丙型肝炎病毒DNA核酸免疫的初步探讨
作者：窦 骏 刘克洲 陈 智 沃建尔 刘 勇 徐陈槐 何南祥 章明太 王信子
单位：浙江医科大学附一院传染病研究所卫生部病毒性传染病重点实验室，杭州310003
关键词：HCV-DNA重组体；核酸免疫；抗体反应；细胞免疫
中国免疫学杂志990404 中国图书分类号 R512.63
摘 要 目的：探索HCV-DNA核酸免疫效应。方法：将构建的重组体pCD-HCVs免疫Balb/c小鼠，用ELISA和3H-TdR掺入法检测了免疫鼠血清抗体、脾细胞和PBMC对HCV抗原的增殖反应。结果：重组体pCD-HCV1、pCD-HCV2和pCD-HCV3均可诱导小鼠(n=6)产生抗体(0.665～0.707，OD值)和脾细胞对HCV抗原增殖反应(n=6,SI为3.89～4.47)，但各重组体间的免疫效应无显著性差异(P>0.05);免疫鼠(n=12)血清经40倍和320倍稀释后，抗体阳性率分别为100.0%和16.6%；重组体还可诱导鼠PBMC对HCV抗原的增殖反应(3.69～4.07，SI)。结论：pCD-HCVs重组体可诱导小鼠产生免疫反应，该结果对进一步开展HCV-DNA疫苗研制将具有重要意义。
, 百拇医药
Preliminary inquire into approach of HCV-DNA nucleicacid immunity
DOU Jun,LIU Ke-Zhou,CHEN Zhi et al.Institute of Infectious Disease,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003
Abstract Objective:To explore the effect of HCV-DNA nucleicacid immunity.Methods:Recombinant pCD-HCVs constructs were injected into muscles of Balb/c mice and serum anti-HCV were tested by ELISA(OD value).Spleen cells and PBMC proliferation responses to HCV antigens were detected by 3 H-TdR incorporation method(cpm).Results:Recombinant pCD-HCV1,pCD-HCV2and pCD-HCV3 can all elicite mice to generate antibody(0.665～0.707，OD value) and spleen cells in mice (n=6) were induced to be proliferative responses to HCV antigens(3.89～4.47)，stimulation index(SI).There were no significant difference(P>0.05)among each recombinant,the serum antibody in mice(n=12) immunized by recombinant pCDHCVs were 100.0 percent positive and 16.6 percent positive when serum were diludted 40 flods and 320 flods respectively.PBMC proliferative responses to HCV antigens in mice immunized with pCD-HCVs was detected also(3.69～4.07,SI).Conclusion:The investigations suggested that recombinant pCD-HCVs can elicite Balb/c mice to generate immune response and the experiment results have an important significant for development of HCV-DNA vaccine in future.
, 百拇医药
Key words HCV-DNA recombinant Nucleicacid immunity Antibody responses Cellular immunity
自1993年Ulmer等首次报道DNA免疫技术用于流感病毒疫苗研制以来[1]，肝炎病毒等DNA疫苗的研究已逐步展开[2]。为探索我国丙型肝炎病毒(HCV)DNA核酸疫苗的研究，本课题选择已构建的HCV-DNA重组体pCD-HCVs，即pCD-HCV1、pCD-HCV2 、pCD-HCV3分别免疫Balb/c小鼠，从抗体产生、脾细胞及外周血单个核细胞(PBMC)对特异性HCV抗原的增殖反应等方面，探讨HCV-DNA核酸免疫效应，试图为在灵长类动物中进一步开展HCV-DNA疫苗研制奠定实验基础。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 质粒 重组质粒pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-
HCV3分别含有HCV结构区基因片段1693、1695和1697，基因型为OkamotoⅡ型，5.1kb。哺乳细胞表达质粒pCD-SRα1，含有SV40早期启动子和HTLV-I型末端重复RU-5片段，3.4 kb。
