雌、孕激素在癫痫发病中的作用及其机制研究
作者：王群
单位：王群(同济医科大学附属同济医院神经内科,武汉 430030)(现在北京天坛医院神经内科 (北京 100050))
关键词：雌激素；孕激素；癫痫；即刻早期基因；氨基酸类神经递质
生理科学进展000309摘要 临床资料显示，某些女性癫痫患者体内雌、孕激素的周期性变化可能影响癫痫发作的易感性。为了探索雌、孕激素在癫痫发病中的作用，阐明其作用机制，本工作分别以马桑内酯(CL)侧脑室注射致痫、贝美格(Be)腹腔注射致痫大鼠为实验对象，采用神经电生理、流式细胞免疫荧光、高效液相色谱、免疫细胞化学、原位杂交技术，从整体、行为、细胞、分子以及基因水平研究了雌、孕激素对大鼠中枢神经系统(CNS)功能的影响。研究结果表明，卵巢甾体激素属于神经甾体激素，其作为新的神经调质对CNS具有广泛的影响，它们分别通过调节即刻早期基因、氨基酸类神经递质及神经递质受体而多环节影响CNS的兴奋性。
, 百拇医药
学科分类号 R742.1
The Roles of Estrogen and Progestin in Epileptogenesis and Their Mechanisms of Action
WANG Qun
(Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract Clinical data showed that periodic alterations of estrogen and progestin in some women patients with catamenial epilepsy might affect seizure susceptibility. In the present study,in order to explore the roles of estrogen and progestin in epilepsy and elucidate their mechanisms of action, we utilized animal seizure models induced by intracerebroventricular(i.c.v) coriaria lactone(CL) and intraperitoneal(i.p) bemegride(Be)， studied the effects of estrogen and progestin on central nervous system(CNS) functions in behavior,electrophysiological,cellular,molecular and gene levels by means of neuroelectrophysiology, flow cytometry, high performance liquid chromatography, immunocytochemical and in situ hybridization techniques. From our observation we concluded that ovarian hormones are neuroactive steroids and new neuromodulaters, they could affect the excitability of CNS by regulating immediate early genes, amino acid neurotransmitters and N-methyl-D-aspartate receptor(NMDAR).
, 百拇医药
Key words Estrogen; Progestin; Epilepsy; Immediate early gene; Amino acid transmitter
临床资料显示，某些女性癫痫患者在月经期痫性发作次数增多，月经周期晚期减少，提示痫性发作可能与体内性激素周期性变化有关。以经期性癫痫妇女为研究对象，发现孕酮/雌二醇比率明显减低，提示孕激素减少或雌激素增多与经期性癫痫相关，卵巢激素的周期性变化可能影响癫痫发作的易感性[1]。当前，神经甾体激素作为新的神经调质对神经系统产生广泛的影响，已成为神经科学研究的又一热点[2]。雌、孕激素为小分子脂溶性甾体激素，易于透过血脑屏障，进入脑后对脑的结构和功能产生影响，已经证明中枢神经系统(CNS)存在雌、孕激素受体及其mRNA[3，4]。本工作以马桑内酯侧脑室注射致痫、贝美格腹腔注射致痫大鼠为实验对象，从整体、行为、细胞、分子及基因水平研究了雌、孕激素对大鼠CNS功能的影响，旨在探索雌、孕激素在癫痫发病中的作用，找出其药理学特点，并较深入地阐明其作用机制。
