视黄醇结合蛋白的分子生物学
作者：梁学颖 徐琪寿
单位：梁学颖(北京放射医学研究所，北京 100850)；徐琪寿(北京放射医学研究所，北京 100850)
关键词：视黄醇结合蛋白；基因；构效关系；视黄醇
生理科学进展000322 摘要 视黄醇结合蛋白(RBP)是维生素A(Vit A)的运载蛋白，结构上为疏水小分子结合蛋白家族的成员。视黄醇结合蛋白在肝脏中合成并释放入血液后，通过与视黄醇(ROH)、甲状腺素运载蛋白(TTR)及细胞表面受体相互作用，在VitA 的储存、代谢、转运到周围靶器官中发挥重要功能。本文从基因结构与表达、构效关系及临床意义等方面介绍了视黄醇结合蛋白的分子生物学。
学科分类号 R151.2
视黄醇结合蛋白(retinol binding protein, RBP)是体内将VitA 从肝中转运至靶组织的特异的运载蛋白，在协助VitA发挥生理功能中起着不可替代的作用[1]。自从1968年Kanai等首次分离发现RBP后，在人和大鼠中对其进行了广泛研究。本文主要对 RBP 的基因结构与表达、结构与功能、与视黄醇生化代谢的关系、临床意义等方面进行综述。
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一、RBP的基因结构及表达
人RBP基因约10kb，含6个外显子和5个内含子，外显子较短，内含子大小变化很大。基因的旁侧序列至少包括3个不同的控制元件，即(1)一个非组织特异性增强子——能够在一些不同的细胞系中激活的启动子；(2)一个负性顺式激活元件——可能结合阻抑蛋白； (3)启动子元件。这些控制元件如何相互作用，共同调节 RBP 基因表达仍不十分清楚，需进一步研究。RBP的cDNA序列含有一段51个碱基的短5'-非翻译区(5'UTR)和一个负责编码200个氨基酸的从51～651核苷酸的开放阅读框(包括RBP信号肽序列)。而从核苷酸序列推导的氨基酸序列显示RBP含有一条16个氨基酸的信号肽，因此，人RBP最初合成时是一条有184个氨基酸残基的多肽链。
基因构成与蛋白质结构的对比显示，所有最后翻译的外显子的转录与不连续的RBP的结构单元紧密一致，剪切连接发生在 RBP 分子表面残基。所有内含子，除内含子4外，都落在β链结构的边缘。参与结合视黄醇的15个氨基酸残基，由外显子3、4、5分别编码6、5、4个结合残基。氨基酸序列存在两个内在高同源性序列区域(36～86和96～141),推测由部分基因复制所致，但在核酸序列水平则几乎没有同源性。
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RBP 的 mRNA存在于肝、肾、肺、脾、脑、心和骨骼肌等许多组织中，以肝中含量最高。RBP 主要在肝脏中合成并释放入血液，其分泌受到视黄醇的刺激；肾脏合成 RBP有助于视黄醇的再循环利用；卵黄囊中 RBP分泌与肝脏中一样，受到视黄醇摄入量的调控，卵黄囊合成分泌 RBP可能有助于将视黄醇从母体运至发育中的胚胎，同时说明视黄醇类物质是胚胎发育所必需的。
二、 RBP结构与功能的关系(构象分析)
根据序列同源性可将介导VitA转运及行使功能的蛋白分成五类：Ⅰ 分泌型视黄醇结合蛋白、Ⅱ 细胞内视黄醇结合蛋白、Ⅲ 视黄酸的核受体、Ⅳ 视觉组织特异性的细胞外视黄醇结合蛋白、Ⅴ 视觉组织特异性的细胞内视黄醇结合蛋白。Ⅰ、Ⅱ类视黄醇结合蛋白的X-线衍射结构已经研究清楚，主要有Ⅰ类血浆视黄醇结合蛋白(RBP)、附睾视黄酸结合蛋白(E-RABP),和Ⅱ类细胞内视黄醇结合蛋白(Ⅰ)、(Ⅱ)(CRBP(I)、CRBP(II))。其中，Ⅰ类蛋白中血浆视黄醇结合蛋白(RBP)是将 VitA 及其衍生物从肝脏中转运至靶组织的特异蛋白。主要分析Ⅰ类RBP的结构与功能关系。
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RBP 在肝细胞中合成，受到视黄醇刺激后分泌出来，特异性地结合全反式视黄醇，到达血液中后，又与甲状腺素运载蛋白(transthyretin， TTR)形成复合物，从而防止低分子量的RBP被肾小球滤过。需要说明的是：无论VitA将以醇、醛还是酸的形式被利用，只有全反式视黄醇才能刺激RBP的分泌[2]。