1.2 HCV抗原、同位素 合成肽CP9、CP10由中国科学院上海生物研究所合成。基因重组抗原C、E1、E2由北京中国药品生物制品检定所汪兴太、张庶民博士提供和惠赠。3H-TdR，放射活性为32 μCi/毫克分子，购于中国科学院上海核技术开发公司。
1.3 动物 Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄，浙江医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.4 方法
1.4.1 实验分组 随机将小鼠分为实验组(注射重组体pCD-HCVs)和对照组(注射pCD-SRα1)。
1.4.2 免疫方法 实验组于小鼠四肢肌肉多点注射重组体pCD-HCVs 100 μg/(只*次)，间隔2 w免疫1次，共3次，对照组以同样方法注射pCD-SRα1。
1.4.3 血清抗体检测 无菌断尾取血，分离血清，用样本稀释液将血清稀释10倍或若干倍数，用ELISA法检测血清抗体[3]。
1.4.4 脾细胞增殖反应
1.4.4.1 脾细胞制备[4] 将脾细胞(2×106 ml-1)于96孔细胞培养板加200μl/孔，随后加入10 μl(0.6 μg)HCV抗原，每个实验组3个复孔，同时设阴性对照(加脾细胞不加抗原)，培养6 d；pCD-SRα1免疫鼠脾细胞增殖反应，方法同实验组。
, 百拇医药
1.4.4.2 脾细胞增殖反应检测 脾细胞培养6 d后，加3H-TdR 0.5μCi/孔，继续培养16～18 h，收集细胞，在液闪仪上检测cpm，以刺激指数(SI)表示脾细胞对HCV抗原的增殖反应，SI≥2.1为阳性[5]。
SI=(实验组cpm-细胞对照组cpm)/(细胞对照组cpm)
1.4.5 PBMC的增殖反应 于小鼠腋窝无菌取血加入肝素抗凝管，将注射同种重组体的3～4只小鼠血混为1份标本，常规分离PBMC，调细胞浓度为1×106 ml-1，后续步骤同脾细胞增殖反应。
1.5 统计 采用t检验、F检验、SNK检验对实验资料进行统计学处理。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 重组体pCD-HCVs免疫鼠产生抗体水平比较 由表1可见，3种不同重组体2次或3次免疫小鼠后，均可诱导小鼠产生特异性抗体。用SNK方法对不同组间抗体水平检验，差异无显著性意义(P>0.05)。
表1 不同pCD-HCVs重组体免疫小鼠抗体水平比较
Tab.1 Comparison of antibody level in mice inoculated with different pCD-HCVs recombinant No.
pCD-HCV1
pCD-HCV2
pCD-HCV3
Second
, http://www.100md.com
inoculation
Third
inoculation
Second
inoculation
Third
inoculation
Second
inoculation
Third
inoculation
1
, http://www.100md.com
0.301
0.604
0.299
0.711
0.313
0.692
2
0.404
0.742
0.343
0.742
0.346
0.743
, http://www.100md.com
3
0.362
0.592
0.378
0.608
0.374
0.784
4
0.394
0.684
0.421
0.649
0.287
, 百拇医药
0.607
5
0.418
0.761
0.442
0.769
0.292
0.614
6
0.298
0.607
0.364
0.708
, http://www.100md.com
0.468
0.804
x±s
0.363±0.041)
0.665±0.072)
0.374±0.05
0.689±0.09
0.347±0.07
0.707±0.09
Note:1)P>0.05 as compared with second inoculation groups; 2)P>0.05 as compared with third inoculation groups
, 百拇医药
2.2 重组体pCD-HCVs免疫鼠抗体阳性率与血清稀释度关系 随机从pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-HCV3各组间分别取4只3次免疫2 w后小鼠血清(12份标本)，按1：10：20：40... ...320：640倍比稀释。当血清40倍稀释后，12只小鼠血清抗体阳性率可达100.0%，其中2只小鼠血清320倍稀释后，仍可测出特异性抗体，占16.6%。
2.3 重组体pCD-HCVs诱导小鼠脾细胞增殖反应 3种重组体免疫小鼠后脾细胞对HCV CP9、E2抗原的增殖反应分别为4.47±1.72和4.20±1.77；4.06±1.53和3.89±1.85；4.14±0.90和4.04±1.14，经方差分析结果显示，各组间的差异无显著性(P>0.05)。表明构建的重组体pCD-HCVs可诱导小鼠脾细胞免疫反应，但各重组体间的免疫原性未见明显差异。
, 百拇医药
2.4 重组体pCD-HCVs诱发小鼠PBMC的增殖反应 表2结果显示，重组体pCD-HCVs免疫小鼠后，可引起PBMC对HCV抗原的增殖反应，与空载体pCD-SRα1免疫组相比，差异有显著性(P<0.01)。
表2 重组体免疫鼠PBMC对HCV抗原的增殖反应
Tab.2 PBMC responses to HCV antigens in mice inoculated with recombinant No.