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一、雌、孕激素对马桑内酯致痫大鼠行为及皮层、海马脑电图的影响
皮层、海马是CNS内对癫痫最敏感的脑区，人们常选择其作为研究癫痫的靶区。为了解卵巢激素在癫痫发作中所起的作用，我们首先采用记录脑电图(EEG)同时观察行为的方法，观察了雌二醇(E2)、孕酮(P)对马桑内酯(CL)致痫大鼠行为及皮层、海马EEG的影响。结果显示:E2能缩短CL致痫大鼠痫性发作及痫波发放的潜伏期,增加痫波发放频率。与之相反，P具有明显的镇静催眠作用，并延长痫性发作及痫波发放潜伏期，减轻痫性发作程度，减少痫波发放次数。 此为雌激素的致痫及孕激素的抗痫作用提供了行为及电生理学证据。
二、雌、孕激素对马桑内酯致痫大鼠大脑皮层、海马FOS蛋白表达的影响
c-fos癌基因表达法作为一种反映神经细胞功能活动的方法被广泛采用。在各种化学和电剌激所造成的癫痫活动中，其表达显著，表明与惊厥活动有密切关系[5]。 我们采用流式细胞免疫荧光技术对CL致痫及分别给予E2、P后再致痫大鼠大脑皮层、海马细胞FOS蛋白表达进行了定量检测。结果显示：CL致痫组大鼠大脑皮层、海马FOS表达的荧光指数(FI)和阳性细胞数较正常对照组明显增高(P<0.01)；给予E2后再致痫组皮层、海马FOS表达较单纯CL致痫组增加(P<0.05,P<0.01);给予P后再致痫组FOS表达较单纯CL致痫组减少(P<0.01,P<0.05)。由于c-fos基因或FOS 蛋白可作为神经元兴奋的标志物,提示雌、孕激素分别增强及降低皮层、海马神经细胞的兴奋性，此为雌激素的致痫、孕激素的抗痫作用提供了细胞水平的实验依据。
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三、马桑内酯致痫大鼠大脑皮层、海马谷氨酸、门冬氨酸、 甘氨酸及γ-氨基丁酸含量的测定及雌、孕激素的影响
谷氨酸(Glu)、门冬氨酸(Asp)是脑内主要的兴奋性氨基酸,甘氨酸(Gly)、 γ-氨基丁酸(GABA)是主要的抑制性氨基酸。一般认为，惊厥和癫痫的发生与CNS内抑制性氨基酸神经递质功能降低，兴奋性氨基酸神经递质功能增高有关[6]。为了探讨雌激素致痫、孕激素抗痫作用的机制， 我们采用高效液相色谱仪(HPLC)结合紫外分光检测器分析检测了CL致痫大鼠大脑皮层、海马Glu、Asp、Gly、GABA的含量变化及雌、孕激素对它们的影响，目的是了解雌、孕激素的致痫、抗痫作用是否涉及了兴奋性和抑制性氨基酸类递质系统。 结果显示：CL致痫组与正常对照组相比,Glu、Asp、Gly含量增加(P<0.01,P<0.05),GABA 水平无显著性变化(P>0.05)。给予E2后致痫组与单纯CL致痫组相比,Glu、Asp 含量增加(P<0.01,P<0.05),GABA减少(P<0.01)。给予P后致痫组与单纯CL致痫组相比,GABA 含量增加,Glu减少(P均<0.01)。这些结果提示兴奋性和抑制性氨基酸可能参与了惊厥后神经元损伤，雌、孕激素的致痫、抗痫作用涉及了谷氨酸和GABA能递质系统。
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四、雌、孕激素对贝美格致痫大鼠大脑皮层、海马Glu和GABA免疫反应细胞的影响
GABA和Glu是脑内一对重要的抑制性和兴奋性神经递质，二者的平衡失调与癫痫发作密切相关。已经证明GABA和Glu可以共存于大脑皮层和海马细胞。为了进一步阐明雌、 孕激素的作用机制，我们采用免疫细胞化学双PAP法，观察了E2、 P对贝美格(Bemegride,Be)腹腔致痫大鼠顶叶大脑皮层、海马CA1、CA3、齿状回Glu和GABA免疫反应细胞的影响。图像分析结果显示：Be致痫组皮层、海马Glu免疫反应平均阳性细胞数及光密度较正常组明显增加(P<0.01);GABA细胞数及光密度减少(P<0.01)。与单纯Be致痫组相比,给予E2后Be致痫大鼠大脑皮层、海马Glu阳性细胞数目增多、密度增高(P<0.01)，GABA阳性细胞数目减少、密度降低(P<0.05,P<0.01)；而给予P后致痫组GABA阳性细胞数目增多、密度增高(P<0.01),Glu阳性细胞数目减少、密度减低(P<0.01)。 提示雌、孕激素的致痫、抗痫作用与其调节脑内GABA能神经和Glu能神经系统的功能有关。
