血管内皮生长因子与一氧化氮
作者：刘艳秋 周爱儒
单位：北京医科大学生物化学与分子生物学系，北京 100083
关键词：血管内皮生长因子；一氧化氮；新血管形成
生理科学进展000116 摘要 血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞特异性促有丝分裂原，具有促进内皮细胞增生、迁移及增加血管通透性的作用，其强大的促进新血管形成的作用使其在梗塞性血管病的基因治疗中发挥巨大作用。但其作用机制仍不清楚。研究表明VEGF与一氧化氮(NO)间存在密切关系，NO是VEGF发挥许多重要生理作用过程中必不可少的因素。探讨VEGF与NO的关系有助于进一步阐明VEGF的作用机制。
学科分类号 R331.3
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是内皮细胞特异性促有丝分裂原，具有促进内皮细胞增生、迁移，增加血管渗透性和加速新血管形成的作用。VEGF与其特异性受体结合后发挥这些生理作用。但其作用机制仍不清楚。体内的一氧化氮(NO)是由L-精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化而生成的。NOS是其产生的限速性因素。NOS分为结构型(constitutive NOS)和诱导型(inducible NOS)两类。前者主要出现于神经和内皮中，为钙依赖型；后者出现于被激活的巨噬细胞和血管平滑肌中，为非钙依赖型[1，2]。VEGF与 NO这两种分子都是近年的研究热点。而且，已有研究发现VEGF与NO间存在密切关系。
, 百拇医药
一、 NO参与VEGF的促进血管通透性的作用
血管增生是以微血管通透性增强为前提的。有研究者[3]给豚鼠注射EBD(一种染料)后，再注射各种所要检测的试剂，根据其皮肤蓝斑形成情况判断该试剂对血管通透性的影响。用Miles Assay法证实VEGF是通过与其KDR(kinase-insert domain-containing receptor， VEGF receptor-2)受体相互作用后使NO产生增加,若给予作用于Flt-1(fms-like tyrosine kinase-1,VEGF receptor-1)受体的PDGF则不会使NO产生增加，而NO又可激活环氧化酶而刺激前列腺素的产生[4]。VEGF和前列环素(prostacycline)均可以使VEGF的促进血管通透性作用增强。NOS的抑制剂L-NNA或L-NAME均会抑制VEGF诱导的促进血管通透性作用。使用环氧化酶抑制剂(消炎痛)同样也会抑制VEGF诱导的促血管通透性作用。在众多的生长因子中仅VEGF具有这些特性。
, 百拇医药
二、 NO参与VEGF的促进内皮迁移的过程
内皮细胞的迁移也是血管增生过程中的关键因素之一。Noiri等[5]的研究表明,VEGF指导的细胞迁移和促进新血管形成过程中，结构型NOS起到一定的作用。在这一研究中，他们进行了两个实验：(1)VEGF 能够使微血管内皮细胞释放NO，并能诱导内皮细胞的迁移。而NOS的抑制剂L-NAME或NOS的反义核苷酸则抑制VEGF的这一作用;(2)在一系列内皮细胞的创伤愈合实验中,VEGF刺激的细胞迁移速率明显受到NOS抑制剂的阻抑。这些实验说明NO在内皮细胞的迁移和创伤愈合过程中是一个必要的因素。而且有研究报道(Noiri等.1996)NO能使内皮细胞由静态表型转化为运动表型，在指导因子如VEGF存在时，内皮细胞才能作定向迁移。
三、 NO介导VEGF对冠状静脉内皮的促有丝分裂效应
已有研究支持NO在新血管形成过程中起作用，NO能刺激内皮细胞增生和迁移。而且，能激活NOS的NO供体硝普钠能促进内皮细胞增生。而NOS的抑制剂能抑制此反应(Ziche等.1993)。在此基础上，Morbideui等[6]研究了从冠脉毛细血管静脉丛中分离出的微血管内皮细胞在VEGF诱导其有丝分裂中NO的角色。发现VEGF能以剂量依赖性方式促进冠状静脉内皮细胞增生，不同浓度NOS抑制剂也能以剂量依赖性方式阻断VEGF的促内皮细胞的增生作用。而NOS的抑制剂不影响bFGF的促内皮细胞增生作用。另外，VEGF刺激细胞后，细胞中cGMP水平会急剧增高，VEGF促进cGMP增高的程度要强于外源性NO的作用。bFGF不会引起cGMP水平的增高。实验也证实了cGMP水平的增高是由于VEGF促进内皮细胞释放NO而使其水平增高。这种VEGF激发NO自分泌效应是很有效的，其他生长因子不具有这一效果。
