心肌细胞和淋巴细胞β1受体mRNA水平的关系
作者：王建春 姜慧珍
单位：山东省立医院内科(250001)
关键词：心肌；细胞，培养的；淋巴细胞；受体，肾上腺能β；RNA，信使
实用医学杂志990402 摘 要 目的：探讨β1受体mRNA在心肌和淋巴细胞表达的关系。方法：用PT-PCR技术对25例不同心功能状态的心脏病患者(心功能Ⅰ级6例，Ⅱ级14例，Ⅲ级5例)，分别检测其心肌和淋巴细胞的β1受体mRNA水平。结果：两种标本检测结果差异无显著意义。结论：淋巴细胞β1受体mRNA水平可反映心肌β1受体mRNA水平。
心肌细胞β1受体mRNA水平的变化会直接影响其受体的合成。病理状态下，其水平下降，β1受体密度下调，可使心肌收缩力减弱，导致和加重心力衰竭。这种基因水平的变化出现较早，在临床尚未出现心衰症状时已开始，且随着心衰的加重而下降，随心衰症状的纠正而恢复[1]。因此，检测心肌β1受体mRNA水平对判断心功能状态，指导临床及早用药有十分重要的意义。但是，心肌标本采取有一定限制，如能用血液标本代替心肌标本将会给临床带来很大方便。本研究选择25例不同心功能状态的心脏病患者，观察其心肌和外周血淋巴细胞β1受体mRNA水平，从而探讨mRNA在心肌和淋巴细胞表达的关系。
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1 对象与方法
1.1 研究对象 共25例，均为1997年7月～1998年3月在我院进行心瓣膜置换手术患者。依照NYHA心功能分级标准，将病人分为三组。心功能Ⅰ级组6例，男5例，女1例，平均年龄37.5±11.2岁；心功能Ⅱ级组14例，男8例，女6例，平均年龄43.3±18.4；心功能Ⅲ级组5例，男3例，女2例，平均年龄41.3±16.2岁。
1.2 研究方法
1.2.1 标本收集 每一受试者均在手术前取肝素抗凝外周静脉血5 ml，在手术过程中取左心室前乳头肌2 mm×1 mm×1 mm大小2～3块，迅速置入液氮中15分钟，然后放入-80℃冰箱保存。
1.2.2 总RNA提取 对血液标本，首先用Boyum[2]的提取技术分离淋巴细胞。对心肌标本，先在冷冻状态下剪碎，置于匀浆管中，室温下加入变性缓冲液1 ml，迅速将组织研磨。然后用异硫氢酸胍一步提取法[3]提取总RNA。总RNA提取后，用分光光度法检测RNA的浓度和纯度。本研究提取的RNA在260 nm和280 nm紫外线吸收值的比值(ODA260/280)在1.8～2.0之间，纯度较高，每标本提取RNA量在0.7～4 μg之间。
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1.2.3 逆转录 取总RNA 2 μl，加随机引物2 μl，75℃预变性5分钟，然后冰浴5分钟，混匀，依次加入5×buffer 5 μl，4mMdNTP 3 μl，Rnasin 1 μl，AMV 3 μl，DEPC水9 μl，混匀，在42℃温育1小时，然后95℃5分钟灭活AMV。总反应体系25 μl，各种反应物终浓度为：dNTP 0.48 mmol/L,Mg2+10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L。
1.2.4 多聚酶链反应 由于心肌β1受体mRNA水平不高，故采用多聚酶链反应(PCR)技术进行测定。以上述逆转录产物为模板，反应体系为：总反应体积50 μl，RTmix 10μl，10×buffer 4 μl，引物Sense 0.5 μmol/L 1 μl，Antisense 0.5μmol/L 1 μl，4mMdNTP 1.5 μl，混匀后加入DNA合成酶0.4 μl，无Rnase水32.1 μl，石蜡油2滴。PCR变性、退火、延伸温度分别为：94℃45秒，55℃30秒，72℃60秒，首次循环94℃3分钟，共30个循环，最后在72℃延伸10分钟。预试验已经证明，30个循环内扩增产物未达到饱和状态。
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β1受体引物序列：Sense 5′-CTC ACC AAC CTC TTC ATC ATG-3′Antisense 5′-GAA ACG GCG CTC GCA GCT G-3′，引物由上海生物工程技术公司合成，TagDNA聚合酶和dNTP均购自Promega公司。
1.2.5 结果判断 采用半定量方法。进行PCR时，对每一标本均分别取10、5、2.5、1.25 μl分别进行扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。如四管均有亮带定为“+ + + +”，前三管有亮带，为“+ + +”，依次类推。