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五、雌、孕激素对大鼠大脑皮层、海马NMDA受体亚单位1(NMDAR1)mRNA表达的影响
NMDA受体(NMDAR)介导兴奋性氨基酸激发钙离子细胞内流，调节着兴奋性突触传递和发育过程中突触可塑性[7]。NMDA受体与惊厥及癫痫易感性的形成密切有关。对NMDAR基因克隆研究发现，NMDAR是NMDAR1和NMDAR2组成的异聚体，其中NMDAR1亚基在构成功能性NMDAR中起着主要作用，是该受体的功能单位。杏仁核点燃过程中NMDAR1 mRNA 表达持续增加,说明NMDAR1亚单位表达的上调参与癫痫易感性的形成[8]。为了更深入探讨雌、孕激素对CNS作用的分子机制,我们采用原位杂交技术,研究了雌、孕激素对大鼠大脑皮层、海马NMDAR1亚单位mRNA表达的影响。 结果显示：给予E2后大鼠顶叶大脑皮层及海马GA1、CA3、齿状回NMDR1mRNA水平显著高于生理盐水对照组(P<0.01); 给予P后大脑皮层及海马各区NMDAR1mRNA水平与生理盐水对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。本实验表明雌激素上调脑组织内NMDAR1亚单位的mRNA水平,使惊厥易感性增加,此可能是雌激素致痫作用的分子机制之一。而孕激素的抗痫作用与调节NMDAR1 mRNA 的表达没有明显关系。
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以上研究结果表明，卵巢甾体激素对CNS具有广泛的影响，雌、孕激素分别具有致痫和抗痫作用，它们分别通过调节即刻早期基因、 氨基酸类神经递质及神经递质受体而多环节影响CNS的兴奋性。此为临床上经期性癫痫的发生建立了理论基础，并为经期性癫痫的防治途径指出了方向。
国家自然科学基金重点项目资助课题(39330210)
王群，男，神经病学专业。导师：阮旭中教授。论文答辩日期：1997年5月12日，答辩委员会主席：董为伟教授。
参考文献
1，Herzog AG.Hormonal changes in epilepsy.Epilepsia,1995,36∶323～338.
2，Mellon SH.Neurosteroids: biochemistry, modes of action, and clinical relevance.JCEM,1994，78∶1003～1012.
, http://www.100md.com
3，O'Keefe JA, Yanbing I, Burgess LH,et al.Estrogen receptor mRNA alterations in the developing rat hippocampus.Mol Brain Res,1995, 30∶115～122.
4，Hagihara k, Hirata S,Osada T,et al. Distributing of cells containing progesterone receptor mRNA in the female rat and telencephalon: an in situ hybridization study. Mol Brain Res, 1992,14∶239～246.
5，Kiessling M,Gass P.Immediate early gene expression in experimental epilepsy. ，Brain Pathol,1993,3∶381～387.
, 百拇医药
6，Meldrum BS.Neurotransmission in epilepsy.Epilepsia,1995,36(suppl. 1)∶S30～38.
7，McBain CJ,Mayer ML.NMDA receptor structure and function. Physiol Rev,1994,74∶723～738.