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四、 VEGF和NO在调节内皮细胞完整性中的相互关系
将大鼠胸主动脉血管段取出后置于无血清培养基中培养，用体外球囊成形术损伤血管内膜。Northern blot 分析可见VEGF mRNA损伤后2小时开始上调，4小时达高峰，24小时仍有较强信号存在。Western blot分析可见4小时VEGF蛋白表达最高。免疫组化法和原位杂交实验揭示动脉损伤后，VEGF在动脉平滑肌细胞中表达升高。机械损伤对包括平滑肌细胞在内的各型细胞都有加速其磷脂酰4，5-二磷酸肌醇(PIP2)的水解作用。其水解后产生甘油二酯(DG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)，这两者可激活PKC。暂时性的损伤也能激活C-Src酪氨酸激酶。如果动脉段在球囊损伤前给予PKC抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂均可剂量依赖性抑制球囊损伤引起的VEGF上调。这表明PKC和酪氨酸激酶在介导球囊损伤引起的VEGF上调中起作用[7]。体外研究已表明[8]VEGF能刺激内皮细胞产生NO，再生的内皮中NO的恢复对动脉壁中VEGF起反馈调节作用。研究还发现给予硝普钠(SNAP)处理的球囊损伤后的离体大鼠胸主动脉段中PKC和C-Src酪氨酸激酶活性均被明显抑制。表明动脉壁中NO通过抑制PKC和C-Src酪氨酸激酶活性而对VEGF起负性调节作用。通过用含VEGF基因启动子的报告基因转染平滑肌细胞，发现NO能抑制佛波酯(PMA)诱导的VEGF启动子活性增强作用。用EMSA实验发现NO下调VEGF是通过抑制PKC诱导激活的AP-1与VEGF启动子结合活性而达到的。
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五、 VEGF与NO的相互作用机制
有研究显示[9]，VEGF刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后能产生NO，而且NO的增加呈现急性升高和慢性升高两相性。由于用钙离子通道激动剂(calcium ionophore )A-23187能使NO释放迅速增加，而VEGF又能诱导细胞质中钙离子水平迅速增高，推测VEGF刺激内皮细胞后NO的急性释放可能是由于NOS被钙激活所致。其慢性增加可能是由于VEGF引起内皮NOS mRNA及其蛋白的增加而引起的。我室的研究表明缺氧能诱导血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞中VEGF mRNA表达增加，NO能抑制其表达的上调，NO的抑制剂LNNA则能部分恢复其表达(张曼等.1998)。还有研究表明[10]，缺氧引起平滑肌细胞中VEGF表达上调是通过激活位于VEGF基因5’上游区的28bp增强子而增加VEGF转录率而达到的。而NO能抑制平滑肌细胞中缺氧诱导的VEGF表达上调。因为NO能激活鸟苷酸环化酶使cGMP水平增高，cGMP类似物8-Br-cGMP对VEGF增强子的缺氧诱导激活起明显抑制效应。推测NO抑制缺氧时内皮细胞中的VEGF产生是通过cGMP介导的途径。
, 百拇医药
基于上述实验结果及推测，可以得出血管中VEGF及NO可能的相互作用方式。缺氧和/或损伤使内皮细胞和/或血管平滑肌细胞中VEGF的表达升高，升高的VEGF通过自分泌或旁分泌作用于内皮细胞，使内皮细胞中NO的产生增加，而增加的NO又反作用于缺氧的平滑肌细胞使其中的VEGF的表达降低。这样的一个反馈调节过程使损伤和/或缺氧的血管壁尽快恢复正常，而又不致于使VEGF过度表达产生有害效应。
国家教委博士点基金资助课题
参考文献
1，Lowenstein C,Synder SH.Nitric oxide,a novel biologic messenger.Cell,1992,70∶705～707.