1.3 统计学处理 本组统计学处理采用配对设计差值的符号秩和检验(Wilcoxon配对法)对两组结果进行比较。
2 结果
不同心功能分级组的检测结果，见表1～3。用Wilcoxon配对法对每组结果进行统计，t值分别为4，9，4，查t界值表，得双侧P>0.05，按双侧0.05标准，故认为两种标本检测结果差异无显著意义。
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表1 心功能Ⅰ级组心肌和淋巴细胞β1受体mRNA检测结果 受试者
心肌
淋巴细胞
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表2 心功能Ⅱ级组心肌和淋巴细胞β1受体mRNA检测结果 受试者
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表3 心功能Ⅲ级组心肌和淋巴细胞β1受体mRNA检测结果 受试者
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3 讨论
β肾上腺受体及细胞内信息传导系统是正常心脏和衰竭心脏心功能调节的重要途径。调节心肌收缩力的主要是β1受体[4]。在心衰病理状态下，β1受体基因转录mRNA减少，其mRNA半衰期也缩短，导致受体合成减少，从而使心肌收缩力减弱。Ungerer等[5]研究结果显示，心衰时心肌β1受体数目减少，β2受体数目不变；同时β1受体mRNA水平下降，β2受体mRNA水平不变，这种受体和其mRNA平行下降的现象也证明受体下降是由于其mRNA下降的缘故。从本研究结果也可以看出，随着心衰逐渐加重，其mRNA水平也逐渐下降。因此，心肌β1受体mRNA变化在心衰发生发展过程中起着重要作用。
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但是观察心肌有一定困难。本研究结果显示外周血淋巴细胞β1受体mRNA水平可以反映心肌β1受体mRNA水平，外周血采集方便，提取淋巴细胞简单，且不会改变其细胞的完整性和活力。因此，这将给临床带来很大方便，可通过此方法及早判断心功能不全状态。另外，近年来发现β受体阻滞剂对某些心衰病人可起到有益作用，可对抗β受体的下调。选择性β受体阻滞剂美托洛尔治疗扩张性心肌病可获得长期的临床和血液动力学改善[6]。通过观察用药后淋巴细胞β1受体mRNA水平的变化，可望作为β受体阻滞剂在心衰的应用提供实验室监测方法之一。
本课题受山东省青年科学自然基金资助(基金编号981050104)
4 参考文献
1 Engelhardt S,Bohm M,Erdmann M,et al. Analysis of beta-adrenergic receptor mRNA levels in human ventricular biopsy specimens by quantitative polymerase chain reactions:progressive reduction of beta-adrenergic receptor mRNA in heart failure. J Am Coll Cardiol 1996,27(1):146～154.
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2 Boyum A. Isolation of monolucleare cells and granuocyte from human blood. Scand J Clin Lab Invest,1968,97(suppl):77～89.
3 卢圣栋，主编. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 206.
4 Bristow MR,Hershberger RE，Port JD，et al. Beta-adrenergic pathways in nonfailing and failing human ventricular myocardium. Circulation,1990,82(2suppl):I12～15.
5 Ungerer M,Bohm M,Elce JS，et al. Altered expression of β-adrenergic receptor kinase and β1-adrenergic receptors in the failing human heart. Circulation，1993,187(2):454～463.