RBP为一种单一肽链的蛋白质，分子量约21 000，含有184个氨基酸残基和3个二硫键，有一个位点结合一分子的全反式视黄醇。对holo-RBP(结合视黄醇的RBP)晶体结构的研究表明，整个分子由N-末端环、β片层结构核心、α螺旋和C-末端环组成，在空间中以单一的直径4nm的球状结构域的形式存在，似一个洞穴。由8条反平行的β-折叠形成两个正交的β片层堆积群，与1个α螺旋共同形成β折叠桶状结构，β折叠桶的开口端由连接β条带的环组成。视黄醇的β-紫罗酮环深深插入洞中，异戊二烯尾端伸出桶表面，桶内与配体相互作用的残基主要由疏水氨基酸组成。这些疏水氨基酸主要来自β桶周围的7段发夹结构[3]，这个β桶是完全刚性的，可以禁止结合的视黄醇在其环形区的修饰。相反，β桶的入口是整个分子相当柔韧的部分，可通过显著的构象变化，由未结合配体的RBP转变成为结合配体的RBP。视黄醇羟基的修饰不影响其与RBP的亲和性，但视黄醇环上的修饰则导致其与RBP亲和性的丧失，这也说明视黄醇与RBP主要靠疏水相互作用来维持视黄醇-RBP复合物的稳定性，而不是依靠羟基。
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三、 RBP的分子相互作用
RBP的分子相互作用包括三个方面：(1)与ROH结合，在血浆中转运ROH至靶组织，将ROH从肝储备区转运至肝外组织。(2)与TTR以1∶1的比例结合，增加holo-RBP稳定性，并防止小分子的RBP从肾脏滤过[4]；另一方面，实验证明，视黄醇的存在对复合物的稳定性也是至关重要的[5]。(3)与Vit A依赖细胞的表面受体结合[6]，协助Vit A的摄入。在靶组织表面存在着膜受体，介导holo-RBP释放的视黄醇进入细胞。当RBP-视黄醇结合到膜受体上后，RBP构象改变，与TTR及膜受体的亲和力下降，促使视黄醇从RBP结合位点释放，而结合到膜受体上，CRBP则在细胞膜内与受体作用，接受此视黄醇分子，CRBP再发生构象变化，视黄醇-CRBP复合物从膜上分离。这也说明了，视黄醇转运进细胞的过程是蛋白质的相互作用过程。RBP的这种转运VitA的机制可作为研究许多天然疏水小分子物质转运过程中蛋白质-蛋白质相互作用的模型[7]。
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四、 RBP的临床意义
VitA的储存、代谢必须依靠RBP的协助，否则体内VitA的吸收、储存、转运等环节将会改变，引起组织中VitA的分布不均，进而引发各种疾病，如夜盲症、结膜干燥症[8]，及影响上皮组织、骨组织的生长、分化与繁殖、胚胎发育等。一旦RBP基因发生突变，引起氨基酸改变，则不但会引起体内RBP含量降至极低(<0.6mmol/L)，而且诱发体内VitA的含量降低，引起夜盲症等[9]。
RBP半衰期短(12h)，生物特异性高，许多临床疾病都能影响RBP微循环量，所以血浆RBP经常作为临床营养状况评价的指标。无论是蛋白质还是热量供应不足，都可使RBP下降，当给予蛋白质-热能营养不良(PCM)病人营养支持时，RBP的恢复速度比白蛋白快。肥胖的健康者接受饥饿饮食后，RBP的变化要比转铁蛋白快得多，所以RBP更能灵敏地反映蛋白质营养状况的早期变化。
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对于危险工作环境中作业的工人，一个重要的监测指标就是尿中RBP。如果尿中RBP含量增高，而肾小管中RBP下降，则说明工作环境中的有害物质含量增多[10]。慢性肾病的RBP和 VitA 水平升高，TTR水平正常，其它肾脏疾病则引起RBP水平降低。另外，严重肝病(包括肝癌)、甲状腺功能亢进、维生素A缺乏，可使血浆RBP和TTR水平降低，所以，RBP的变化既反映蛋白质-热能营养不良，又可反映相应疾病。
五、结语
RBP在视黄醇转运中起着重要作用，近年来，有关RBP的化学结构、基因结构及其表达的研究进展迅速，都将为其它疏水配体结合蛋白研究建立良好的模型。
国家自然科学基金资助课题(39770645)
参考文献
1，Blomhoff R, Green MH, Berg T, et al. Transport and storage of vitamin A.Science,1990,250∶399～404.