2，唐朝枢,汤健.一氧化氮与疾病.中华医学杂志,1998,78∶5.
, http://www.100md.com
3，Murohara T,Horowitz JR,Silver M.Vascular endothelial growth factor / VPF enhances vascular permeability via nitric oxide and prostacyclin.Circulation,1998,97∶99～107.
4，Davidge ST,Baker PN,Mclanghlin MK.Nitric oxide produced by endothelial cells increases productions of eicosanoids through activation of prostaglandin H synthase.Circ Res,1995,77∶274～283.
5，Noiri E,Lee E,Testa J,et al.Podokinesis in endothelial cell migration: role of nitric oxide.Am J Physiol,1998,274∶C236～C244.
, http://www.100md.com
6，Morbidelli L,Chang CH,Douglas JG.Nitric oxide mediates mitogenic effect of VEGF on coronary venular endothelium.Am J Physiol,1996,270∶H411～H415.
7，Tsurumi Y,Murohara T,Krasinski K.Reciprocal relation between VEGF and NO in the regulation of endothelial integrity.Nat Med,1997,3∶879～886.
8，Zee R,Murohara T,Luo ZY.VEGF/VPF augments nitric oxide release from quiescent rabbit and human vascular endothelium.Circulation,1997,95∶1030～1037.
9，Hood JD,Meininger CJ,Ziche M,et al.VEGF upregulates ecNOS message,protein and NO production in human endothelial cells.Am J Physiol,1998,274∶H1054～1058.
10，Liu YX,Christou H,Morita T.Carbon monoxide and nitric oxide suppress the hypoxic induction of VEGF gene via the 5' enhancer.J Biol Chem,1998,273∶15257～15262., http://www.100md.com
单位：北京医科大学生物化学与分子生物学系，北京 100083
关键词：血管内皮生长因子；一氧化氮；新血管形成
生理科学进展000116 摘要 血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞特异性促有丝分裂原，具有促进内皮细胞增生、迁移及增加血管通透性的作用，其强大的促进新血管形成的作用使其在梗塞性血管病的基因治疗中发挥巨大作用。但其作用机制仍不清楚。研究表明VEGF与一氧化氮(NO)间存在密切关系，NO是VEGF发挥许多重要生理作用过程中必不可少的因素。探讨VEGF与NO的关系有助于进一步阐明VEGF的作用机制。
学科分类号 R331.3
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是内皮细胞特异性促有丝分裂原，具有促进内皮细胞增生、迁移，增加血管渗透性和加速新血管形成的作用。VEGF与其特异性受体结合后发挥这些生理作用。但其作用机制仍不清楚。体内的一氧化氮(NO)是由L-精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)催化而生成的。NOS是其产生的限速性因素。NOS分为结构型(constitutive NOS)和诱导型(inducible NOS)两类。前者主要出现于神经和内皮中，为钙依赖型；后者出现于被激活的巨噬细胞和血管平滑肌中，为非钙依赖型[1，2]。VEGF与 NO这两种分子都是近年的研究热点。而且，已有研究发现VEGF与NO间存在密切关系。
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一、 NO参与VEGF的促进血管通透性的作用
