中枢甘氨酸受体分子特性的研究
作者：徐天乐
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一、GlyR在CNS中的分布
二、GlyR的分子结构
(一)亚单位结构
(二)受体组装和表达
(三)配体结合
(四)通道孔区
(五)通道激活
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(六)磷酸化
三、GlyR分子病
(一)家族性惊厥病
(二)鼠惊厥综合病
(三)肌阵挛
(四)遗传性惊厥病的生理趋同现象
四、结语
甘氨酸受体(GlyR)介导的抑制性神经传递在哺乳动物中枢神经系统(CNS)反射活动、随意运动调节和感觉信号的处理中具有重要作用[1]。GlyR五聚体由三个独立的多肽组成：两个糖蛋白(48 kD和58 kD)，分别称为α和β亚单位，另一个为93 kD的细胞质蛋白，叫“gephyrin”。GlyR与尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)、GABAA受体(GABAAR)、5-HT3受体(5-HT3R)等具有很大的同源性。它们一起形成一个配体门控离子通道(LGICs)超家族。LGICs的五个跨膜亚单位形成离子通道孔区。就GlyR而言，该离子通道选择性地通透Cl-。
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一、GlyR在CNS中的分布
GlyR在脊髓和延髓中以高水平表达，而在中脑、下丘脑和丘脑中较少，高级脑区则不表达。GlyR的这种分布模式与Gly在脊髓和脑干中作为主要的抑制性神经递质发挥作用是一致的。有趣的是，GlyR和GABAAR常常共存于脊髓神经元中[2]，提示Gly和GABA可能作为共递质(cotransmitter)，在脊髓内发挥共传递(cotransmission)作用[3，4]。
从成年大鼠脊髓中纯化的GlyR是由α1和β亚单位组成的异聚体，其比例约为α1∶β=3∶2。相反，有证据表明胚胎GlyR是由五个α2亚单位组成的同聚体。体外重组的α2同聚体与胚胎GlyR的功能特性也十分一致。另外，在大鼠脊髓中仅发现低水平的α3 mRNA，提示α3在GlyR中可能占比例较小。β亚单位单独不易形成同聚体GlyR，但能有效地与α1、α2或α3结合形成异聚体。另一方面，即使没有β亚单位，α1、α2和α3也可以形成重组GlyR。
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α1亚单位mRNA的分布与成体脊髓和脑干中3H-士的宁结合位点相似。但令人惊奇的是β亚单位mRNA以很高的数量出现在成体整体CNS中。高级脑区存在β亚单位mRNA有些让人难以理解，因为β亚单位单独不能形成有功能的GlyR。GlyR细胞内gephyrin亚单位mRNA的分布更加广泛，在大鼠CNS所有区域都有表达。尽管GlyR在成体动物的高级脑区几乎缺如，但在急性分离的和原代培养的新生大鼠海马神经元上，均已观察到由Gly诱导的电流反应。最近，Flint等[5]报道，在大鼠新皮质发育早期，非突触释放的牛磺酸可使该区的GlyR激活。由于胚胎期牛磺酸剥夺能引起皮质发育不全。因此推测牛磺酸可能通过激活非突触部位GlyR影响新皮质的发育。
在亚细胞水平，GlyR以“簇”的方式分布在细胞的表面。据推测出现在胞体和树突上的“簇”位于突触连接点上。在细胞培养过程中，gephyrin对GlyR的簇集是必需的，gephyrin可以将受体锚定于细胞骨架上。此外，最近有研究表明，在胚胎发育早期，激活GlyR产生兴奋性而非抑制性效应[6，7]，GlyR的“簇集”受到因激活甘氨酸受体而引起的电压依赖性Ca2+通道开放和由此产生的Ca2+内流的调节[7]。
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二、GlyR的分子结构
(一)亚单位结构 GlyR α和β亚单位各由420和470氨基酸残基组成(附图)。经疏水性分析，预测GlyR亚单位含一个长的N-末端细胞外区，四个跨膜结构域(称为M1-M4)和一个居M3-M4之间的大的细胞内环。这是所有LGICs结构的普遍模式。GlyR的N-末端含有至少一个潜在的N-糖基化位点(例如α1的第38位残基N)，此区域很可能存在两个双硫链环。第一个环是由Cys-138和Cys-152(α1亚单位记数)通过二硫键形成的，该环在所有LGICs中是保守的；第二个环靠近M1区，是由Cys-198和Cys-209形成的。在α和β亚单位M3和M4之间大的细胞内环起始部，有一些带正电荷的残基并包含蛋白激酶磷酸化序列。
(二)受体组装和表达 业已证明有几个氨基酸残基影响重组α亚单位的组装。首先，N38A替换可使原先Gly激活的电流消失，说明N38A GlyR无法形成，即α亚单位只能以糖基化形式组装。其次，将Cys-138或/和Cys-152突变为Ser或/和Ala，使其二硫键解链，同样不能形成有功能的GlyR，推测是阻碍了受体组装。替换环内其它残基也可产生相似的结果。例如，用Ala或Asn代替Asp-148使GlyR表达受阻。尽管较保守地替换成D148E产生的GlyR与野生型GlyR有相似的功能特性，但突变受体对士的宁的敏感性降低。由此看来，第一个环对LGICs受体的组装是必需的。第二个环可能有同样的作用。因为将Cys-198替换为Ser(C198S)阻碍GlyR组装；用一个短链残基置换环内的Tyr-202时也产生同样后果。由于Tyr-202同时还是一个重要的配体结合残基(见下文)，后一发现已引起重视。奇怪的是，当Cys替换为Ser(C209S)时，α1亚单位虽然可以在细胞表面组装，但不能结合士的宁或不产生Gly激活电流。第二个环的功能还将在下文中讨论。此外，在α1亚单位的M2结构域，以Asn、Gln或Glu替代细胞内边缘的Arg-252也防碍受体组装。
