多聚乙酸亚胺介导基因转移
作者：赵春礼 王珂 田竟生 郑少鹏 徐群渊
单位：赵春礼(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；王珂(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；田竟生(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；郑少鹏(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；徐群渊(首都医科大学神经科学研究所，北京 00054)
关键词：多聚乙酸亚胺；基因转移；大鼠
解剖学报000422 【摘要】 目的 采用一种新的多聚阳离子化合物——多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI)，作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。 方法 骨骼肌细胞取自新生SD大鼠，经胰酶消化后培养，将LacZ基因DNA-PEI复合物导入骨骼肌细胞内，最后用X-gal组织化学染色检测已转染的细胞。 结果 PEI可作为介导剂使LacZ基因在培养的骨骼肌细胞中表达，其表达率可达到30%。 结论 PEI在真核细胞中实施基因转移是一种有效方法，为基因治疗、研究提供了一种新的技术途径。
, 百拇医药
【中图分类号】 R394；R97 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-378
POLYETHYLENIMINE MEDIATED GENE TRANSFER
ZHAO Chun-li WANG Ke TIAN Jing-sheng ZHENG Shao-peng XU Qun-yuan
(Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054,China)
【Abstract】 Objective By using the polycation polyethylenimine(PEI) to explore the possible new agents for foreign gene transfected into muscle cells in vitro. Methods Muscle cells were isolated from SD rat and trypsinized for primary culture. The LacZ gene DNA-PEI complex was transfected into muscle cells. LacZ(a reporter gene) expression was detected by X-gal immunohistochemical stain. Results PEI was demonstrated to be a useful reagent for gene delivery and LacZ expression efficiency was about 30%. Conclusions PEI-mediated transfer is a simple, efficient method which could be a new approach for gene therapeutics.
, 百拇医药
【Key words】 PEI; Gene transfer; Rat
如何将外源基因导入真核细胞，一直是从事分子生物学和细胞生物学研究的技术关键。在传统使用的非病毒介导的基因转移技术基础上，近年来发现一种新的多聚阳离子化合物——多聚乙酸亚胺(polyethylenimine,PEI)，是一种有效的基因转染介导剂。PEI的结构特点为每隔3个原子即出现氨基氮，这就构成了多聚网状结构，从而与DNA结合[1]。同时PEI还可缓解溶酶体的作用，而保护DNA免遭核酸降解[2]。目前PEI已被用于成年哺乳动物脑内基因转移研究[2～4]，提示PEI还可在中枢神经系统疾病的基因治疗研究中有一定应用前景。本研究就是试图使用PEI为介导剂，将含有报告基因的质粒在体外转入培养骨骼肌细胞，以观察其效果。评价PEI替代其他介导剂的可能性，为在国内推广使用提供可靠依据。
材料和方法
, 百拇医药
1.动物
新生2～5d SD大鼠，由本校实验动物中心提供(1级动物)
2.试剂
2.1 多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI)分子量50 000(Sigma)制成10 mmol/L的水溶性干液，9mg(50% wt/vol商用溶液)稀释于10ml去离子蒸馏水中，用1mol/L的HCl调pH值至7.0，经0.2μm微孔滤膜除菌，4℃保存备用。
2.2 质粒pRSV-LacZ(7.0kb)，按常规碱裂解法提取DNA，制成3g/L的水溶液，-20℃保存备用。
3.实验方法
3.1 细胞培养：取新生乳鼠的肢体骨骼肌，剪碎成1mm3大小组织块，经0.1%胰酶消化，用含10%马血清的MEM为培养液，置CO2培养箱37℃内静止培养2d。
, 百拇医药
3.2 基因转染；以质粒pRSV-LacZ DNA与PEI的分子比为1∶7.5。(1)取150 mmol/L NaCl 50μl加11.2μl PEI，放入转染管；(2)取150 mmol/L NaCl 50μl加入1.6μl质粒DNA(即pRSV-LacZ 3g/L的原液)放入另一管内；(3)将上述两管内溶物混合，室温静置10～15min后，加入无血清MEM培养基1ml；(4)将上述制备好的溶液移入单层培养大鼠骨骼肌细胞的平皿内，置于CO2培养箱内4～6 h；(5)将上述溶液弃去，加入含马血清的MEM培养液中直到检测。
3.3 pRSV-LacZ的检测：将已转染的细胞用0.01 mol/L的PBS洗涤，用4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后加入X-gal染色液(配方为0.04% X-gal,5 mmol/L亚铁氰化钾，5 mmol/L高铁氰化钾和2 mmol/L MgCl2)，37℃卵育过夜。有pRSV-LacZ基因的骨骼肌细胞呈蓝色。