8，Kikuchi S,Jwase M,Inagaki N,et al.Alterations in NMDA receptor subunit mRNA expression levels in cerebral cortex in kindling-induced epileptogenesis. Epilepsia, 1996,37(Suppl.3)∶113～118., 百拇医药
单位：王群(同济医科大学附属同济医院神经内科,武汉 430030)(现在北京天坛医院神经内科 (北京 100050))
关键词：雌激素；孕激素；癫痫；即刻早期基因；氨基酸类神经递质
生理科学进展000309摘要 临床资料显示，某些女性癫痫患者体内雌、孕激素的周期性变化可能影响癫痫发作的易感性。为了探索雌、孕激素在癫痫发病中的作用，阐明其作用机制，本工作分别以马桑内酯(CL)侧脑室注射致痫、贝美格(Be)腹腔注射致痫大鼠为实验对象，采用神经电生理、流式细胞免疫荧光、高效液相色谱、免疫细胞化学、原位杂交技术，从整体、行为、细胞、分子以及基因水平研究了雌、孕激素对大鼠中枢神经系统(CNS)功能的影响。研究结果表明，卵巢甾体激素属于神经甾体激素，其作为新的神经调质对CNS具有广泛的影响，它们分别通过调节即刻早期基因、氨基酸类神经递质及神经递质受体而多环节影响CNS的兴奋性。
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学科分类号 R742.1
The Roles of Estrogen and Progestin in Epileptogenesis and Their Mechanisms of Action
WANG Qun
(Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Abstract Clinical data showed that periodic alterations of estrogen and progestin in some women patients with catamenial epilepsy might affect seizure susceptibility. In the present study,in order to explore the roles of estrogen and progestin in epilepsy and elucidate their mechanisms of action, we utilized animal seizure models induced by intracerebroventricular(i.c.v) coriaria lactone(CL) and intraperitoneal(i.p) bemegride(Be)， studied the effects of estrogen and progestin on central nervous system(CNS) functions in behavior,electrophysiological,cellular,molecular and gene levels by means of neuroelectrophysiology, flow cytometry, high performance liquid chromatography, immunocytochemical and in situ hybridization techniques. From our observation we concluded that ovarian hormones are neuroactive steroids and new neuromodulaters, they could affect the excitability of CNS by regulating immediate early genes, amino acid neurotransmitters and N-methyl-D-aspartate receptor(NMDAR).
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Key words Estrogen; Progestin; Epilepsy; Immediate early gene; Amino acid transmitter
