DNA甲基化作用对细胞癌变的影响
作者：白坚石 何忠效
单位：白坚石(军事医学科学院野战输血所,北京 100850)；何忠效(北京师范大学生物系,北京 100875)
关键词：DNA甲基化；5-甲基胞嘧啶；基因；癌变
生理科学进展000111 摘要 5-甲基胞嘧啶的形成引起自发脱氨是真核生物中一种普遍存在的内源突变过程。DNA甲基化酶具有突变诱导物作用并在癌变中表达增加。癌细胞基因组呈现DNA甲基化不足而影响基因组的稳定性；组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化；癌基因多为不充分甲基化导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化从而形成突变靶点。DNA甲基化效应物可改变癌变相关基因的表达。
学科分类号 Q523.1
DNA甲基化作用是在真核生物体内普遍存在的一种基因内源修饰作用，其产物5-甲基胞嘧啶(5-mC)由于可自发脱氨生成胸腺嘧啶造成CpG变成TpG，并导致31.7%的相关突变而成为体内的突变热点[1]。DNA甲基化酶可以作为一个突变的诱导物参与癌变过程[2]，转基因实验和基因敲除(knockout)实验表明，DNA甲基化酶具有诱导成纤维细胞的致瘤性,且与小鼠腺瘤的形成具有同谋关系。癌变中特异基因的甲基化水平也有着明显的变化。因此，通过改变甲基化作用有望成为肿瘤治疗的有效途径。
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一、癌细胞基因组范围的低甲基化
大多数癌变中细胞基因组范围呈现DNA低甲基化水平[3]，如结肠癌(Peter.1997)，卵巢癌(Cheng等.1997)和乳腺癌(Narayan.1998)。Jones (1990)提出，基因组范围的DNA低甲基化水平可以激活原来保持沉默状态的基因如生长促进基因特别是原癌基因的表达。Smith(1991)和Pogribny(1995)认为，基因组DNA低甲基化水平可以引起染色质结构的改变并进而引起基因组的不稳定性，使染色质凝聚程度降低，原有构象改变使得DNA对影响其结构稳定的因素更易接近和更为敏感，并使得DNA修复蛋白不易识别和接近DNA。基因组范围的DNA低甲基化是癌变过程中早期的分子异常之一[4]。Riggs(1983)认为其形成可能是体内脱甲基化活力的作用结果，也可能是由于DNA复制时某种原因使甲基化酶未能在半甲基化处催化形成甲基化，以致于在以后的DNA复制中产生完全去甲基化的DNA分子；Ramsahoye(1996)则认为，具有DNA含量增高的非整倍体肿瘤可能具有低甲基化的特殊倾向。
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二、癌变中DNA甲基化酶呈现高表达
癌变中DNA甲基化酶的表达明显增高[5]。Kautianew(1986)、EI-Deiry (1991)和Jakob(1999)发现，在培养的肿瘤细胞和结肠癌中，DNA甲基化酶的表达明显增加。Macleod(1995)认为，DNA甲基化酶可能使参与细胞周期控制的基因处于沉默状态。Peter (1997)则认为，酶的表达增高可能诱导5-mC脱氨，并由此导致抑癌基因功能的丧失。此外，Macleod (1995)还证实通过该酶的反义构建物可以使恶性肿瘤细胞表型逆转，Laird等(1995)还发现该酶表达降低可导致结肠息肉数目减少。从而说明，DNA甲基化酶的低水平可能引起与肿瘤发展相关的突变率降低。而且，Roulean(1995)提出DNA甲基化酶在Ras信号途径中是一个下调效应物，而Ras途径导致DNA甲基化酶表达水平增高，最终的甲基化水平可能是由Ras诱导的甲基化与脱甲基化之间平衡的结果。
三、癌细胞中出现从头甲基化
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癌细胞中组织特异性基因的启动子区域常出现从头甲基化现象(de novo methylation)[6]，如膀胱癌(Juan Fueyo.1996)，白血病(Momoarler.1997)和结肠癌(Ahuja.1998)。Ihalainen 等(1993)和Belinsky(1996)认为这与肿瘤细胞中DNA甲基化酶表达增加是一致的；Issa(1994)认为，从头甲基化是癌变的早期事件。Herman 等(1995)认为，可能正是由于从头型DNA甲基化酶活性增高，使有些基因的启动子区域出现过甲基化状态，造成有些抑癌基因如p16和VHL失活，由此失去对细胞周期和细胞分化的控制。从头DNA甲基化的出现也可能是抑癌基因的选择结果。Pfeifer 等(1990)提出含有CpG岛的抑癌基因可能对随机甲基化差错敏感，导致原来未甲基化的CpG岛出现部分甲基化，引起抑癌基因活性下调，并由此导致细胞生长速度的提高。由于没有证据表明在癌变过程中存在特殊序列的引导性从头甲基化，甲基化差错引起的甲基化异常可能导致DNA序列出现遗传修饰变化。Jones 等(1990)还证明CpG岛的从头甲基化可能是逐渐进行的。
