触小泡较大，并含有较致密核芯(图6)。CⅢ是来自背根含有肽类突触小泡的初级传入纤维的突触性终末，是数量较少的一类CT。吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的CⅢ数明显比对照组大鼠增多98%(P<0.05，表3)，表明吗啡能够促进含肽类突触小泡的初级传入纤维侧支出芽和建立新的突触。
3.2 简单终末(ST)数：表2显示，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层的ST数比对照组大鼠增多22%(P<0.01)，表明吗啡也能促进来自非背根神经纤维的侧支出芽和建立新的突触。
, 百拇医药
3.3 Ⅱ板层突触性终末数：此突触性终末数是指Ⅱ板层复合终末与简单终末相加的数目。从表2可见，吗啡依赖组大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层突触性终末数，比对照组大鼠增多34%(P<0.01)。讨论
以往的研究结果已表明，经过7d递增性注射吗啡的大鼠已对吗啡产生依赖性[10]。本研究的实验组大鼠是经历了连续40d的吗啡注射，因此能够观察到吗啡依赖大鼠的一些行为发生异常变化。虽然每天给药两次，但是由于两次给药相隔的时间为12h，动物有可能在没有及时得到吗啡的情况下，脑内多巴胺能神经系统功能亢进[11]，以及脊髓代偿性建立的一些新的初级感觉传入通路可能增加了信息的传入。本研究发现，长时间处于吗啡依赖状态的大鼠，来自背根节神经元发出的初级传入纤维终末与脊髓后角Ⅱ板层的靶神经元建立的突触数量明显增多。在这些情况下，当受到一般性刺激后，动物有可能表现出躁动或攻击行为，如大鼠之间发生打斗或主动攻击钳夹它们的器具等。这些行为可能随着应用吗啡的次数增多而变得明显。
, 百拇医药
我们先前的研究报道[12]，吗啡依赖大鼠靠近背根节的背根内初级传入纤维没有发生侧支出芽，同时也提出需要进一步探讨吗啡依赖大鼠脊髓后角内是否有初级传入纤维的侧支出芽和建立新的突触联系。本研究的结果已经对这个问题做出了肯定的回答，并提示在吗啡作用下，背根节神经元发出的初级传入纤维是在其支配的靶神经元附近(即脊髓后角内)发生了侧支出芽。至于吗啡是如何促进初级传入纤维在脊髓后角Ⅱ板层侧支出芽和建立新的突触联系?目前还不清楚。我们推测有两种可能性：1.长时间应用吗啡，抑制初级传入纤维的信息输入，使其支配的靶神经元不断处于功能上去神经支配状态，就好像结构上去神经支配的那样，有可能导致去神经支配的靶区星形胶质细胞或靶神经元分泌一些神经营养活性物质[11，13，14]，诱导初级传入纤维侧支出芽以及建立突触联系，代偿靶神经元在功能上去神经支配的作用。2.吗啡直接作用带有阿片受体的背根节神经元，促使其发出的初级传入纤维出现侧支出芽，并与靶神经元建立更多的突触联系，企图摆脱吗啡长时间抑制其信息的输入。由此可见，第2种可能性只能促使含有阿片受体的初级传入纤维的突触性终末数目增多。但实际上本研究观察到初级传入纤维其他类型的复合终末数目都有增加，不过有程度上的不同。我们设想，功能上去神经支配的靶组织或细胞分泌的一些神经营养活性物质[1]，可能对不同类型的初级传入纤维的侧支出芽和建立新突触都有促进作用。但是，各类型的初级传入纤维终末之间在与靶神经元建立新突触方面可能存在竞争性[8]。本研究结果表明，吗啡明显促进含肽类神经递质或神经调质的突触小泡的初级传入纤维侧支出芽和建立新突触。因为CⅢ的数量增加将近一倍(98%)，而CⅠ和CⅡ的数量只分别增加61%和70%。一般认为[15]，吗啡能够阻断初级传入纤维终末释放P物质，这种肽类物质存在于含致密核芯的突触小泡内。在吗啡依赖条件下，脊髓后角的微环境变化可能优先促进CⅢ的形成，代偿这类突触性终末对靶神经元的影响。上述仅是我们的推测，还有待研究证实。
, 百拇医药
本研究还观察到，吗啡依赖大鼠脊髓后角Ⅱ板层的简单终末(ST)数增加了22%，表明来自脊髓内中间神经元轴突和下行传导束纤维也有可能侧支出芽和建立新的突触。其意义现在还不清楚，但提示了在吗啡依赖的条件下，脊髓内可能会形成更多的神经环路，对吗啡造成脊髓后角靶神经元在功能上去神经支配起代偿作用。
本文图1～6见插图第5页
图1 大鼠L4脊髓后角横断面的半薄切片；示Ⅰ(Ⅰ)、Ⅱ(Ⅱ)和Ⅲ(Ⅲ)板层。甲苯胺蓝染色 ×100
Fig.1 Observation of behavior of rats in morphine dependent group(L) and control group;showing morphine dependent rats(arrowhead) were fighting each other before morphine injected
, http://www.100md.com
图2 吗啡依赖组(L)和对照组(R)大鼠的行为观察；示在注射吗啡前，吗啡依赖组大鼠正在发生打斗行为(箭头)。 ×100
Fig.2 Crosscut area of L4 spinal dorsal horn of rat;showing laminaⅠ(Ⅰ),laminaⅡ(Ⅱ) and laminaⅢ(Ⅲ).Semithin section stained with toluidine blue ×100
图3 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示简单终末(ST)和树突(D)。(图3～6，×22 667，标尺示0.5μm)
Fig.3 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat;showing simple terminal(ST) and dendrite(D).(Fig.3-6,×22 667,scale Bar=0.5μm)
, 百拇医药
图4 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示Ⅰ型复合终末(CⅠ)和树突(D)。
Fig.4 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type Ⅰ complex terminal (CⅠ) and dendrite(D).