临床资料显示，某些女性癫痫患者在月经期痫性发作次数增多，月经周期晚期减少，提示痫性发作可能与体内性激素周期性变化有关。以经期性癫痫妇女为研究对象，发现孕酮/雌二醇比率明显减低，提示孕激素减少或雌激素增多与经期性癫痫相关，卵巢激素的周期性变化可能影响癫痫发作的易感性[1]。当前，神经甾体激素作为新的神经调质对神经系统产生广泛的影响，已成为神经科学研究的又一热点[2]。雌、孕激素为小分子脂溶性甾体激素，易于透过血脑屏障，进入脑后对脑的结构和功能产生影响，已经证明中枢神经系统(CNS)存在雌、孕激素受体及其mRNA[3，4]。本工作以马桑内酯侧脑室注射致痫、贝美格腹腔注射致痫大鼠为实验对象，从整体、行为、细胞、分子及基因水平研究了雌、孕激素对大鼠CNS功能的影响，旨在探索雌、孕激素在癫痫发病中的作用，找出其药理学特点，并较深入地阐明其作用机制。
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一、雌、孕激素对马桑内酯致痫大鼠行为及皮层、海马脑电图的影响
皮层、海马是CNS内对癫痫最敏感的脑区，人们常选择其作为研究癫痫的靶区。为了解卵巢激素在癫痫发作中所起的作用，我们首先采用记录脑电图(EEG)同时观察行为的方法，观察了雌二醇(E2)、孕酮(P)对马桑内酯(CL)致痫大鼠行为及皮层、海马EEG的影响。结果显示:E2能缩短CL致痫大鼠痫性发作及痫波发放的潜伏期,增加痫波发放频率。与之相反，P具有明显的镇静催眠作用，并延长痫性发作及痫波发放潜伏期，减轻痫性发作程度，减少痫波发放次数。 此为雌激素的致痫及孕激素的抗痫作用提供了行为及电生理学证据。
二、雌、孕激素对马桑内酯致痫大鼠大脑皮层、海马FOS蛋白表达的影响
c-fos癌基因表达法作为一种反映神经细胞功能活动的方法被广泛采用。在各种化学和电剌激所造成的癫痫活动中，其表达显著，表明与惊厥活动有密切关系[5]。 我们采用流式细胞免疫荧光技术对CL致痫及分别给予E2、P后再致痫大鼠大脑皮层、海马细胞FOS蛋白表达进行了定量检测。结果显示：CL致痫组大鼠大脑皮层、海马FOS表达的荧光指数(FI)和阳性细胞数较正常对照组明显增高(P<0.01)；给予E2后再致痫组皮层、海马FOS表达较单纯CL致痫组增加(P<0.05,P<0.01);给予P后再致痫组FOS表达较单纯CL致痫组减少(P<0.01,P<0.05)。由于c-fos基因或FOS 蛋白可作为神经元兴奋的标志物,提示雌、孕激素分别增强及降低皮层、海马神经细胞的兴奋性，此为雌激素的致痫、孕激素的抗痫作用提供了细胞水平的实验依据。
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三、马桑内酯致痫大鼠大脑皮层、海马谷氨酸、门冬氨酸、 甘氨酸及γ-氨基丁酸含量的测定及雌、孕激素的影响
谷氨酸(Glu)、门冬氨酸(Asp)是脑内主要的兴奋性氨基酸,甘氨酸(Gly)、 γ-氨基丁酸(GABA)是主要的抑制性氨基酸。一般认为，惊厥和癫痫的发生与CNS内抑制性氨基酸神经递质功能降低，兴奋性氨基酸神经递质功能增高有关[6]。为了探讨雌激素致痫、孕激素抗痫作用的机制， 我们采用高效液相色谱仪(HPLC)结合紫外分光检测器分析检测了CL致痫大鼠大脑皮层、海马Glu、Asp、Gly、GABA的含量变化及雌、孕激素对它们的影响，目的是了解雌、孕激素的致痫、抗痫作用是否涉及了兴奋性和抑制性氨基酸类递质系统。 结果显示：CL致痫组与正常对照组相比,Glu、Asp、Gly含量增加(P<0.01,P<0.05),GABA 水平无显著性变化(P>0.05)。给予E2后致痫组与单纯CL致痫组相比,Glu、Asp 含量增加(P<0.01,P<0.05),GABA减少(P<0.01)。给予P后致痫组与单纯CL致痫组相比,GABA 含量增加,Glu减少(P均<0.01)。这些结果提示兴奋性和抑制性氨基酸可能参与了惊厥后神经元损伤，雌、孕激素的致痫、抗痫作用涉及了谷氨酸和GABA能递质系统。
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四、雌、孕激素对贝美格致痫大鼠大脑皮层、海马Glu和GABA免疫反应细胞的影响
GABA和Glu是脑内一对重要的抑制性和兴奋性神经递质，二者的平衡失调与癫痫发作密切相关。已经证明GABA和Glu可以共存于大脑皮层和海马细胞。为了进一步阐明雌、 孕激素的作用机制，我们采用免疫细胞化学双PAP法，观察了E2、 P对贝美格(Bemegride,Be)腹腔致痫大鼠顶叶大脑皮层、海马CA1、CA3、齿状回Glu和GABA免疫反应细胞的影响。图像分析结果显示：Be致痫组皮层、海马Glu免疫反应平均阳性细胞数及光密度较正常组明显增加(P<0.01);GABA细胞数及光密度减少(P<0.01)。与单纯Be致痫组相比,给予E2后Be致痫大鼠大脑皮层、海马Glu阳性细胞数目增多、密度增高(P<0.01)，GABA阳性细胞数目减少、密度降低(P<0.05,P<0.01)；而给予P后致痫组GABA阳性细胞数目增多、密度增高(P<0.01),Glu阳性细胞数目减少、密度减低(P<0.01)。 提示雌、孕激素的致痫、抗痫作用与其调节脑内GABA能神经和Glu能神经系统的功能有关。