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四、癌细胞中癌基因多为不充分甲基化状态
肿瘤细胞中原癌基因呈低甲基化水平[7]，如c-myc、c-fos、c-N-ras和c-Ha-ras等，且原癌基因的低甲基化可使其重新开放或在特定组织中异常表达，促进细胞恶性转化。关于c-myc的低甲基化，已有专文介绍(肖文华.1992)。Sharrard(1992)对c-Ha-ras基因研究表明，其CGCG序列在结肠癌、肺癌以及肝癌中甲基化程度明显降低，CCGG序列在人胃癌中呈低甲基化。Uyeno(1996)报道，在人肝癌变与人神经胶质瘤中，c-fos基因的甲基化水平也都明显降低。Shen(1998)证实，人肝癌c-N-ras甲基化水平降低61%。Ohtsuki(1991)证实，在膀胱癌和大鼠肝癌诱变过程中，基因组和c-Ha-ras及c-fos呈低甲基化，且随着肿瘤的发展低甲基化程度愈发明显；另外，那些原癌基因甲基化程度更低的肿瘤表现出更大的恶性侵袭能力。
五、抑癌基因多为过度甲基化状态
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肿瘤细胞中一些抑癌基因呈现过甲基化状态并导致转录失活[8]。关于p53和Rb甲基化的研究，已有专文介绍(杨和平等.1994)。此外，Schroeder(1997)发现许多肿瘤细胞的p53基因由于其启动子区域(-199～+142)中15个CpG位点甲基化使其转录失活；Stirzaker(1997)则进一步发现，Rb的甲基化遍布其所有27个CpG位点(包括核心启动子)。
p16基因的5’和3’端均分布有丰富的CpG岛，甲基化也是导致其失活的原因之一。Hermann等(1995)和Juan Fueyo(1996)发现，40%原发性结肠癌及92%结肠癌细胞及膀胱癌和膀胱癌细胞株发生p16基因过甲基化；且在p16甲基化的大肠癌细胞系中，p16 mRNA的表达缺失仅与第一外显子甲基化相关； 67%膀胱癌出现p16的5’端CpG岛的从头甲基化并造成其表达缺乏。Woloschak(1997)也证实，人垂体肿瘤中p16因甲基化而频发失活，并认为其5’端的CpG岛广泛高度甲基化是垂体细胞转化的一个早期和必要事件。另外，在白血病(Momoarler.1997)、肺癌(Belinsky.1998)、卵巢癌(McCluskey.1999)、肝癌(Wong.1999，Matsuda.1999)、粘蛋白状肿瘤(Milde Langosch.1998)和乳腺癌(Woodcock.1999)中，p16启动子存在过甲基化并阻止其转录活性。Issa (1997)发现白血病细胞中p16启动子区域的过甲基化是由从头甲基化引起的，由此Ohnishi认为启动子的过甲基化可能是白血病形成的早期事件。
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六、DNA甲基化及癌症治疗
如前所述，DNA甲基化作用以不同方式对细胞癌变的影响是肯定的，在进一步了解特异基因的甲基化水平与其表达相关性的基础上，深入研究各种反式作用因子特别是CpG结合蛋白与甲基化位点的作用将有助于对DNA甲基化与癌变相关性的了解。癌变中异常DNA甲基化所表现出的性质，使其有望成为肿瘤治疗的有效途径[9]。一些基因的高甲基化水平使得它们有可能成为肿瘤的标志物；被甲基化差错关闭的基因，可由DNA甲基化抑制剂如5-氮胞苷类物质降低其异常高甲基化，导致重新激活。5-氮胞苷和5-氮-2’-脱氧胞苷已用于白血病的治疗，Momparler(1997)也将其用于肺癌治疗，国内也已开展这方面的工作。但是，由于5-氮胞苷类药物存在癌变诱变性(Momparler.1997)、浓度高具有细胞毒性且对改变基因表达并不有效(Jackson.1997)，化学不稳定性以及处理缺失或突变基因的无效，使得5-氮胞苷类药物在临床上的应用受到很大影响。所以，迫切需要寻找其他DNA甲基化作用的调节物用于癌细胞的恶性表型逆转及癌症的治疗。
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参考文献
1，Schmutte C,Jones PA.Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis.Biol Chem,1998,379∶377～388.