pCD-HCV1(SI)1)
pCD-SRа1(SI)
CP9
, 百拇医药
C
E1
CP9
C
E1
1
6.6
5.2
5.8
1.5
1.1
1.2
2
, http://www.100md.com
4.4
4.6
4.3
1.4
1.6
1.8
3
3.3
3.6
2.7
1.4
1.4
1.2
, 百拇医药
4
2.2
2.1
3.9
1.2
1.2
1.4
5
4.9
4.3
2.9
6
3.0
, 百拇医药 3.5
4.2
x±s
4.07±1.58
3.88±0.70
3.69±1.13
1.13±0.24
1.3±0.3
1.40.34
Note:Each sample is mixed with 3 to 4 PBMCs of mice;1)P<0.01 as compared with pCD-SRα1 group
, 百拇医药
3 讨论
HCV核酸免疫的研究近年刚刚起步，诸如选择什么基因片段作为目的基因等问题有待进一步研究。为确保本研究构建的HCVDNA重组体目的基因与启动子有较好的匹配性，免疫小鼠后表达蛋白有适宜的空间构象从而起到良好的免疫原性，本课题利用不同PCR引物扩增出依次相差2个核苷酸的3种目的基因片段，进而分别构建了pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-HCV3 3种HCV-DNA重组体。经EcoRI、PstI酶切图谱分析及Southern blot证实，重组体上所含基因片段是本研究设计所要求的目的基因[6]。
实验表明，3种重组体2～3次免疫小鼠后均能使鼠血清抗体阳转和脾细胞对特异性抗原的增殖反应，但各重组体诱发小鼠产生免疫反应能力无显著差异。该结果提示目的基因依次相差2个核苷酸在小鼠体内表达的蛋白，经加工处理形成的天然构象，其抗原表位可能没有本质差异，免疫原性不受影响。从抗体产生水平分析，12只小鼠3次免疫后血清经320倍稀释，仍有2只小鼠血清抗体阳性，显示构建的重组体免疫原性较强，但同种小鼠不同个体对HCV-DNA重组体免疫后的反应性不尽相同。
, 百拇医药
pCD-HCVs免疫鼠后，能诱发抗体产生和脾细胞及PBMC对HCV抗原的增殖反应，这对抗感染免疫作用的发挥有重要意义。本研究将在此基础上进行HCV-DNA重组体诱发鼠细胞毒T细胞的研究，以便为进一步在灵长类动物体内开展HCV-DNA疫苗研制奠定基础。
丙型肝炎病毒DNA核酸免疫的初步探讨 本课题由国家自然科学基金(39670665)资助
窦 骏 现在南京铁道医学院微生物学教研室，南京 210009
作者简介：窦 骏，男，42岁，副教授，博士，主要从事分子免疫学和中药免疫调理研究；刘克洲，男，60岁，教授，博士生导师，主要从事病毒性肝炎防治研究
4 参考文献
[1] Ulmer J B, Donnelly J J,Parker S E et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science,1993;259:1745
, 百拇医药
[2] Lagging L M,Meyer K,Hoft D et al. Immune responses to plasmid DNA emcoding the hepatitis C virus core protein.J Virol,1995;69:5859
[3] 戚中田,社 平主编.丙型肝炎病毒与丙型肝炎.上海:上海科技出版社,1992：55-58
[4] 窦 骏,吴敏毓.四君子汤对小鼠脾细胞ADCC和NK细胞活性的影响.中药药理与临床,1989；5(5)：24
[5] 徐永耀,闻玉梅,胡德昌et al.慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞对乙型肝炎病毒前S区合成肽的增殖反应.中华传染病杂志,1992；10(1)：68
[6] 窦 骏,刘克洲,陈 智et al.HCV结构区基因重组体构建、蛋白表达及小鼠对重组质粒抗体反应.中国实验临床免疫学杂志,1998;10(3):170
〔收稿1997-08-30 三次修回1998-08-20〕, 百拇医药
单位：浙江医科大学附一院传染病研究所卫生部病毒性传染病重点实验室，杭州310003