6 Anderson JL，Lutz JR,Gilbert EM,et al. A randomised trial of low-dose beta-blockade therapy for idiopathic dilated cardiomypathy. Am J Cardiol,1985,55(4):471～475., 百拇医药
单位：山东省立医院内科(250001)
关键词：心肌；细胞，培养的；淋巴细胞；受体，肾上腺能β；RNA，信使
实用医学杂志990402 摘 要 目的：探讨β1受体mRNA在心肌和淋巴细胞表达的关系。方法：用PT-PCR技术对25例不同心功能状态的心脏病患者(心功能Ⅰ级6例，Ⅱ级14例，Ⅲ级5例)，分别检测其心肌和淋巴细胞的β1受体mRNA水平。结果：两种标本检测结果差异无显著意义。结论：淋巴细胞β1受体mRNA水平可反映心肌β1受体mRNA水平。
心肌细胞β1受体mRNA水平的变化会直接影响其受体的合成。病理状态下，其水平下降，β1受体密度下调，可使心肌收缩力减弱，导致和加重心力衰竭。这种基因水平的变化出现较早，在临床尚未出现心衰症状时已开始，且随着心衰的加重而下降，随心衰症状的纠正而恢复[1]。因此，检测心肌β1受体mRNA水平对判断心功能状态，指导临床及早用药有十分重要的意义。但是，心肌标本采取有一定限制，如能用血液标本代替心肌标本将会给临床带来很大方便。本研究选择25例不同心功能状态的心脏病患者，观察其心肌和外周血淋巴细胞β1受体mRNA水平，从而探讨mRNA在心肌和淋巴细胞表达的关系。
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1 对象与方法
1.1 研究对象 共25例，均为1997年7月～1998年3月在我院进行心瓣膜置换手术患者。依照NYHA心功能分级标准，将病人分为三组。心功能Ⅰ级组6例，男5例，女1例，平均年龄37.5±11.2岁；心功能Ⅱ级组14例，男8例，女6例，平均年龄43.3±18.4；心功能Ⅲ级组5例，男3例，女2例，平均年龄41.3±16.2岁。
1.2 研究方法
1.2.1 标本收集 每一受试者均在手术前取肝素抗凝外周静脉血5 ml，在手术过程中取左心室前乳头肌2 mm×1 mm×1 mm大小2～3块，迅速置入液氮中15分钟，然后放入-80℃冰箱保存。
1.2.2 总RNA提取 对血液标本，首先用Boyum[2]的提取技术分离淋巴细胞。对心肌标本，先在冷冻状态下剪碎，置于匀浆管中，室温下加入变性缓冲液1 ml，迅速将组织研磨。然后用异硫氢酸胍一步提取法[3]提取总RNA。总RNA提取后，用分光光度法检测RNA的浓度和纯度。本研究提取的RNA在260 nm和280 nm紫外线吸收值的比值(ODA260/280)在1.8～2.0之间，纯度较高，每标本提取RNA量在0.7～4 μg之间。
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1.2.3 逆转录 取总RNA 2 μl，加随机引物2 μl，75℃预变性5分钟，然后冰浴5分钟，混匀，依次加入5×buffer 5 μl，4mMdNTP 3 μl，Rnasin 1 μl，AMV 3 μl，DEPC水9 μl，混匀，在42℃温育1小时，然后95℃5分钟灭活AMV。总反应体系25 μl，各种反应物终浓度为：dNTP 0.48 mmol/L,Mg2+10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L。
1.2.4 多聚酶链反应 由于心肌β1受体mRNA水平不高，故采用多聚酶链反应(PCR)技术进行测定。以上述逆转录产物为模板，反应体系为：总反应体积50 μl，RTmix 10μl，10×buffer 4 μl，引物Sense 0.5 μmol/L 1 μl，Antisense 0.5μmol/L 1 μl，4mMdNTP 1.5 μl，混匀后加入DNA合成酶0.4 μl，无Rnase水32.1 μl，石蜡油2滴。PCR变性、退火、延伸温度分别为：94℃45秒，55℃30秒，72℃60秒，首次循环94℃3分钟，共30个循环，最后在72℃延伸10分钟。预试验已经证明，30个循环内扩增产物未达到饱和状态。
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β1受体引物序列：Sense 5′-CTC ACC AAC CTC TTC ATC ATG-3′Antisense 5′-GAA ACG GCG CTC GCA GCT G-3′，引物由上海生物工程技术公司合成，TagDNA聚合酶和dNTP均购自Promega公司。