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尽管在发育早期或在体外运用重组技术产生的α同聚体具有与成体α/β异聚体相近的药理学特性，但是α和β亚单位的共表达可以大大地提高受体组装的效率。β亚单位可能是通过某种与α亚单位的相互作用的机制来影响受体的组装的。
(三)配体结合
1.激动剂和士的宁：在N端胞外结构域至少有两个分开的区域为GlyR激动剂和士的宁提供结合位点。第一个区域是通过对照人和大鼠α2亚单位的药理学特性来确定的。大鼠α2变异体α2*表现低Gly亲和力(减小97.5%)和低士的宁敏感性(减小99.8%)大鼠α2*和人α2的区别仅在于第167位残基。α2*或α2分别出现Glu-167或Gly-167是由α2基因的多态性决定的。因此，重组α2* GlyR中E167G的替换使其Gly亲和性和士的宁敏感性恢复到与α1或α2 GlyR一样的水准就不奇怪了。类似地，α1亚单位相应残基Gly-160的替换形成G160E，使GlyR对士的宁的敏感性下降。
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附图 GlyRα1亚单位模型
图中圆圈代表各种氨基酸残基，灰色条带代表细胞膜
第二个被鉴定的配体结合位点包含在第二个环内。在α1亚单位，此环是通过Cys-198和Cys-209间的二硫键形成的。当两个Cys残基中任何一个发生突变后，二硫键解链，因而改变此结构域的空间结构。C198S的置换通过破坏受体组装而使配体不能结合，而C209S产生出不能结合激动剂和士的宁的GlyR(见上文)。随后的研究进一步阐明了在此环内，标偶数的残基Lys-200、Tyr-202和Thr-204定位于Cys-198和Gly-205处假定的β转角之间，它们影响受体对激动剂和/或士的宁的敏感性。在这三个残基中，Lys-200是士的宁结合的决定因子，Thr-204决定激动剂结合。有趣的是，位于中间的Tyr-202作为激动剂和士的宁结合的“共同”残基同时还影响受体的组装(见上文)。在α1 GlyR中，通过用Phe置换(Y202F)的方法从残基芳香环中移去部分OH-，会引起Gly亲和力下降98.8%，而其对牛磺酸的亲和力和对士的宁的敏感性只有较轻的降低。用不带电荷的长链残基如Leu代替芳香环(Y202L)则对Gly亲和力没有明显影响，说明Gly可能主要是通过氢键与OH-作用与受体结合。然而，Y202L型GlyR对牛磺酸和士的宁均不敏感，说明失去芳香环的受体丧失了牛磺酸和士的宁结合能力。此外，用短链氨基酸Ala、Ser或Thr替代Tyr-202，可以阻止受体组装。由此不难看出，Gly主要与OH-，而士的宁和牛磺酸则主要与芳香环之间存在相互作用，并且受体的成功组装有赖于侧链的大小。在GlyR上，士的宁结合位点有别于激动剂结合位点，士的宁结合在Lys-200和Tyr-202上，而激动剂结合在Tyr-202和Thr-204上。
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2.印防己毒素(PTX)：在重组α/β GlyR中，PTX的敏感性与α1 GlyR比要低94.1%～
99.5%。Pribilla等(1992)发现以α1残基片段代替α/β GlyR中β亚单位的M2通道衬里区域可使其对PTX的敏感性恢复到α1的水平。胞外结构域中PTX结合区尚未被鉴定，但它的结合位点可能有别于士的宁。有意思的是，α1亚单位M2区域的胞外边缘的Arg-271的突变使PTX的作用方式从竞争性变为非竞争性。另外，这种突变可使GlyR介导的电流被低浓度PTX加强。
3.Zn2+： Laube等[8]运用α1体证明，α1亚单位N端胞外结构域中位于95～105之间(一种决定受体表达和组装的“组装盒”)或/和148～151之间的残基，对于Zn2+介导的增强Gly激动电流的作用是至关重要的。但是，这些区域似乎与高浓度Zn2+引起的电流抑制无关，推测Zn2+对Gly电流的双向调节作用可能是由高亲和力和低亲和力Zn2+结合位点分别介导的。我们在大鼠骶髓后连合核(SDCN)神经元上观察到，高浓度Zn2+(10 μmol/L～1 mmol/L)明显抑制Gly和牛磺酸激活的电流。然而，低浓度Zn2+(<10 μmol/L)对二者均无明显作用[9]。由于SDCN神经元GlyR只表达低亲和力Zn2+结合位点所致，值得深入研究。
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4.激动剂结合位点的结构模型： 在研究相关的nAChR配体结合区时，人们提出了LGICs受体中激动剂和竞争性拮抗剂结合位点的“三环”模型(Devillers-Thiery等.1993)。与GlyR中激动剂或/和士的宁结合有关的残基也与“三环”结构一致。例如，α1亚单位的Phe-159、Gly-160和Tyr-161残基位于环2中；而Lys-200、Tyr-202、Thr-204残基均在环3中。就GlyR而言，理想的配体结合区还必须能够兼容Gly和士的宁分子。然而，尽管Gly是最简单的氨基酸，其结构很小, 但士的宁分子却相当大，而且士的宁与GlyR的亲和力比Gly还要大。此外，GlyR只允许β-而不与α-氨基酸结合。为此，Schmieden等(1992,1993)提出了一种“双位点”配体结合模型，即在GlyR α1亚单位的Gly-160β转角(环2) 处形成高亲和力的激动剂和拮抗剂结合亚位点I，而由Ile-111和Ala-212处形成低亲和力的β-丙氨酸和牛磺酸结合亚位点Ⅱ。