关键词：HCV-DNA重组体；核酸免疫；抗体反应；细胞免疫
中国免疫学杂志990404 中国图书分类号 R512.63
摘 要 目的：探索HCV-DNA核酸免疫效应。方法：将构建的重组体pCD-HCVs免疫Balb/c小鼠，用ELISA和3H-TdR掺入法检测了免疫鼠血清抗体、脾细胞和PBMC对HCV抗原的增殖反应。结果：重组体pCD-HCV1、pCD-HCV2和pCD-HCV3均可诱导小鼠(n=6)产生抗体(0.665～0.707，OD值)和脾细胞对HCV抗原增殖反应(n=6,SI为3.89～4.47)，但各重组体间的免疫效应无显著性差异(P>0.05);免疫鼠(n=12)血清经40倍和320倍稀释后，抗体阳性率分别为100.0%和16.6%；重组体还可诱导鼠PBMC对HCV抗原的增殖反应(3.69～4.07，SI)。结论：pCD-HCVs重组体可诱导小鼠产生免疫反应，该结果对进一步开展HCV-DNA疫苗研制将具有重要意义。
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Preliminary inquire into approach of HCV-DNA nucleicacid immunity
DOU Jun,LIU Ke-Zhou,CHEN Zhi et al.Institute of Infectious Disease,Zhejiang Medical University,Hangzhou 310003
Abstract Objective:To explore the effect of HCV-DNA nucleicacid immunity.Methods:Recombinant pCD-HCVs constructs were injected into muscles of Balb/c mice and serum anti-HCV were tested by ELISA(OD value).Spleen cells and PBMC proliferation responses to HCV antigens were detected by 3 H-TdR incorporation method(cpm).Results:Recombinant pCD-HCV1,pCD-HCV2and pCD-HCV3 can all elicite mice to generate antibody(0.665～0.707，OD value) and spleen cells in mice (n=6) were induced to be proliferative responses to HCV antigens(3.89～4.47)，stimulation index(SI).There were no significant difference(P>0.05)among each recombinant,the serum antibody in mice(n=12) immunized by recombinant pCDHCVs were 100.0 percent positive and 16.6 percent positive when serum were diludted 40 flods and 320 flods respectively.PBMC proliferative responses to HCV antigens in mice immunized with pCD-HCVs was detected also(3.69～4.07,SI).Conclusion:The investigations suggested that recombinant pCD-HCVs can elicite Balb/c mice to generate immune response and the experiment results have an important significant for development of HCV-DNA vaccine in future.