2，Belinsky SA.Role of the cytosine DNA methyltransferase and p16INK4a in the development of mouse lung tumors.Exp Lung Res，1998,24∶463～479.
3，Soares J,Pinto AE,Cunha CV，et al.Global DNA hypomethylation in breast carcinoma: correlation with prognostic and tumor progression.Cancer，1999,85∶112～118.
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4，Ahuja N,Li Q,Mohan AL，et al .Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer.Cancer Res,1998,58∶5489～5494.
5，Sun L,Hui AM,Kanai Y，et al.Increased DNA methyltransferase expression is associated with an early state of human hepatocarcinogenesis.Jpn J Cancer Res,1997,88∶1165～1170.
6，Cheng P,Schmutte C,Cofer KF,et al.Alterations in DNA methylation are early,but not initial events in ovarian tumorigenesis.Br J Cancer,1997,75∶396～402.
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7，Sardi I,Dal Canto M,Bartoletti R,et al.Molecular genetic alterations of c-myc oncogene in superficial and locally advanced bladder cancer.Eur Urol,1998,33∶424～430.
8，McCluskey LL,Chen C,Delgadillo E,et al.Differences in p16 gene methylation and expression in benign and malignant ovarian tumors.Gynecol Oncol.1999,72∶87～92.
9，Bender CM,Zingg JM,Jones PA.DNA methylation as a target for drug design.Pharm Res，1998,15∶175～187., 百拇医药
单位：白坚石(军事医学科学院野战输血所,北京 100850)；何忠效(北京师范大学生物系,北京 100875)
关键词：DNA甲基化；5-甲基胞嘧啶；基因；癌变
生理科学进展000111 摘要 5-甲基胞嘧啶的形成引起自发脱氨是真核生物中一种普遍存在的内源突变过程。DNA甲基化酶具有突变诱导物作用并在癌变中表达增加。癌细胞基因组呈现DNA甲基化不足而影响基因组的稳定性；组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化；癌基因多为不充分甲基化导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过度甲基化从而形成突变靶点。DNA甲基化效应物可改变癌变相关基因的表达。
学科分类号 Q523.1
DNA甲基化作用是在真核生物体内普遍存在的一种基因内源修饰作用，其产物5-甲基胞嘧啶(5-mC)由于可自发脱氨生成胸腺嘧啶造成CpG变成TpG，并导致31.7%的相关突变而成为体内的突变热点[1]。DNA甲基化酶可以作为一个突变的诱导物参与癌变过程[2]，转基因实验和基因敲除(knockout)实验表明，DNA甲基化酶具有诱导成纤维细胞的致瘤性,且与小鼠腺瘤的形成具有同谋关系。癌变中特异基因的甲基化水平也有着明显的变化。因此，通过改变甲基化作用有望成为肿瘤治疗的有效途径。
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一、癌细胞基因组范围的低甲基化
大多数癌变中细胞基因组范围呈现DNA低甲基化水平[3]，如结肠癌(Peter.1997)，卵巢癌(Cheng等.1997)和乳腺癌(Narayan.1998)。Jones (1990)提出，基因组范围的DNA低甲基化水平可以激活原来保持沉默状态的基因如生长促进基因特别是原癌基因的表达。Smith(1991)和Pogribny(1995)认为，基因组DNA低甲基化水平可以引起染色质结构的改变并进而引起基因组的不稳定性，使染色质凝聚程度降低，原有构象改变使得DNA对影响其结构稳定的因素更易接近和更为敏感，并使得DNA修复蛋白不易识别和接近DNA。基因组范围的DNA低甲基化是癌变过程中早期的分子异常之一[4]。Riggs(1983)认为其形成可能是体内脱甲基化活力的作用结果，也可能是由于DNA复制时某种原因使甲基化酶未能在半甲基化处催化形成甲基化，以致于在以后的DNA复制中产生完全去甲基化的DNA分子；Ramsahoye(1996)则认为，具有DNA含量增高的非整倍体肿瘤可能具有低甲基化的特殊倾向。