图5 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示Ⅱ型复合终末(CⅡ)和树突(D)。
Fig.5 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type Ⅱ complex terminal (CⅡ) and dendrite(D).
, http://www.100md.com
图6 大鼠L4脊髓后角Ⅱ板层神经毡，示Ⅲ型复合终末(CⅢ)和树突(D)。
Fig.6 The neuropil of lamina Ⅱ in L4 spinal dorsal horn of rat; showing type Ⅲ complex terminal (CⅢ) and dendrite(D).
【基金项目】 广东省自然科学基金项目(970093)和教育部回国人员科研启动基金资助项目
【作者简介】 曾园山(1955—)，男(汉族)，广东梅县人，医学博士，教授
参考文献
[1]Hendry IA,Duggan AW,Hall JG.Morphine dependence in the rat:the appearance in the spinal cord of a dorsal root ganglion cell neurotrophic factor[J].J Neurosci Res,1987,18(3):439-442.
, 百拇医药
[2]曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠脊髓Ⅱ板层突触重建的影响——电镜定量研究[J].解剖学报，1993，24(2)：191～196.
[3]曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠背根内神经纤维侧支出芽的影响——电镜定量研究[J].神经解剖学杂志，1992，8(1)：53～56.
[4]曾园山，吴良芳.吗啡对备用根大鼠脊髓Ⅱ板层背根终末的影响——抗氟化物酸性磷酸酶组化定量研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1992，1(2)：203～209.
[5]Knyihar-Csillik E,Csillik B,Pakie P.Ultrastructure of normal and degenerating glomerular terminals of dorsal root axons in the substantia gelationsa of the Rhesus monkey[J]. J Comp Neurol,1982,210(4):357-375.
, 百拇医药
[6]Snyder RL.Light and electron microscopic autoradiographic study of the dorsal root projections to the cat dorsal horn[J].Neurosci,1982,7(6):1417-1437.
[7]Ralston HJ,Ralston DP.The distribution of dorsal root axons in laminae Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ of the macaque spinal cord.A quantitative electron microscopic study[J].J Comp Neurol,1979,184(4):643-684.
[8]Murray M,Goldberger ME.Replacement of synaptic terminals in lamina Ⅱ and Clark's nucleus after unilateral lumbosacral dorsal rhizotomy in adult cats[J].J Neurosci,1986,6(11):3205-3217.
, 百拇医药
[9]Ribeiro-Da-Silva A,Pignatelli D,Coimbra A.Synaptic architecture of glomeruli in superficial dorsal horn of rat spinal cord,as shown in serial reconstruction[J].J Neurocytol,1985,14(2):203-220.
[10]曾园山.吗啡对大鼠背根节和脊髓抗氟化物酸性磷酸酶活性的影响.中山医科大学学报，1995，16(1)：13～16.
[11]金文桥，金国章，洪庚辛.麻醉性镇痛剂的成瘾性实验.见徐叔云，卞如濂，陈修(主编).药理实验方法学[M].第2版，北京：人民卫生出版社，1991：707～712.
[12]曾园山，吴金浪.吗啡依赖大鼠背根神经纤维数量变化的电镜定量研究[J].神经解剖学杂志，1997，13(4)：367～370.
, 百拇医药
[13]曾园山，章尧，郭畹华，等.吗啡增强备用根大鼠脊髓后角组织提取液对培养鸡胚背根节的促神经突起生长的作用[J].解剖学报，1996，27(3)：238～242.
[14]Gage FH,Olejniczak P,Armstrong DM.Astrocytes are important for sprouting in the septohippocampal circuit[J].Exp Nearol,1988,102(1):2-13.
[15]Jessell TM,Iversen IL.Opiate analgesics inhibit substance P release from rat trigeminal nucleas[J].Nature,1977,268(5620):549-551.
【收稿日期】 1999-09-30
【修回日期】 2000-02-25, 百拇医药