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Key words HCV-DNA recombinant Nucleicacid immunity Antibody responses Cellular immunity
自1993年Ulmer等首次报道DNA免疫技术用于流感病毒疫苗研制以来[1]，肝炎病毒等DNA疫苗的研究已逐步展开[2]。为探索我国丙型肝炎病毒(HCV)DNA核酸疫苗的研究，本课题选择已构建的HCV-DNA重组体pCD-HCVs，即pCD-HCV1、pCD-HCV2 、pCD-HCV3分别免疫Balb/c小鼠，从抗体产生、脾细胞及外周血单个核细胞(PBMC)对特异性HCV抗原的增殖反应等方面，探讨HCV-DNA核酸免疫效应，试图为在灵长类动物中进一步开展HCV-DNA疫苗研制奠定实验基础。
1 材料与方法
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1.1 质粒 重组质粒pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-
HCV3分别含有HCV结构区基因片段1693、1695和1697，基因型为OkamotoⅡ型，5.1kb。哺乳细胞表达质粒pCD-SRα1，含有SV40早期启动子和HTLV-I型末端重复RU-5片段，3.4 kb。
1.2 HCV抗原、同位素 合成肽CP9、CP10由中国科学院上海生物研究所合成。基因重组抗原C、E1、E2由北京中国药品生物制品检定所汪兴太、张庶民博士提供和惠赠。3H-TdR，放射活性为32 μCi/毫克分子，购于中国科学院上海核技术开发公司。
1.3 动物 Balb/c小鼠，雄性，6～8周龄，浙江医科大学实验动物中心提供。
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1.4 方法
1.4.1 实验分组 随机将小鼠分为实验组(注射重组体pCD-HCVs)和对照组(注射pCD-SRα1)。
1.4.2 免疫方法 实验组于小鼠四肢肌肉多点注射重组体pCD-HCVs 100 μg/(只*次)，间隔2 w免疫1次，共3次，对照组以同样方法注射pCD-SRα1。
1.4.3 血清抗体检测 无菌断尾取血，分离血清，用样本稀释液将血清稀释10倍或若干倍数，用ELISA法检测血清抗体[3]。
1.4.4 脾细胞增殖反应
1.4.4.1 脾细胞制备[4] 将脾细胞(2×106 ml-1)于96孔细胞培养板加200μl/孔，随后加入10 μl(0.6 μg)HCV抗原，每个实验组3个复孔，同时设阴性对照(加脾细胞不加抗原)，培养6 d；pCD-SRα1免疫鼠脾细胞增殖反应，方法同实验组。
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1.4.4.2 脾细胞增殖反应检测 脾细胞培养6 d后，加3H-TdR 0.5μCi/孔，继续培养16～18 h，收集细胞，在液闪仪上检测cpm，以刺激指数(SI)表示脾细胞对HCV抗原的增殖反应，SI≥2.1为阳性[5]。
SI=(实验组cpm-细胞对照组cpm)/(细胞对照组cpm)
1.4.5 PBMC的增殖反应 于小鼠腋窝无菌取血加入肝素抗凝管，将注射同种重组体的3～4只小鼠血混为1份标本，常规分离PBMC，调细胞浓度为1×106 ml-1，后续步骤同脾细胞增殖反应。
1.5 统计 采用t检验、F检验、SNK检验对实验资料进行统计学处理。
2 结果
, http://www.100md.com 2.1 重组体pCD-HCVs免疫鼠产生抗体水平比较 由表1可见，3种不同重组体2次或3次免疫小鼠后，均可诱导小鼠产生特异性抗体。用SNK方法对不同组间抗体水平检验，差异无显著性意义(P>0.05)。
表1 不同pCD-HCVs重组体免疫小鼠抗体水平比较
Tab.1 Comparison of antibody level in mice inoculated with different pCD-HCVs recombinant No.