1.2.5 结果判断 采用半定量方法。进行PCR时，对每一标本均分别取10、5、2.5、1.25 μl分别进行扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。如四管均有亮带定为“+ + + +”，前三管有亮带，为“+ + +”，依次类推。
1.3 统计学处理 本组统计学处理采用配对设计差值的符号秩和检验(Wilcoxon配对法)对两组结果进行比较。
2 结果
不同心功能分级组的检测结果，见表1～3。用Wilcoxon配对法对每组结果进行统计，t值分别为4，9，4，查t界值表，得双侧P>0.05，按双侧0.05标准，故认为两种标本检测结果差异无显著意义。
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表1 心功能Ⅰ级组心肌和淋巴细胞β1受体mRNA检测结果 受试者
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β肾上腺受体及细胞内信息传导系统是正常心脏和衰竭心脏心功能调节的重要途径。调节心肌收缩力的主要是β1受体[4]。在心衰病理状态下，β1受体基因转录mRNA减少，其mRNA半衰期也缩短，导致受体合成减少，从而使心肌收缩力减弱。Ungerer等[5]研究结果显示，心衰时心肌β1受体数目减少，β2受体数目不变；同时β1受体mRNA水平下降，β2受体mRNA水平不变，这种受体和其mRNA平行下降的现象也证明受体下降是由于其mRNA下降的缘故。从本研究结果也可以看出，随着心衰逐渐加重，其mRNA水平也逐渐下降。因此，心肌β1受体mRNA变化在心衰发生发展过程中起着重要作用。
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但是观察心肌有一定困难。本研究结果显示外周血淋巴细胞β1受体mRNA水平可以反映心肌β1受体mRNA水平，外周血采集方便，提取淋巴细胞简单，且不会改变其细胞的完整性和活力。因此，这将给临床带来很大方便，可通过此方法及早判断心功能不全状态。另外，近年来发现β受体阻滞剂对某些心衰病人可起到有益作用，可对抗β受体的下调。选择性β受体阻滞剂美托洛尔治疗扩张性心肌病可获得长期的临床和血液动力学改善[6]。通过观察用药后淋巴细胞β1受体mRNA水平的变化，可望作为β受体阻滞剂在心衰的应用提供实验室监测方法之一。
本课题受山东省青年科学自然基金资助(基金编号981050104)
4 参考文献
1 Engelhardt S,Bohm M,Erdmann M,et al. Analysis of beta-adrenergic receptor mRNA levels in human ventricular biopsy specimens by quantitative polymerase chain reactions:progressive reduction of beta-adrenergic receptor mRNA in heart failure. J Am Coll Cardiol 1996,27(1):146～154.
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2 Boyum A. Isolation of monolucleare cells and granuocyte from human blood. Scand J Clin Lab Invest,1968,97(suppl):77～89.
3 卢圣栋，主编. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 206.
4 Bristow MR,Hershberger RE，Port JD，et al. Beta-adrenergic pathways in nonfailing and failing human ventricular myocardium. Circulation,1990,82(2suppl):I12～15.
5 Ungerer M,Bohm M,Elce JS，et al. Altered expression of β-adrenergic receptor kinase and β1-adrenergic receptors in the failing human heart. Circulation，1993,187(2):454～463.
6 Anderson JL，Lutz JR,Gilbert EM,et al. A randomised trial of low-dose beta-blockade therapy for idiopathic dilated cardiomypathy. Am J Cardiol,1985,55(4):471～475., 百拇医药