, 百拇医药
结果和讨论
质粒pRSV-LacZ的DNA按本实验方法转染及常规LacZ测定方法染色，在显微镜下可以观察到约30%的原代培养的大鼠骨骼肌细胞呈蓝色反应，即有LacZ(半乳糖苷酶)基因表达，与本实验室曾使用的脂质体Lipofectin或Lipofectamin(GIBCO)介导的转染水平相当(附图)，与既往的国内外研究结果相似[1，4]，本方法所获结果稳定，价格低廉，所产生的毒性低，在转染中未见大量细胞死亡现象。我们认为可以替代其他多聚阳离子，可供大量使用。
附图 PEI介导的pRSV-LacZ转染的大鼠骨骼肌细胞，阳性细胞为深染 ×100
Figure Rat skeletal muscle cells transfected by
, 百拇医药
PEI mediated pRSV-LacZ,the positive cells is
showed by deep staining. ×100
目前PEI已在国外许多实验中使用，它不仅可以用于体外培养的各种细胞，还可用于体内动物实验[5]。因此可以认为，PEI能为基因治疗研究提供一种新的技术途径。
【作者简介】 赵春礼(1957—)，女(汉族)，北京市人，大专，实验师
参考文献
[1]Boussif O, Lezoualch F, Zanta MA, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(16):7297-7301.
, 百拇医药
[2]Boussif O, Zanta MA, Behr TP. Optimized galentics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1 000 fold[J]. Gene Ther,1996,3(12):1074-1080.
[3]Kircheis R, Kichler A, Wallner G, et al. Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery[J]. Gene Ther,1997,4(5):409-418.
[4]徐群渊，田竟生，张进禄，等.体外转基因肌细胞植入帕金森病模型大鼠脑内的研究[J].中华外科杂志，1997，35(1)：5～9.
[5]Boker A, Benigni A, Lutz J, et al. Nonviral gene delivery to the rat kidney with polyethylenimine[J]. Hum Gene Ther,1997,8(10):1243-1251.
【收稿日期】 1999-04-23
【修回日期】 1999-10-26, 百拇医药
单位：赵春礼(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；王珂(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；田竟生(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；郑少鹏(首都医科大学神经科学研究所，北京 100054)；徐群渊(首都医科大学神经科学研究所，北京 00054)
关键词：多聚乙酸亚胺；基因转移；大鼠
解剖学报000422 【摘要】 目的 采用一种新的多聚阳离子化合物——多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI)，作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。 方法 骨骼肌细胞取自新生SD大鼠，经胰酶消化后培养，将LacZ基因DNA-PEI复合物导入骨骼肌细胞内，最后用X-gal组织化学染色检测已转染的细胞。 结果 PEI可作为介导剂使LacZ基因在培养的骨骼肌细胞中表达，其表达率可达到30%。 结论 PEI在真核细胞中实施基因转移是一种有效方法，为基因治疗、研究提供了一种新的技术途径。
, 百拇医药
【中图分类号】 R394；R97 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-378
POLYETHYLENIMINE MEDIATED GENE TRANSFER
ZHAO Chun-li WANG Ke TIAN Jing-sheng ZHENG Shao-peng XU Qun-yuan
(Beijing Institute for Neurosciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054,China)
【Abstract】 Objective By using the polycation polyethylenimine(PEI) to explore the possible new agents for foreign gene transfected into muscle cells in vitro. Methods Muscle cells were isolated from SD rat and trypsinized for primary culture. The LacZ gene DNA-PEI complex was transfected into muscle cells. LacZ(a reporter gene) expression was detected by X-gal immunohistochemical stain. Results PEI was demonstrated to be a useful reagent for gene delivery and LacZ expression efficiency was about 30%. Conclusions PEI-mediated transfer is a simple, efficient method which could be a new approach for gene therapeutics.