(四)通道孔区
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1.M2区的作用：与nAChR的相似性有力地支持GlyR M2区形成通道衬里的观点。近来越来越多的更直接的证据进一步推动了有关M2区在GlyR通道孔区中作用的研究。将GlyR M2肽导入脂双层，能够引发单通道活动(Reddy等.1993)。共有18个残基长的M2区包含有多个极性残基。α1亚单位M2区的胞内和胞外侧均分布有带正电荷的Arg残基(分别为Arg-252和Arg-271)。所有α同工型的M2序列大体上都是相同的，但254位点(在α2中的是261)的残基例外。该位点在α1亚单位中为Gly，在α2和α3中则是Ala。β亚单位的M2区与α亚单位的有很大的不同。然而，所有亚单位的M2区均被认为是以α螺旋的形式参与通道孔区的构成(Grenningloh等. 1987)，螺旋每3到4个残基中即有一个直接面对通道孔。CTB(cyanotriphenylborate)是一种最近鉴定的GlyR通道非竞争性阻断剂。Rundstrom等[10]证明，α1 GlyR M2区的某个残基发生突变后，通道对CTB的敏感性降低。另外，GlyR通道亚电导状态的分布也有赖于亚单位的组成，更确切地说，依赖于这些不同亚单位M2区的序列。G254A替代研究表明高电导(105～111 pS)通道状态仅存于α2和α3 GlyR(Bormann等.1993)。电导状态的分布受M2序列胞外侧带电残基Arg-271的影响。如果这个带正电荷的残基突变为不带电荷的Leu(R271L)或Gln(R271Q)，可破坏较高电导状态，从而抑制α1和α1/β GlyR中Gly激活的全细胞电流(Langosch等.1994)。由于Arg-271在β亚单位的相应位点是Ala，而此残基不带电荷，因此这一点可能是β异聚体GlyR只表现有较低电导状态的原因。
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2.离子通道的结构模型：除了已确定了M2片段中一些残基影响通道的电导和PTX敏感性外，至今还无法得到一个明确的GlyR模型图。Galzi和他的同事(1992)通过把α7 nAChR M2片段中的残基突变为GlyR M2片段，试图将nAChR的离子选择性从阳离子变为阴离子。他们发现，三处替换就足以使其获得阴离子选择性：用Ala代替Val残基环和中间的带电的Glu环以及在环附近插入一个Pro残基。Pro的插入表明M2区α螺旋必须被重排，以使不同的残基面对通道孔。GlyRα亚单位的M2片段仅包括Arg-252和Arg-271两个带电残基，分别定位于胞内和胞外边缘。这两个带正电荷的候选环可能与nAChR中带负电荷的残基环担负相似的作用。Arg-271的突变引起GlyR全细胞电流降低和单通道电导改变的事实支持了这个观点。然而，带电的胞外候选环的破坏并不影响GlyR通道正负离子的选择性，却产生了一些与配体结合的变构调节及通道激活等有关的“副作用”，提示Arg-271可能是通过门控作用方式而非“电荷环”假说所描述的与Cl-直接的静电作用来决定通道的电导。
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(五)通道激活 Rajendra等[11]发现，β-丙氨酸和牛磺酸(0.01～100 mmol/L)在R271L和R271Q突变型α1 GlyR中不能诱导电流，但是这些配体与突变型GlyR的亲和力却与野生型α1 GlyR相当。同时，β-丙氨酸和牛磺酸中的任一个与Gly联合应用，均以剂量依赖性和竞争性方式抑制Gly激活的电流。这种抑制不是由于诱发了受体交叉脱敏，因为以β-丙氨酸和牛磺酸进行预处理后，Gly激活的电流的大小并不减小。综上所述，尽管β-丙氨酸和牛磺酸与突变型GlyR的结合能力不受影响，但它们丧失了激活通道的能力，从而使这些野生型GlyR的激动剂转变成了突变型GlyR的竞争性拮抗剂。这些结果从一定意义上说明，激动剂结合与通道激活之间是脱耦联的。Lynch等在R271Q突变型GlyR中发现低浓度PTX可变构增强Gly电流[12]。如此看来，与激动剂或拮抗剂结合时，Arg-271可以被视为是诱导GlyR通道结构发生适当改变的“分子开关”。
(六)磷酸化 LGICs受体可被PKA、PKC、CaMKII和酪氨酸激酶(TK)磷酸化[13]。GlyR亚单位也受上述这些激酶调节。同LGICs超家族的其他成员一样，GlyR的磷酸化可能与长效突触可塑性和受体在突触的簇集有关[13，14]。
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1.PKA磷酸化：运用全细胞和单通道膜片钳记录技术，Huang(1990)和她的同事在培养的三叉神经元中观察到PKA以增加通道开放概率的机制显著增强Gly激活的电流。在重组表达的α亚单位GlyR中，也观察到了PKA类似的增强作用。然而，在下丘脑、黑质和SDCN新鲜分离神经元上，PKA均抑制GlyR介导的电流。我们研究发现[15，16]，去甲肾上腺素(NA)可通过激活与非胰岛激活蛋白(IAP)偶联的α2受体，抑制腺苷酸环化酶，减少cAMP生成，使PKA活性降低，导致GlyR“脱抑制”和功能上调。在PKA抑制剂H-89存在下，NA的增强作用被阻断。单通道膜片钳记录显示，NA缩短GlyR通道关闭的时间，从而增加通道开放概率。Vaello等(1994)运用生化分析方法，在体外表达的GlyR α亚单位和脊髓神经元上证实，GlyR可直接被PKA磷酸化。尽管以上有关PKA调节GlyR的结果相互矛盾，但是决定PKA对GlyR起增强或抑制作用的关键，可能在于PKA是直接磷酸化GlyR还是间接磷酸化gephyrin[16]。