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2，Helen MN, Newcomer ME. The structure of human retinol-binding protein(RBP)with its carrier protein transthyretin reveals an interaction with the carboxy terminus of RBP. Biochemistry,1999,38∶2647～2653.
3，Zanotti G, Berni R, Monaca HL. Crystal structure of liganded and unliganded forms of bovine plasma retinol-binding protein. J Biol Chem,1993,268∶10728～10738.
4，金宏.视黄醇转运的分子机制.生理科学进展，1997，2：166～168.
, 百拇医药
5，Noy N, Slosberg E, Scarlata S. Interactions of retinol with binding proteins: studies with retinol-binding protein and with transthyretin. Biochemistry, 1992,31∶11118～11124.
6，Sommer A. Nutritional blindness: xerophthalmia and keratomalacia. In: W Tasman,EA Jaeger, eds. Duanes's Clinical Ophthalmology. Revised ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers,1996,1～10.
7，Monaco HL, Rizzi M, Coda A. Structure of a complex of two plasma protein:transthyretin and retinol-binding protein. Science,1995,268∶1039～1041.
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8，Seeliger MW,Biesalski HK,Wissinger B,et al.Phenotype in retinol deficiency due to a hereditary defect in retinol binding protein synthesis.Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40∶3～11.
9，Biesalski HK,Frank J,Beck SC,et al.Biochemical but not clinical vitamin A deficiency results from mutations in the gene for retinol binding protein.Am J Clin Nutr,1999,69∶931～936.
10，Verplanke AJ, Leummens MH, Herber RF. Occupational exposure to tetrachloroethene and its effects on the kidneys. J Occup Environ Med,1999,41∶11～16., http://www.100md.com
单位：梁学颖(北京放射医学研究所，北京 100850)；徐琪寿(北京放射医学研究所，北京 100850)
关键词：视黄醇结合蛋白；基因；构效关系；视黄醇
生理科学进展000322 摘要 视黄醇结合蛋白(RBP)是维生素A(Vit A)的运载蛋白，结构上为疏水小分子结合蛋白家族的成员。视黄醇结合蛋白在肝脏中合成并释放入血液后，通过与视黄醇(ROH)、甲状腺素运载蛋白(TTR)及细胞表面受体相互作用，在VitA 的储存、代谢、转运到周围靶器官中发挥重要功能。本文从基因结构与表达、构效关系及临床意义等方面介绍了视黄醇结合蛋白的分子生物学。
学科分类号 R151.2
视黄醇结合蛋白(retinol binding protein, RBP)是体内将VitA 从肝中转运至靶组织的特异的运载蛋白，在协助VitA发挥生理功能中起着不可替代的作用[1]。自从1968年Kanai等首次分离发现RBP后，在人和大鼠中对其进行了广泛研究。本文主要对 RBP 的基因结构与表达、结构与功能、与视黄醇生化代谢的关系、临床意义等方面进行综述。
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一、RBP的基因结构及表达