, 百拇医药
【Key words】 PEI; Gene transfer; Rat
如何将外源基因导入真核细胞，一直是从事分子生物学和细胞生物学研究的技术关键。在传统使用的非病毒介导的基因转移技术基础上，近年来发现一种新的多聚阳离子化合物——多聚乙酸亚胺(polyethylenimine,PEI)，是一种有效的基因转染介导剂。PEI的结构特点为每隔3个原子即出现氨基氮，这就构成了多聚网状结构，从而与DNA结合[1]。同时PEI还可缓解溶酶体的作用，而保护DNA免遭核酸降解[2]。目前PEI已被用于成年哺乳动物脑内基因转移研究[2～4]，提示PEI还可在中枢神经系统疾病的基因治疗研究中有一定应用前景。本研究就是试图使用PEI为介导剂，将含有报告基因的质粒在体外转入培养骨骼肌细胞，以观察其效果。评价PEI替代其他介导剂的可能性，为在国内推广使用提供可靠依据。
材料和方法
, 百拇医药
1.动物
新生2～5d SD大鼠，由本校实验动物中心提供(1级动物)
2.试剂
2.1 多聚乙酰亚胺(polyethylenimine,PEI)分子量50 000(Sigma)制成10 mmol/L的水溶性干液，9mg(50% wt/vol商用溶液)稀释于10ml去离子蒸馏水中，用1mol/L的HCl调pH值至7.0，经0.2μm微孔滤膜除菌，4℃保存备用。
2.2 质粒pRSV-LacZ(7.0kb)，按常规碱裂解法提取DNA，制成3g/L的水溶液，-20℃保存备用。
3.实验方法
3.1 细胞培养：取新生乳鼠的肢体骨骼肌，剪碎成1mm3大小组织块，经0.1%胰酶消化，用含10%马血清的MEM为培养液，置CO2培养箱37℃内静止培养2d。
, 百拇医药
3.2 基因转染；以质粒pRSV-LacZ DNA与PEI的分子比为1∶7.5。(1)取150 mmol/L NaCl 50μl加11.2μl PEI，放入转染管；(2)取150 mmol/L NaCl 50μl加入1.6μl质粒DNA(即pRSV-LacZ 3g/L的原液)放入另一管内；(3)将上述两管内溶物混合，室温静置10～15min后，加入无血清MEM培养基1ml；(4)将上述制备好的溶液移入单层培养大鼠骨骼肌细胞的平皿内，置于CO2培养箱内4～6 h；(5)将上述溶液弃去，加入含马血清的MEM培养液中直到检测。
3.3 pRSV-LacZ的检测：将已转染的细胞用0.01 mol/L的PBS洗涤，用4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后加入X-gal染色液(配方为0.04% X-gal,5 mmol/L亚铁氰化钾，5 mmol/L高铁氰化钾和2 mmol/L MgCl2)，37℃卵育过夜。有pRSV-LacZ基因的骨骼肌细胞呈蓝色。
, 百拇医药
结果和讨论
质粒pRSV-LacZ的DNA按本实验方法转染及常规LacZ测定方法染色，在显微镜下可以观察到约30%的原代培养的大鼠骨骼肌细胞呈蓝色反应，即有LacZ(半乳糖苷酶)基因表达，与本实验室曾使用的脂质体Lipofectin或Lipofectamin(GIBCO)介导的转染水平相当(附图)，与既往的国内外研究结果相似[1，4]，本方法所获结果稳定，价格低廉，所产生的毒性低，在转染中未见大量细胞死亡现象。我们认为可以替代其他多聚阳离子，可供大量使用。
附图 PEI介导的pRSV-LacZ转染的大鼠骨骼肌细胞，阳性细胞为深染 ×100
Figure Rat skeletal muscle cells transfected by
, 百拇医药
PEI mediated pRSV-LacZ,the positive cells is
showed by deep staining. ×100
目前PEI已在国外许多实验中使用，它不仅可以用于体外培养的各种细胞，还可用于体内动物实验[5]。因此可以认为，PEI能为基因治疗研究提供一种新的技术途径。
【作者简介】 赵春礼(1957—)，女(汉族)，北京市人，大专，实验师
参考文献
[1]Boussif O, Lezoualch F, Zanta MA, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(16):7297-7301.
, 百拇医药
[2]Boussif O, Zanta MA, Behr TP. Optimized galentics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1 000 fold[J]. Gene Ther,1996,3(12):1074-1080.
[3]Kircheis R, Kichler A, Wallner G, et al. Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery[J]. Gene Ther,1997,4(5):409-418.
[4]徐群渊，田竟生，张进禄，等.体外转基因肌细胞植入帕金森病模型大鼠脑内的研究[J].中华外科杂志，1997，35(1)：5～9.
[5]Boker A, Benigni A, Lutz J, et al. Nonviral gene delivery to the rat kidney with polyethylenimine[J]. Hum Gene Ther,1997,8(10):1243-1251.
【收稿日期】 1999-04-23
【修回日期】 1999-10-26, 百拇医药