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2.PKC磷酸化：业已证明，GlyR α1亚单位的胞质结构域的Ser-391处存在PKC磷酸化位点。运用佛波酯激活PKC，可使Gly激活的电流减小，这与在nAChR中观察到的结果相似。然而，越来越多的资料表明，PKC增强CNS神经元GlyR介导的电流。运用制霉菌素穿孔膜片钳方法，我们观察到PKC激动剂PMA和OAG均增强Gly电流[15，17]。
3.CaMKII磷酸化：虽然在迄今鉴定的GlyR的4个α亚单位和2个β亚单位上均未发现CaMKII磷酸化的位点，但是Randic研究小组(1995)报道，向新鲜分离的脊髓后角神经元内注射CaMKII的α亚单位可增强Gly激活的电流。最近，我们发现激活AMPA和NMDA受体分别增强脊髓后角神经元Gly激活的电流，AMPA和NMDA受体介导的效应均依赖于细胞外Ca2+浓度，提示经AMPA或NMDA内流的Ca2+可以上调GlyR的功能[18]。我们还进一步发现，以钙调素(CaM)抑制剂CPZ、TFP和W-7或CaMKII抑制剂KN-62预处理细胞后，Ca2+的增强作用被取消，提示Ca2+对GlyR的增强作用是由Ca2+/CaM和CaMKII介导的。此外，在CaM依赖性蛋白磷酸酶(calcineurin, CaN)抑制剂okadaic acid或FK 506存在下，CaMKII对Gly电流的增强作用不能恢复，提示CaMKII和CaN活性的平衡是协同调节GlyR通道的功能所必需的。
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4.酪氨酸激酶磷酸化：nAChR的TK磷酸化，促进受体聚集到突触后位点上，并增加受体脱敏速度。在GlyR β亚单位Tyr-431处也有一个潜在的TK磷酸化位点，但它的功能仍未查明。据推测可能也与受体集簇有关，因为β亚单位增加功能性GlyR的表达。
三、GlyR分子病
亚惊厥剂量的士的宁引起感觉过敏，而急性士的宁中毒导致全身肌张力过高。人和动物中几种遗传性疾病也产生类似症状。这些疾病的一个显著特征是夸大的惊厥反射。最近分子水平的研究已经证明抑制性Gly能通路的缺陷是多种惊厥综合征的病理学基础。
(一)家族性惊厥病 家族性惊厥病(hyperkplexia)谱系的基因分析表明此病基因位于5q染色体的末端，此处恰是GlyR α1亚单位基因所在地。Shiang等(1993,1995)的研究表明，α1亚单位基因有两处突变，即由Leu或Gln代替Arg-271，以及以Cys代替Tyr-279。由于此病是以常染色体显性等位基因模式遗传的，包含Arg-271突变型的同聚体GlyR实际上不会在体内发生(Herskowitz等.1987)。在一个既含有正常GlyR α1基因又含有病变的GlyR α1基因的惊厥病染色体上，三个α1亚单位中平均只含有一个或两个突变基因。Langosh等(1994)给非洲瓜蟾胚胎以1∶1∶8的比例注射野生型α1、R271L或R271Q α1和β亚单位cRNA，以形成同时表达正常和病变α1亚单位的α1/β异聚体。他们在该异聚体上发现，Gly的敏感性减少80%～83.3%，Gly激活的电流减少26～29%。另一个家族性惊厥病突变基因与此病一个常染色体隐性突变有关，导致α1亚单位M1-M2胞内环中Asn代替了Ile-244(Dees等.1994)。体外重组实验表明，含有此突变的α1/βGlyR对Gly的敏感性以及Gly电流均与野生型α1、R271L或R271Q α1和β亚单位共表达的α1/βGlyR相似。
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作为家族性惊厥病病理学基础的基因缺陷研究查明了在三个位点上的四个突变。有趣的是，这些突变通常集中在受体的通道口附近，即在M1-M2胞内环或M2-M3胞外环。毫无疑问，这些结果将进一步推动对包括马来西亚的拉塔病(latah)，美国缅因州和加拿大的jumping病，西伯利亚和亚洲、非洲的部分地区的痉跳病(myriachit)，日本的伊姆病(imu)，非洲的bantu病，缅甸的jauns病，泰国的bah-tsche病，菲利宾的silok病和lapp panic病等其他人类惊厥病(Andermann等.1988)的分子机制的深入研究。
(二)鼠惊厥综合病 这一类型惊厥病的表型类似于鼠的常染色体隐性突变，共有三种类型：spasmodic、oscillator、spastic。spasmodic、oscillator和spastic纯合子对意外刺激反应呈现肌张力过强、肌痉挛、摔倒后不能站立等。病鼠直到出生两周后表型还正常，但到第三周时出现症状。这段时间正好与胎儿α2 GlyR亚型被成体α1/βGlyR替代相对应。spasmodic是GlyR α1亚单位无义突变引起的，使得亚单位的胞外N-末端Ala-52被Ser代替。具有此突变的重组α1亚单位同聚体GlyR对Gly敏感性减小83.3%。oscillator属于spasmodic的等位基因突变体，由于移码突变引起α1亚单位M3结构域改变，产生不完整的蛋白质，因而不能组装成有功能的GlyR(Buckwalter等.1994)。尽管有些资料提示惊厥病可能与突发性婴儿死亡有关(Nigro等.1992)，但是只有oscillator型惊厥病是迄今为止可以确定的致死性惊厥综合征。与已描述过的两类鼠惊厥综合征不同，GlyR β亚单位基因的缺陷是引起spastic的原因。由于内含子LINE-1(一种独特的重复序列motif，经常被发现在不活动假基因样序列中)的插入，引起β亚单位的mRNA异常拼接，从而导致外显子略读(或跳读)和蛋白质的早熟，以及脊髓与脑中β亚单位水平急剧减少。尽管spastic脊髓GlyR功能正常，但与野生型动物相比受体数量明显减少。这说明spastic突变阻碍了协助GlyR有效组装的β亚单位的表达。