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二、癌变中DNA甲基化酶呈现高表达
癌变中DNA甲基化酶的表达明显增高[5]。Kautianew(1986)、EI-Deiry (1991)和Jakob(1999)发现，在培养的肿瘤细胞和结肠癌中，DNA甲基化酶的表达明显增加。Macleod(1995)认为，DNA甲基化酶可能使参与细胞周期控制的基因处于沉默状态。Peter (1997)则认为，酶的表达增高可能诱导5-mC脱氨，并由此导致抑癌基因功能的丧失。此外，Macleod (1995)还证实通过该酶的反义构建物可以使恶性肿瘤细胞表型逆转，Laird等(1995)还发现该酶表达降低可导致结肠息肉数目减少。从而说明，DNA甲基化酶的低水平可能引起与肿瘤发展相关的突变率降低。而且，Roulean(1995)提出DNA甲基化酶在Ras信号途径中是一个下调效应物，而Ras途径导致DNA甲基化酶表达水平增高，最终的甲基化水平可能是由Ras诱导的甲基化与脱甲基化之间平衡的结果。
三、癌细胞中出现从头甲基化
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癌细胞中组织特异性基因的启动子区域常出现从头甲基化现象(de novo methylation)[6]，如膀胱癌(Juan Fueyo.1996)，白血病(Momoarler.1997)和结肠癌(Ahuja.1998)。Ihalainen 等(1993)和Belinsky(1996)认为这与肿瘤细胞中DNA甲基化酶表达增加是一致的；Issa(1994)认为，从头甲基化是癌变的早期事件。Herman 等(1995)认为，可能正是由于从头型DNA甲基化酶活性增高，使有些基因的启动子区域出现过甲基化状态，造成有些抑癌基因如p16和VHL失活，由此失去对细胞周期和细胞分化的控制。从头DNA甲基化的出现也可能是抑癌基因的选择结果。Pfeifer 等(1990)提出含有CpG岛的抑癌基因可能对随机甲基化差错敏感，导致原来未甲基化的CpG岛出现部分甲基化，引起抑癌基因活性下调，并由此导致细胞生长速度的提高。由于没有证据表明在癌变过程中存在特殊序列的引导性从头甲基化，甲基化差错引起的甲基化异常可能导致DNA序列出现遗传修饰变化。Jones 等(1990)还证明CpG岛的从头甲基化可能是逐渐进行的。
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四、癌细胞中癌基因多为不充分甲基化状态
肿瘤细胞中原癌基因呈低甲基化水平[7]，如c-myc、c-fos、c-N-ras和c-Ha-ras等，且原癌基因的低甲基化可使其重新开放或在特定组织中异常表达，促进细胞恶性转化。关于c-myc的低甲基化，已有专文介绍(肖文华.1992)。Sharrard(1992)对c-Ha-ras基因研究表明，其CGCG序列在结肠癌、肺癌以及肝癌中甲基化程度明显降低，CCGG序列在人胃癌中呈低甲基化。Uyeno(1996)报道，在人肝癌变与人神经胶质瘤中，c-fos基因的甲基化水平也都明显降低。Shen(1998)证实，人肝癌c-N-ras甲基化水平降低61%。Ohtsuki(1991)证实，在膀胱癌和大鼠肝癌诱变过程中，基因组和c-Ha-ras及c-fos呈低甲基化，且随着肿瘤的发展低甲基化程度愈发明显；另外，那些原癌基因甲基化程度更低的肿瘤表现出更大的恶性侵袭能力。
五、抑癌基因多为过度甲基化状态
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肿瘤细胞中一些抑癌基因呈现过甲基化状态并导致转录失活[8]。关于p53和Rb甲基化的研究，已有专文介绍(杨和平等.1994)。此外，Schroeder(1997)发现许多肿瘤细胞的p53基因由于其启动子区域(-199～+142)中15个CpG位点甲基化使其转录失活；Stirzaker(1997)则进一步发现，Rb的甲基化遍布其所有27个CpG位点(包括核心启动子)。
p16基因的5’和3’端均分布有丰富的CpG岛，甲基化也是导致其失活的原因之一。Hermann等(1995)和Juan Fueyo(1996)发现，40%原发性结肠癌及92%结肠癌细胞及膀胱癌和膀胱癌细胞株发生p16基因过甲基化；且在p16甲基化的大肠癌细胞系中，p16 mRNA的表达缺失仅与第一外显子甲基化相关； 67%膀胱癌出现p16的5’端CpG岛的从头甲基化并造成其表达缺乏。Woloschak(1997)也证实，人垂体肿瘤中p16因甲基化而频发失活，并认为其5’端的CpG岛广泛高度甲基化是垂体细胞转化的一个早期和必要事件。另外，在白血病(Momoarler.1997)、肺癌(Belinsky.1998)、卵巢癌(McCluskey.1999)、肝癌(Wong.1999，Matsuda.1999)、粘蛋白状肿瘤(Milde Langosch.1998)和乳腺癌(Woodcock.1999)中，p16启动子存在过甲基化并阻止其转录活性。Issa (1997)发现白血病细胞中p16启动子区域的过甲基化是由从头甲基化引起的，由此Ohnishi认为启动子的过甲基化可能是白血病形成的早期事件。