人RBP基因约10kb，含6个外显子和5个内含子，外显子较短，内含子大小变化很大。基因的旁侧序列至少包括3个不同的控制元件，即(1)一个非组织特异性增强子——能够在一些不同的细胞系中激活的启动子；(2)一个负性顺式激活元件——可能结合阻抑蛋白； (3)启动子元件。这些控制元件如何相互作用，共同调节 RBP 基因表达仍不十分清楚，需进一步研究。RBP的cDNA序列含有一段51个碱基的短5'-非翻译区(5'UTR)和一个负责编码200个氨基酸的从51～651核苷酸的开放阅读框(包括RBP信号肽序列)。而从核苷酸序列推导的氨基酸序列显示RBP含有一条16个氨基酸的信号肽，因此，人RBP最初合成时是一条有184个氨基酸残基的多肽链。
基因构成与蛋白质结构的对比显示，所有最后翻译的外显子的转录与不连续的RBP的结构单元紧密一致，剪切连接发生在 RBP 分子表面残基。所有内含子，除内含子4外，都落在β链结构的边缘。参与结合视黄醇的15个氨基酸残基，由外显子3、4、5分别编码6、5、4个结合残基。氨基酸序列存在两个内在高同源性序列区域(36～86和96～141),推测由部分基因复制所致，但在核酸序列水平则几乎没有同源性。
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RBP 的 mRNA存在于肝、肾、肺、脾、脑、心和骨骼肌等许多组织中，以肝中含量最高。RBP 主要在肝脏中合成并释放入血液，其分泌受到视黄醇的刺激；肾脏合成 RBP有助于视黄醇的再循环利用；卵黄囊中 RBP分泌与肝脏中一样，受到视黄醇摄入量的调控，卵黄囊合成分泌 RBP可能有助于将视黄醇从母体运至发育中的胚胎，同时说明视黄醇类物质是胚胎发育所必需的。
二、 RBP结构与功能的关系(构象分析)
根据序列同源性可将介导VitA转运及行使功能的蛋白分成五类：Ⅰ 分泌型视黄醇结合蛋白、Ⅱ 细胞内视黄醇结合蛋白、Ⅲ 视黄酸的核受体、Ⅳ 视觉组织特异性的细胞外视黄醇结合蛋白、Ⅴ 视觉组织特异性的细胞内视黄醇结合蛋白。Ⅰ、Ⅱ类视黄醇结合蛋白的X-线衍射结构已经研究清楚，主要有Ⅰ类血浆视黄醇结合蛋白(RBP)、附睾视黄酸结合蛋白(E-RABP),和Ⅱ类细胞内视黄醇结合蛋白(Ⅰ)、(Ⅱ)(CRBP(I)、CRBP(II))。其中，Ⅰ类蛋白中血浆视黄醇结合蛋白(RBP)是将 VitA 及其衍生物从肝脏中转运至靶组织的特异蛋白。主要分析Ⅰ类RBP的结构与功能关系。
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RBP 在肝细胞中合成，受到视黄醇刺激后分泌出来，特异性地结合全反式视黄醇，到达血液中后，又与甲状腺素运载蛋白(transthyretin， TTR)形成复合物，从而防止低分子量的RBP被肾小球滤过。需要说明的是：无论VitA将以醇、醛还是酸的形式被利用，只有全反式视黄醇才能刺激RBP的分泌[2]。
RBP为一种单一肽链的蛋白质，分子量约21 000，含有184个氨基酸残基和3个二硫键，有一个位点结合一分子的全反式视黄醇。对holo-RBP(结合视黄醇的RBP)晶体结构的研究表明，整个分子由N-末端环、β片层结构核心、α螺旋和C-末端环组成，在空间中以单一的直径4nm的球状结构域的形式存在，似一个洞穴。由8条反平行的β-折叠形成两个正交的β片层堆积群，与1个α螺旋共同形成β折叠桶状结构，β折叠桶的开口端由连接β条带的环组成。视黄醇的β-紫罗酮环深深插入洞中，异戊二烯尾端伸出桶表面，桶内与配体相互作用的残基主要由疏水氨基酸组成。这些疏水氨基酸主要来自β桶周围的7段发夹结构[3]，这个β桶是完全刚性的，可以禁止结合的视黄醇在其环形区的修饰。相反，β桶的入口是整个分子相当柔韧的部分，可通过显著的构象变化，由未结合配体的RBP转变成为结合配体的RBP。视黄醇羟基的修饰不影响其与RBP的亲和性，但视黄醇环上的修饰则导致其与RBP亲和性的丧失，这也说明视黄醇与RBP主要靠疏水相互作用来维持视黄醇-RBP复合物的稳定性，而不是依靠羟基。
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三、 RBP的分子相互作用
RBP的分子相互作用包括三个方面：(1)与ROH结合，在血浆中转运ROH至靶组织，将ROH从肝储备区转运至肝外组织。(2)与TTR以1∶1的比例结合，增加holo-RBP稳定性，并防止小分子的RBP从肾脏滤过[4]；另一方面，实验证明，视黄醇的存在对复合物的稳定性也是至关重要的[5]。(3)与Vit A依赖细胞的表面受体结合[6]，协助Vit A的摄入。在靶组织表面存在着膜受体，介导holo-RBP释放的视黄醇进入细胞。当RBP-视黄醇结合到膜受体上后，RBP构象改变，与TTR及膜受体的亲和力下降，促使视黄醇从RBP结合位点释放，而结合到膜受体上，CRBP则在细胞膜内与受体作用，接受此视黄醇分子，CRBP再发生构象变化，视黄醇-CRBP复合物从膜上分离。这也说明了，视黄醇转运进细胞的过程是蛋白质的相互作用过程。RBP的这种转运VitA的机制可作为研究许多天然疏水小分子物质转运过程中蛋白质-蛋白质相互作用的模型[7]。
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四、 RBP的临床意义