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(三)肌阵挛 脊髓中GlyR表达减少也与牛和马肌阵挛(myoclonus)有关。然而，至今人们还不知这是否同样是由于某个α或β亚单位缺陷所引起的。有趣的是，肌阵挛牛脊髓和脑中GABA结合位点增加(Lummis.1990)。在spastic小鼠的CNS中也发现GABA结合位点增加(White等.1982)。增强的GABA能抑制性神经传递可能是对惊厥综合征引起的Gly能抑制性神经传递减弱的一种补偿性反应。
(四)遗传性惊厥病的生理趋同现象 惊厥病分子基础的研究说明了不同的突变是怎样在生理上趋同的[19]。惊厥病影响Gly能中枢传递的机制可归纳为两类：(1)通过降低激动剂敏感性和/或效能而削弱GlyR功能；(2)阻碍或减少GlyR表达。这两种机制趋同于CNS中Gly能抑制性活动的破坏，最终导致惊厥综合征。
四、结语
本文讨论了正常的和疾病状态下Gly能抑制性神经传递的分子特点，描绘出了一个LGICs超家族结构和功能的理想模型。正如已被广泛接受的α7 nAChR一样，同聚体α1 GlyR由于缺乏其它亚单位的影响，大大推动了突变型受体的研究[20]。通过对突变体与某些GlyR分子病关系的研究，人们对于GlyR功能的认识有了进一步提高。今后相关领域的研究将集中在GlyR在突触后膜的簇集以及配体结合位点和离子通道孔区的三维空间结构等。分子构建和转基因动物等新技术的应用，将有助于找到这些问题的正确答案。
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徐天乐(中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230027)
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一、GlyR在CNS中的分布
二、GlyR的分子结构
(一)亚单位结构
(二)受体组装和表达
(三)配体结合
(四)通道孔区
(五)通道激活
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(六)磷酸化
三、GlyR分子病
(一)家族性惊厥病
(二)鼠惊厥综合病
(三)肌阵挛
(四)遗传性惊厥病的生理趋同现象
四、结语
甘氨酸受体(GlyR)介导的抑制性神经传递在哺乳动物中枢神经系统(CNS)反射活动、随意运动调节和感觉信号的处理中具有重要作用[1]。GlyR五聚体由三个独立的多肽组成：两个糖蛋白(48 kD和58 kD)，分别称为α和β亚单位，另一个为93 kD的细胞质蛋白，叫“gephyrin”。GlyR与尼古丁型乙酰胆碱受体(nAChR)、GABAA受体(GABAAR)、5-HT3受体(5-HT3R)等具有很大的同源性。它们一起形成一个配体门控离子通道(LGICs)超家族。LGICs的五个跨膜亚单位形成离子通道孔区。就GlyR而言，该离子通道选择性地通透Cl-。
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一、GlyR在CNS中的分布
GlyR在脊髓和延髓中以高水平表达，而在中脑、下丘脑和丘脑中较少，高级脑区则不表达。GlyR的这种分布模式与Gly在脊髓和脑干中作为主要的抑制性神经递质发挥作用是一致的。有趣的是，GlyR和GABAAR常常共存于脊髓神经元中[2]，提示Gly和GABA可能作为共递质(cotransmitter)，在脊髓内发挥共传递(cotransmission)作用[3，4]。
从成年大鼠脊髓中纯化的GlyR是由α1和β亚单位组成的异聚体，其比例约为α1∶β=3∶2。相反，有证据表明胚胎GlyR是由五个α2亚单位组成的同聚体。体外重组的α2同聚体与胚胎GlyR的功能特性也十分一致。另外，在大鼠脊髓中仅发现低水平的α3 mRNA，提示α3在GlyR中可能占比例较小。β亚单位单独不易形成同聚体GlyR，但能有效地与α1、α2或α3结合形成异聚体。另一方面，即使没有β亚单位，α1、α2和α3也可以形成重组GlyR。
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α1亚单位mRNA的分布与成体脊髓和脑干中3H-士的宁结合位点相似。但令人惊奇的是β亚单位mRNA以很高的数量出现在成体整体CNS中。高级脑区存在β亚单位mRNA有些让人难以理解，因为β亚单位单独不能形成有功能的GlyR。GlyR细胞内gephyrin亚单位mRNA的分布更加广泛，在大鼠CNS所有区域都有表达。尽管GlyR在成体动物的高级脑区几乎缺如，但在急性分离的和原代培养的新生大鼠海马神经元上，均已观察到由Gly诱导的电流反应。最近，Flint等[5]报道，在大鼠新皮质发育早期，非突触释放的牛磺酸可使该区的GlyR激活。由于胚胎期牛磺酸剥夺能引起皮质发育不全。因此推测牛磺酸可能通过激活非突触部位GlyR影响新皮质的发育。