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六、DNA甲基化及癌症治疗
如前所述，DNA甲基化作用以不同方式对细胞癌变的影响是肯定的，在进一步了解特异基因的甲基化水平与其表达相关性的基础上，深入研究各种反式作用因子特别是CpG结合蛋白与甲基化位点的作用将有助于对DNA甲基化与癌变相关性的了解。癌变中异常DNA甲基化所表现出的性质，使其有望成为肿瘤治疗的有效途径[9]。一些基因的高甲基化水平使得它们有可能成为肿瘤的标志物；被甲基化差错关闭的基因，可由DNA甲基化抑制剂如5-氮胞苷类物质降低其异常高甲基化，导致重新激活。5-氮胞苷和5-氮-2’-脱氧胞苷已用于白血病的治疗，Momparler(1997)也将其用于肺癌治疗，国内也已开展这方面的工作。但是，由于5-氮胞苷类药物存在癌变诱变性(Momparler.1997)、浓度高具有细胞毒性且对改变基因表达并不有效(Jackson.1997)，化学不稳定性以及处理缺失或突变基因的无效，使得5-氮胞苷类药物在临床上的应用受到很大影响。所以，迫切需要寻找其他DNA甲基化作用的调节物用于癌细胞的恶性表型逆转及癌症的治疗。
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参考文献
1，Schmutte C,Jones PA.Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis.Biol Chem,1998,379∶377～388.
2，Belinsky SA.Role of the cytosine DNA methyltransferase and p16INK4a in the development of mouse lung tumors.Exp Lung Res，1998,24∶463～479.
3，Soares J,Pinto AE,Cunha CV，et al.Global DNA hypomethylation in breast carcinoma: correlation with prognostic and tumor progression.Cancer，1999,85∶112～118.
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4，Ahuja N,Li Q,Mohan AL，et al .Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer.Cancer Res,1998,58∶5489～5494.
5，Sun L,Hui AM,Kanai Y，et al.Increased DNA methyltransferase expression is associated with an early state of human hepatocarcinogenesis.Jpn J Cancer Res,1997,88∶1165～1170.
6，Cheng P,Schmutte C,Cofer KF,et al.Alterations in DNA methylation are early,but not initial events in ovarian tumorigenesis.Br J Cancer,1997,75∶396～402.
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7，Sardi I,Dal Canto M,Bartoletti R,et al.Molecular genetic alterations of c-myc oncogene in superficial and locally advanced bladder cancer.Eur Urol,1998,33∶424～430.
8，McCluskey LL,Chen C,Delgadillo E,et al.Differences in p16 gene methylation and expression in benign and malignant ovarian tumors.Gynecol Oncol.1999,72∶87～92.
9，Bender CM,Zingg JM,Jones PA.DNA methylation as a target for drug design.Pharm Res，1998,15∶175～187., 百拇医药