pCD-HCV1
pCD-HCV2
pCD-HCV3
Second
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inoculation
Third
inoculation
Second
inoculation
Third
inoculation
Second
inoculation
Third
inoculation
1
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0.301
0.604
0.299
0.711
0.313
0.692
2
0.404
0.742
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0.742
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0.374
0.784
4
0.394
0.684
0.421
0.649
0.287
, 百拇医药
0.607
5
0.418
0.761
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6
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0.708
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0.468
0.804
x±s
0.363±0.041)
0.665±0.072)
0.374±0.05
0.689±0.09
0.347±0.07
0.707±0.09
Note:1)P>0.05 as compared with second inoculation groups; 2)P>0.05 as compared with third inoculation groups
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2.2 重组体pCD-HCVs免疫鼠抗体阳性率与血清稀释度关系 随机从pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-HCV3各组间分别取4只3次免疫2 w后小鼠血清(12份标本)，按1：10：20：40... ...320：640倍比稀释。当血清40倍稀释后，12只小鼠血清抗体阳性率可达100.0%，其中2只小鼠血清320倍稀释后，仍可测出特异性抗体，占16.6%。
2.3 重组体pCD-HCVs诱导小鼠脾细胞增殖反应 3种重组体免疫小鼠后脾细胞对HCV CP9、E2抗原的增殖反应分别为4.47±1.72和4.20±1.77；4.06±1.53和3.89±1.85；4.14±0.90和4.04±1.14，经方差分析结果显示，各组间的差异无显著性(P>0.05)。表明构建的重组体pCD-HCVs可诱导小鼠脾细胞免疫反应，但各重组体间的免疫原性未见明显差异。
, 百拇医药
2.4 重组体pCD-HCVs诱发小鼠PBMC的增殖反应 表2结果显示，重组体pCD-HCVs免疫小鼠后，可引起PBMC对HCV抗原的增殖反应，与空载体pCD-SRα1免疫组相比，差异有显著性(P<0.01)。
表2 重组体免疫鼠PBMC对HCV抗原的增殖反应
Tab.2 PBMC responses to HCV antigens in mice inoculated with recombinant No.
pCD-HCV1(SI)1)
pCD-SRа1(SI)
CP9
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C
E1
CP9
C
E1
1
6.6
5.2
5.8
1.5
1.1
1.2
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4.4
4.6
4.3
1.4
1.6
1.8
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2.1
3.9
1.2
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1.4
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3.69±1.13
1.13±0.24
1.3±0.3
1.40.34
Note:Each sample is mixed with 3 to 4 PBMCs of mice;1)P<0.01 as compared with pCD-SRα1 group
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3 讨论
HCV核酸免疫的研究近年刚刚起步，诸如选择什么基因片段作为目的基因等问题有待进一步研究。为确保本研究构建的HCVDNA重组体目的基因与启动子有较好的匹配性，免疫小鼠后表达蛋白有适宜的空间构象从而起到良好的免疫原性，本课题利用不同PCR引物扩增出依次相差2个核苷酸的3种目的基因片段，进而分别构建了pCD-HCV1、pCD-HCV2、pCD-HCV3 3种HCV-DNA重组体。经EcoRI、PstI酶切图谱分析及Southern blot证实，重组体上所含基因片段是本研究设计所要求的目的基因[6]。
实验表明，3种重组体2～3次免疫小鼠后均能使鼠血清抗体阳转和脾细胞对特异性抗原的增殖反应，但各重组体诱发小鼠产生免疫反应能力无显著差异。该结果提示目的基因依次相差2个核苷酸在小鼠体内表达的蛋白，经加工处理形成的天然构象，其抗原表位可能没有本质差异，免疫原性不受影响。从抗体产生水平分析，12只小鼠3次免疫后血清经320倍稀释，仍有2只小鼠血清抗体阳性，显示构建的重组体免疫原性较强，但同种小鼠不同个体对HCV-DNA重组体免疫后的反应性不尽相同。
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pCD-HCVs免疫鼠后，能诱发抗体产生和脾细胞及PBMC对HCV抗原的增殖反应，这对抗感染免疫作用的发挥有重要意义。本研究将在此基础上进行HCV-DNA重组体诱发鼠细胞毒T细胞的研究，以便为进一步在灵长类动物体内开展HCV-DNA疫苗研制奠定基础。
丙型肝炎病毒DNA核酸免疫的初步探讨 本课题由国家自然科学基金(39670665)资助
窦 骏 现在南京铁道医学院微生物学教研室，南京 210009
作者简介：窦 骏，男，42岁，副教授，博士，主要从事分子免疫学和中药免疫调理研究；刘克洲，男，60岁，教授，博士生导师，主要从事病毒性肝炎防治研究
4 参考文献
[1] Ulmer J B, Donnelly J J,Parker S E et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein.Science,1993;259:1745
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〔收稿1997-08-30 三次修回1998-08-20〕, 百拇医药