在亚细胞水平，GlyR以“簇”的方式分布在细胞的表面。据推测出现在胞体和树突上的“簇”位于突触连接点上。在细胞培养过程中，gephyrin对GlyR的簇集是必需的，gephyrin可以将受体锚定于细胞骨架上。此外，最近有研究表明，在胚胎发育早期，激活GlyR产生兴奋性而非抑制性效应[6，7]，GlyR的“簇集”受到因激活甘氨酸受体而引起的电压依赖性Ca2+通道开放和由此产生的Ca2+内流的调节[7]。
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二、GlyR的分子结构
(一)亚单位结构 GlyR α和β亚单位各由420和470氨基酸残基组成(附图)。经疏水性分析，预测GlyR亚单位含一个长的N-末端细胞外区，四个跨膜结构域(称为M1-M4)和一个居M3-M4之间的大的细胞内环。这是所有LGICs结构的普遍模式。GlyR的N-末端含有至少一个潜在的N-糖基化位点(例如α1的第38位残基N)，此区域很可能存在两个双硫链环。第一个环是由Cys-138和Cys-152(α1亚单位记数)通过二硫键形成的，该环在所有LGICs中是保守的；第二个环靠近M1区，是由Cys-198和Cys-209形成的。在α和β亚单位M3和M4之间大的细胞内环起始部，有一些带正电荷的残基并包含蛋白激酶磷酸化序列。
(二)受体组装和表达 业已证明有几个氨基酸残基影响重组α亚单位的组装。首先，N38A替换可使原先Gly激活的电流消失，说明N38A GlyR无法形成，即α亚单位只能以糖基化形式组装。其次，将Cys-138或/和Cys-152突变为Ser或/和Ala，使其二硫键解链，同样不能形成有功能的GlyR，推测是阻碍了受体组装。替换环内其它残基也可产生相似的结果。例如，用Ala或Asn代替Asp-148使GlyR表达受阻。尽管较保守地替换成D148E产生的GlyR与野生型GlyR有相似的功能特性，但突变受体对士的宁的敏感性降低。由此看来，第一个环对LGICs受体的组装是必需的。第二个环可能有同样的作用。因为将Cys-198替换为Ser(C198S)阻碍GlyR组装；用一个短链残基置换环内的Tyr-202时也产生同样后果。由于Tyr-202同时还是一个重要的配体结合残基(见下文)，后一发现已引起重视。奇怪的是，当Cys替换为Ser(C209S)时，α1亚单位虽然可以在细胞表面组装，但不能结合士的宁或不产生Gly激活电流。第二个环的功能还将在下文中讨论。此外，在α1亚单位的M2结构域，以Asn、Gln或Glu替代细胞内边缘的Arg-252也防碍受体组装。
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尽管在发育早期或在体外运用重组技术产生的α同聚体具有与成体α/β异聚体相近的药理学特性，但是α和β亚单位的共表达可以大大地提高受体组装的效率。β亚单位可能是通过某种与α亚单位的相互作用的机制来影响受体的组装的。
(三)配体结合
1.激动剂和士的宁：在N端胞外结构域至少有两个分开的区域为GlyR激动剂和士的宁提供结合位点。第一个区域是通过对照人和大鼠α2亚单位的药理学特性来确定的。大鼠α2变异体α2*表现低Gly亲和力(减小97.5%)和低士的宁敏感性(减小99.8%)大鼠α2*和人α2的区别仅在于第167位残基。α2*或α2分别出现Glu-167或Gly-167是由α2基因的多态性决定的。因此，重组α2* GlyR中E167G的替换使其Gly亲和性和士的宁敏感性恢复到与α1或α2 GlyR一样的水准就不奇怪了。类似地，α1亚单位相应残基Gly-160的替换形成G160E，使GlyR对士的宁的敏感性下降。
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附图 GlyRα1亚单位模型
图中圆圈代表各种氨基酸残基，灰色条带代表细胞膜
第二个被鉴定的配体结合位点包含在第二个环内。在α1亚单位，此环是通过Cys-198和Cys-209间的二硫键形成的。当两个Cys残基中任何一个发生突变后，二硫键解链，因而改变此结构域的空间结构。C198S的置换通过破坏受体组装而使配体不能结合，而C209S产生出不能结合激动剂和士的宁的GlyR(见上文)。随后的研究进一步阐明了在此环内，标偶数的残基Lys-200、Tyr-202和Thr-204定位于Cys-198和Gly-205处假定的β转角之间，它们影响受体对激动剂和/或士的宁的敏感性。在这三个残基中，Lys-200是士的宁结合的决定因子，Thr-204决定激动剂结合。有趣的是，位于中间的Tyr-202作为激动剂和士的宁结合的“共同”残基同时还影响受体的组装(见上文)。在α1 GlyR中，通过用Phe置换(Y202F)的方法从残基芳香环中移去部分OH-，会引起Gly亲和力下降98.8%，而其对牛磺酸的亲和力和对士的宁的敏感性只有较轻的降低。用不带电荷的长链残基如Leu代替芳香环(Y202L)则对Gly亲和力没有明显影响，说明Gly可能主要是通过氢键与OH-作用与受体结合。然而，Y202L型GlyR对牛磺酸和士的宁均不敏感，说明失去芳香环的受体丧失了牛磺酸和士的宁结合能力。此外，用短链氨基酸Ala、Ser或Thr替代Tyr-202，可以阻止受体组装。由此不难看出，Gly主要与OH-，而士的宁和牛磺酸则主要与芳香环之间存在相互作用，并且受体的成功组装有赖于侧链的大小。在GlyR上，士的宁结合位点有别于激动剂结合位点，士的宁结合在Lys-200和Tyr-202上，而激动剂结合在Tyr-202和Thr-204上。