血管增生是以微血管通透性增强为前提的。有研究者[3]给豚鼠注射EBD(一种染料)后，再注射各种所要检测的试剂，根据其皮肤蓝斑形成情况判断该试剂对血管通透性的影响。用Miles Assay法证实VEGF是通过与其KDR(kinase-insert domain-containing receptor， VEGF receptor-2)受体相互作用后使NO产生增加,若给予作用于Flt-1(fms-like tyrosine kinase-1,VEGF receptor-1)受体的PDGF则不会使NO产生增加，而NO又可激活环氧化酶而刺激前列腺素的产生[4]。VEGF和前列环素(prostacycline)均可以使VEGF的促进血管通透性作用增强。NOS的抑制剂L-NNA或L-NAME均会抑制VEGF诱导的促进血管通透性作用。使用环氧化酶抑制剂(消炎痛)同样也会抑制VEGF诱导的促血管通透性作用。在众多的生长因子中仅VEGF具有这些特性。
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二、 NO参与VEGF的促进内皮迁移的过程
内皮细胞的迁移也是血管增生过程中的关键因素之一。Noiri等[5]的研究表明,VEGF指导的细胞迁移和促进新血管形成过程中，结构型NOS起到一定的作用。在这一研究中，他们进行了两个实验：(1)VEGF 能够使微血管内皮细胞释放NO，并能诱导内皮细胞的迁移。而NOS的抑制剂L-NAME或NOS的反义核苷酸则抑制VEGF的这一作用;(2)在一系列内皮细胞的创伤愈合实验中,VEGF刺激的细胞迁移速率明显受到NOS抑制剂的阻抑。这些实验说明NO在内皮细胞的迁移和创伤愈合过程中是一个必要的因素。而且有研究报道(Noiri等.1996)NO能使内皮细胞由静态表型转化为运动表型，在指导因子如VEGF存在时，内皮细胞才能作定向迁移。
三、 NO介导VEGF对冠状静脉内皮的促有丝分裂效应
已有研究支持NO在新血管形成过程中起作用，NO能刺激内皮细胞增生和迁移。而且，能激活NOS的NO供体硝普钠能促进内皮细胞增生。而NOS的抑制剂能抑制此反应(Ziche等.1993)。在此基础上，Morbideui等[6]研究了从冠脉毛细血管静脉丛中分离出的微血管内皮细胞在VEGF诱导其有丝分裂中NO的角色。发现VEGF能以剂量依赖性方式促进冠状静脉内皮细胞增生，不同浓度NOS抑制剂也能以剂量依赖性方式阻断VEGF的促内皮细胞的增生作用。而NOS的抑制剂不影响bFGF的促内皮细胞增生作用。另外，VEGF刺激细胞后，细胞中cGMP水平会急剧增高，VEGF促进cGMP增高的程度要强于外源性NO的作用。bFGF不会引起cGMP水平的增高。实验也证实了cGMP水平的增高是由于VEGF促进内皮细胞释放NO而使其水平增高。这种VEGF激发NO自分泌效应是很有效的，其他生长因子不具有这一效果。
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四、 VEGF和NO在调节内皮细胞完整性中的相互关系
将大鼠胸主动脉血管段取出后置于无血清培养基中培养，用体外球囊成形术损伤血管内膜。Northern blot 分析可见VEGF mRNA损伤后2小时开始上调，4小时达高峰，24小时仍有较强信号存在。Western blot分析可见4小时VEGF蛋白表达最高。免疫组化法和原位杂交实验揭示动脉损伤后，VEGF在动脉平滑肌细胞中表达升高。机械损伤对包括平滑肌细胞在内的各型细胞都有加速其磷脂酰4，5-二磷酸肌醇(PIP2)的水解作用。其水解后产生甘油二酯(DG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)，这两者可激活PKC。暂时性的损伤也能激活C-Src酪氨酸激酶。如果动脉段在球囊损伤前给予PKC抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂均可剂量依赖性抑制球囊损伤引起的VEGF上调。这表明PKC和酪氨酸激酶在介导球囊损伤引起的VEGF上调中起作用[7]。体外研究已表明[8]VEGF能刺激内皮细胞产生NO，再生的内皮中NO的恢复对动脉壁中VEGF起反馈调节作用。研究还发现给予硝普钠(SNAP)处理的球囊损伤后的离体大鼠胸主动脉段中PKC和C-Src酪氨酸激酶活性均被明显抑制。表明动脉壁中NO通过抑制PKC和C-Src酪氨酸激酶活性而对VEGF起负性调节作用。通过用含VEGF基因启动子的报告基因转染平滑肌细胞，发现NO能抑制佛波酯(PMA)诱导的VEGF启动子活性增强作用。用EMSA实验发现NO下调VEGF是通过抑制PKC诱导激活的AP-1与VEGF启动子结合活性而达到的。
, 百拇医药
五、 VEGF与NO的相互作用机制