VitA的储存、代谢必须依靠RBP的协助，否则体内VitA的吸收、储存、转运等环节将会改变，引起组织中VitA的分布不均，进而引发各种疾病，如夜盲症、结膜干燥症[8]，及影响上皮组织、骨组织的生长、分化与繁殖、胚胎发育等。一旦RBP基因发生突变，引起氨基酸改变，则不但会引起体内RBP含量降至极低(<0.6mmol/L)，而且诱发体内VitA的含量降低，引起夜盲症等[9]。
RBP半衰期短(12h)，生物特异性高，许多临床疾病都能影响RBP微循环量，所以血浆RBP经常作为临床营养状况评价的指标。无论是蛋白质还是热量供应不足，都可使RBP下降，当给予蛋白质-热能营养不良(PCM)病人营养支持时，RBP的恢复速度比白蛋白快。肥胖的健康者接受饥饿饮食后，RBP的变化要比转铁蛋白快得多，所以RBP更能灵敏地反映蛋白质营养状况的早期变化。
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对于危险工作环境中作业的工人，一个重要的监测指标就是尿中RBP。如果尿中RBP含量增高，而肾小管中RBP下降，则说明工作环境中的有害物质含量增多[10]。慢性肾病的RBP和 VitA 水平升高，TTR水平正常，其它肾脏疾病则引起RBP水平降低。另外，严重肝病(包括肝癌)、甲状腺功能亢进、维生素A缺乏，可使血浆RBP和TTR水平降低，所以，RBP的变化既反映蛋白质-热能营养不良，又可反映相应疾病。
五、结语
RBP在视黄醇转运中起着重要作用，近年来，有关RBP的化学结构、基因结构及其表达的研究进展迅速，都将为其它疏水配体结合蛋白研究建立良好的模型。
国家自然科学基金资助课题(39770645)
参考文献
1，Blomhoff R, Green MH, Berg T, et al. Transport and storage of vitamin A.Science,1990,250∶399～404.
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2，Helen MN, Newcomer ME. The structure of human retinol-binding protein(RBP)with its carrier protein transthyretin reveals an interaction with the carboxy terminus of RBP. Biochemistry,1999,38∶2647～2653.
3，Zanotti G, Berni R, Monaca HL. Crystal structure of liganded and unliganded forms of bovine plasma retinol-binding protein. J Biol Chem,1993,268∶10728～10738.
4，金宏.视黄醇转运的分子机制.生理科学进展，1997，2：166～168.
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5，Noy N, Slosberg E, Scarlata S. Interactions of retinol with binding proteins: studies with retinol-binding protein and with transthyretin. Biochemistry, 1992,31∶11118～11124.
6，Sommer A. Nutritional blindness: xerophthalmia and keratomalacia. In: W Tasman,EA Jaeger, eds. Duanes's Clinical Ophthalmology. Revised ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers,1996,1～10.
7，Monaco HL, Rizzi M, Coda A. Structure of a complex of two plasma protein:transthyretin and retinol-binding protein. Science,1995,268∶1039～1041.
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9，Biesalski HK,Frank J,Beck SC,et al.Biochemical but not clinical vitamin A deficiency results from mutations in the gene for retinol binding protein.Am J Clin Nutr,1999,69∶931～936.
10，Verplanke AJ, Leummens MH, Herber RF. Occupational exposure to tetrachloroethene and its effects on the kidneys. J Occup Environ Med,1999,41∶11～16., http://www.100md.com