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2.印防己毒素(PTX)：在重组α/β GlyR中，PTX的敏感性与α1 GlyR比要低94.1%～
99.5%。Pribilla等(1992)发现以α1残基片段代替α/β GlyR中β亚单位的M2通道衬里区域可使其对PTX的敏感性恢复到α1的水平。胞外结构域中PTX结合区尚未被鉴定，但它的结合位点可能有别于士的宁。有意思的是，α1亚单位M2区域的胞外边缘的Arg-271的突变使PTX的作用方式从竞争性变为非竞争性。另外，这种突变可使GlyR介导的电流被低浓度PTX加强。
3.Zn2+： Laube等[8]运用α1体证明，α1亚单位N端胞外结构域中位于95～105之间(一种决定受体表达和组装的“组装盒”)或/和148～151之间的残基，对于Zn2+介导的增强Gly激动电流的作用是至关重要的。但是，这些区域似乎与高浓度Zn2+引起的电流抑制无关，推测Zn2+对Gly电流的双向调节作用可能是由高亲和力和低亲和力Zn2+结合位点分别介导的。我们在大鼠骶髓后连合核(SDCN)神经元上观察到，高浓度Zn2+(10 μmol/L～1 mmol/L)明显抑制Gly和牛磺酸激活的电流。然而，低浓度Zn2+(<10 μmol/L)对二者均无明显作用[9]。由于SDCN神经元GlyR只表达低亲和力Zn2+结合位点所致，值得深入研究。
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4.激动剂结合位点的结构模型： 在研究相关的nAChR配体结合区时，人们提出了LGICs受体中激动剂和竞争性拮抗剂结合位点的“三环”模型(Devillers-Thiery等.1993)。与GlyR中激动剂或/和士的宁结合有关的残基也与“三环”结构一致。例如，α1亚单位的Phe-159、Gly-160和Tyr-161残基位于环2中；而Lys-200、Tyr-202、Thr-204残基均在环3中。就GlyR而言，理想的配体结合区还必须能够兼容Gly和士的宁分子。然而，尽管Gly是最简单的氨基酸，其结构很小, 但士的宁分子却相当大，而且士的宁与GlyR的亲和力比Gly还要大。此外，GlyR只允许β-而不与α-氨基酸结合。为此，Schmieden等(1992,1993)提出了一种“双位点”配体结合模型，即在GlyR α1亚单位的Gly-160β转角(环2) 处形成高亲和力的激动剂和拮抗剂结合亚位点I，而由Ile-111和Ala-212处形成低亲和力的β-丙氨酸和牛磺酸结合亚位点Ⅱ。
(四)通道孔区
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1.M2区的作用：与nAChR的相似性有力地支持GlyR M2区形成通道衬里的观点。近来越来越多的更直接的证据进一步推动了有关M2区在GlyR通道孔区中作用的研究。将GlyR M2肽导入脂双层，能够引发单通道活动(Reddy等.1993)。共有18个残基长的M2区包含有多个极性残基。α1亚单位M2区的胞内和胞外侧均分布有带正电荷的Arg残基(分别为Arg-252和Arg-271)。所有α同工型的M2序列大体上都是相同的，但254位点(在α2中的是261)的残基例外。该位点在α1亚单位中为Gly，在α2和α3中则是Ala。β亚单位的M2区与α亚单位的有很大的不同。然而，所有亚单位的M2区均被认为是以α螺旋的形式参与通道孔区的构成(Grenningloh等. 1987)，螺旋每3到4个残基中即有一个直接面对通道孔。CTB(cyanotriphenylborate)是一种最近鉴定的GlyR通道非竞争性阻断剂。Rundstrom等[10]证明，α1 GlyR M2区的某个残基发生突变后，通道对CTB的敏感性降低。另外，GlyR通道亚电导状态的分布也有赖于亚单位的组成，更确切地说，依赖于这些不同亚单位M2区的序列。G254A替代研究表明高电导(105～111 pS)通道状态仅存于α2和α3 GlyR(Bormann等.1993)。电导状态的分布受M2序列胞外侧带电残基Arg-271的影响。如果这个带正电荷的残基突变为不带电荷的Leu(R271L)或Gln(R271Q)，可破坏较高电导状态，从而抑制α1和α1/β GlyR中Gly激活的全细胞电流(Langosch等.1994)。由于Arg-271在β亚单位的相应位点是Ala，而此残基不带电荷，因此这一点可能是β异聚体GlyR只表现有较低电导状态的原因。
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2.离子通道的结构模型：除了已确定了M2片段中一些残基影响通道的电导和PTX敏感性外，至今还无法得到一个明确的GlyR模型图。Galzi和他的同事(1992)通过把α7 nAChR M2片段中的残基突变为GlyR M2片段，试图将nAChR的离子选择性从阳离子变为阴离子。他们发现，三处替换就足以使其获得阴离子选择性：用Ala代替Val残基环和中间的带电的Glu环以及在环附近插入一个Pro残基。Pro的插入表明M2区α螺旋必须被重排，以使不同的残基面对通道孔。GlyRα亚单位的M2片段仅包括Arg-252和Arg-271两个带电残基，分别定位于胞内和胞外边缘。这两个带正电荷的候选环可能与nAChR中带负电荷的残基环担负相似的作用。Arg-271的突变引起GlyR全细胞电流降低和单通道电导改变的事实支持了这个观点。然而，带电的胞外候选环的破坏并不影响GlyR通道正负离子的选择性，却产生了一些与配体结合的变构调节及通道激活等有关的“副作用”，提示Arg-271可能是通过门控作用方式而非“电荷环”假说所描述的与Cl-直接的静电作用来决定通道的电导。