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五、雌、孕激素对大鼠大脑皮层、海马NMDA受体亚单位1(NMDAR1)mRNA表达的影响
NMDA受体(NMDAR)介导兴奋性氨基酸激发钙离子细胞内流，调节着兴奋性突触传递和发育过程中突触可塑性[7]。NMDA受体与惊厥及癫痫易感性的形成密切有关。对NMDAR基因克隆研究发现，NMDAR是NMDAR1和NMDAR2组成的异聚体，其中NMDAR1亚基在构成功能性NMDAR中起着主要作用，是该受体的功能单位。杏仁核点燃过程中NMDAR1 mRNA 表达持续增加,说明NMDAR1亚单位表达的上调参与癫痫易感性的形成[8]。为了更深入探讨雌、孕激素对CNS作用的分子机制,我们采用原位杂交技术,研究了雌、孕激素对大鼠大脑皮层、海马NMDAR1亚单位mRNA表达的影响。 结果显示：给予E2后大鼠顶叶大脑皮层及海马GA1、CA3、齿状回NMDR1mRNA水平显著高于生理盐水对照组(P<0.01); 给予P后大脑皮层及海马各区NMDAR1mRNA水平与生理盐水对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。本实验表明雌激素上调脑组织内NMDAR1亚单位的mRNA水平,使惊厥易感性增加,此可能是雌激素致痫作用的分子机制之一。而孕激素的抗痫作用与调节NMDAR1 mRNA 的表达没有明显关系。
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以上研究结果表明，卵巢甾体激素对CNS具有广泛的影响，雌、孕激素分别具有致痫和抗痫作用，它们分别通过调节即刻早期基因、 氨基酸类神经递质及神经递质受体而多环节影响CNS的兴奋性。此为临床上经期性癫痫的发生建立了理论基础，并为经期性癫痫的防治途径指出了方向。
国家自然科学基金重点项目资助课题(39330210)
王群，男，神经病学专业。导师：阮旭中教授。论文答辩日期：1997年5月12日，答辩委员会主席：董为伟教授。
参考文献
1，Herzog AG.Hormonal changes in epilepsy.Epilepsia,1995,36∶323～338.
2，Mellon SH.Neurosteroids: biochemistry, modes of action, and clinical relevance.JCEM,1994，78∶1003～1012.
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3，O'Keefe JA, Yanbing I, Burgess LH,et al.Estrogen receptor mRNA alterations in the developing rat hippocampus.Mol Brain Res,1995, 30∶115～122.
4，Hagihara k, Hirata S,Osada T,et al. Distributing of cells containing progesterone receptor mRNA in the female rat and telencephalon: an in situ hybridization study. Mol Brain Res, 1992,14∶239～246.
5，Kiessling M,Gass P.Immediate early gene expression in experimental epilepsy. ，Brain Pathol,1993,3∶381～387.
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6，Meldrum BS.Neurotransmission in epilepsy.Epilepsia,1995,36(suppl. 1)∶S30～38.
7，McBain CJ,Mayer ML.NMDA receptor structure and function. Physiol Rev,1994,74∶723～738.
8，Kikuchi S,Jwase M,Inagaki N,et al.Alterations in NMDA receptor subunit mRNA expression levels in cerebral cortex in kindling-induced epileptogenesis. Epilepsia, 1996,37(Suppl.3)∶113～118., 百拇医药