有研究显示[9]，VEGF刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后能产生NO，而且NO的增加呈现急性升高和慢性升高两相性。由于用钙离子通道激动剂(calcium ionophore )A-23187能使NO释放迅速增加，而VEGF又能诱导细胞质中钙离子水平迅速增高，推测VEGF刺激内皮细胞后NO的急性释放可能是由于NOS被钙激活所致。其慢性增加可能是由于VEGF引起内皮NOS mRNA及其蛋白的增加而引起的。我室的研究表明缺氧能诱导血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞中VEGF mRNA表达增加，NO能抑制其表达的上调，NO的抑制剂LNNA则能部分恢复其表达(张曼等.1998)。还有研究表明[10]，缺氧引起平滑肌细胞中VEGF表达上调是通过激活位于VEGF基因5’上游区的28bp增强子而增加VEGF转录率而达到的。而NO能抑制平滑肌细胞中缺氧诱导的VEGF表达上调。因为NO能激活鸟苷酸环化酶使cGMP水平增高，cGMP类似物8-Br-cGMP对VEGF增强子的缺氧诱导激活起明显抑制效应。推测NO抑制缺氧时内皮细胞中的VEGF产生是通过cGMP介导的途径。
, 百拇医药
基于上述实验结果及推测，可以得出血管中VEGF及NO可能的相互作用方式。缺氧和/或损伤使内皮细胞和/或血管平滑肌细胞中VEGF的表达升高，升高的VEGF通过自分泌或旁分泌作用于内皮细胞，使内皮细胞中NO的产生增加，而增加的NO又反作用于缺氧的平滑肌细胞使其中的VEGF的表达降低。这样的一个反馈调节过程使损伤和/或缺氧的血管壁尽快恢复正常，而又不致于使VEGF过度表达产生有害效应。
国家教委博士点基金资助课题
参考文献
1，Lowenstein C,Synder SH.Nitric oxide,a novel biologic messenger.Cell,1992,70∶705～707.
2，唐朝枢,汤健.一氧化氮与疾病.中华医学杂志,1998,78∶5.
, http://www.100md.com
3，Murohara T,Horowitz JR,Silver M.Vascular endothelial growth factor / VPF enhances vascular permeability via nitric oxide and prostacyclin.Circulation,1998,97∶99～107.
4，Davidge ST,Baker PN,Mclanghlin MK.Nitric oxide produced by endothelial cells increases productions of eicosanoids through activation of prostaglandin H synthase.Circ Res,1995,77∶274～283.
5，Noiri E,Lee E,Testa J,et al.Podokinesis in endothelial cell migration: role of nitric oxide.Am J Physiol,1998,274∶C236～C244.
, http://www.100md.com
6，Morbidelli L,Chang CH,Douglas JG.Nitric oxide mediates mitogenic effect of VEGF on coronary venular endothelium.Am J Physiol,1996,270∶H411～H415.
7，Tsurumi Y,Murohara T,Krasinski K.Reciprocal relation between VEGF and NO in the regulation of endothelial integrity.Nat Med,1997,3∶879～886.
8，Zee R,Murohara T,Luo ZY.VEGF/VPF augments nitric oxide release from quiescent rabbit and human vascular endothelium.Circulation,1997,95∶1030～1037.
9，Hood JD,Meininger CJ,Ziche M,et al.VEGF upregulates ecNOS message,protein and NO production in human endothelial cells.Am J Physiol,1998,274∶H1054～1058.
10，Liu YX,Christou H,Morita T.Carbon monoxide and nitric oxide suppress the hypoxic induction of VEGF gene via the 5' enhancer.J Biol Chem,1998,273∶15257～15262., http://www.100md.com