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(五)通道激活 Rajendra等[11]发现，β-丙氨酸和牛磺酸(0.01～100 mmol/L)在R271L和R271Q突变型α1 GlyR中不能诱导电流，但是这些配体与突变型GlyR的亲和力却与野生型α1 GlyR相当。同时，β-丙氨酸和牛磺酸中的任一个与Gly联合应用，均以剂量依赖性和竞争性方式抑制Gly激活的电流。这种抑制不是由于诱发了受体交叉脱敏，因为以β-丙氨酸和牛磺酸进行预处理后，Gly激活的电流的大小并不减小。综上所述，尽管β-丙氨酸和牛磺酸与突变型GlyR的结合能力不受影响，但它们丧失了激活通道的能力，从而使这些野生型GlyR的激动剂转变成了突变型GlyR的竞争性拮抗剂。这些结果从一定意义上说明，激动剂结合与通道激活之间是脱耦联的。Lynch等在R271Q突变型GlyR中发现低浓度PTX可变构增强Gly电流[12]。如此看来，与激动剂或拮抗剂结合时，Arg-271可以被视为是诱导GlyR通道结构发生适当改变的“分子开关”。
(六)磷酸化 LGICs受体可被PKA、PKC、CaMKII和酪氨酸激酶(TK)磷酸化[13]。GlyR亚单位也受上述这些激酶调节。同LGICs超家族的其他成员一样，GlyR的磷酸化可能与长效突触可塑性和受体在突触的簇集有关[13，14]。
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1.PKA磷酸化：运用全细胞和单通道膜片钳记录技术，Huang(1990)和她的同事在培养的三叉神经元中观察到PKA以增加通道开放概率的机制显著增强Gly激活的电流。在重组表达的α亚单位GlyR中，也观察到了PKA类似的增强作用。然而，在下丘脑、黑质和SDCN新鲜分离神经元上，PKA均抑制GlyR介导的电流。我们研究发现[15，16]，去甲肾上腺素(NA)可通过激活与非胰岛激活蛋白(IAP)偶联的α2受体，抑制腺苷酸环化酶，减少cAMP生成，使PKA活性降低，导致GlyR“脱抑制”和功能上调。在PKA抑制剂H-89存在下，NA的增强作用被阻断。单通道膜片钳记录显示，NA缩短GlyR通道关闭的时间，从而增加通道开放概率。Vaello等(1994)运用生化分析方法，在体外表达的GlyR α亚单位和脊髓神经元上证实，GlyR可直接被PKA磷酸化。尽管以上有关PKA调节GlyR的结果相互矛盾，但是决定PKA对GlyR起增强或抑制作用的关键，可能在于PKA是直接磷酸化GlyR还是间接磷酸化gephyrin[16]。
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2.PKC磷酸化：业已证明，GlyR α1亚单位的胞质结构域的Ser-391处存在PKC磷酸化位点。运用佛波酯激活PKC，可使Gly激活的电流减小，这与在nAChR中观察到的结果相似。然而，越来越多的资料表明，PKC增强CNS神经元GlyR介导的电流。运用制霉菌素穿孔膜片钳方法，我们观察到PKC激动剂PMA和OAG均增强Gly电流[15，17]。
3.CaMKII磷酸化：虽然在迄今鉴定的GlyR的4个α亚单位和2个β亚单位上均未发现CaMKII磷酸化的位点，但是Randic研究小组(1995)报道，向新鲜分离的脊髓后角神经元内注射CaMKII的α亚单位可增强Gly激活的电流。最近，我们发现激活AMPA和NMDA受体分别增强脊髓后角神经元Gly激活的电流，AMPA和NMDA受体介导的效应均依赖于细胞外Ca2+浓度，提示经AMPA或NMDA内流的Ca2+可以上调GlyR的功能[18]。我们还进一步发现，以钙调素(CaM)抑制剂CPZ、TFP和W-7或CaMKII抑制剂KN-62预处理细胞后，Ca2+的增强作用被取消，提示Ca2+对GlyR的增强作用是由Ca2+/CaM和CaMKII介导的。此外，在CaM依赖性蛋白磷酸酶(calcineurin, CaN)抑制剂okadaic acid或FK 506存在下，CaMKII对Gly电流的增强作用不能恢复，提示CaMKII和CaN活性的平衡是协同调节GlyR通道的功能所必需的。
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4.酪氨酸激酶磷酸化：nAChR的TK磷酸化，促进受体聚集到突触后位点上，并增加受体脱敏速度。在GlyR β亚单位Tyr-431处也有一个潜在的TK磷酸化位点，但它的功能仍未查明。据推测可能也与受体集簇有关，因为β亚单位增加功能性GlyR的表达。
三、GlyR分子病
亚惊厥剂量的士的宁引起感觉过敏，而急性士的宁中毒导致全身肌张力过高。人和动物中几种遗传性疾病也产生类似症状。这些疾病的一个显著特征是夸大的惊厥反射。最近分子水平的研究已经证明抑制性Gly能通路的缺陷是多种惊厥综合征的病理学基础。
(一)家族性惊厥病 家族性惊厥病(hyperkplexia)谱系的基因分析表明此病基因位于5q染色体的末端，此处恰是GlyR α1亚单位基因所在地。Shiang等(1993,1995)的研究表明，α1亚单位基因有两处突变，即由Leu或Gln代替Arg-271，以及以Cys代替Tyr-279。由于此病是以常染色体显性等位基因模式遗传的，包含Arg-271突变型的同聚体GlyR实际上不会在体内发生(Herskowitz等.1987)。在一个既含有正常GlyR α1基因又含有病变的GlyR α1基因的惊厥病染色体上，三个α1亚单位中平均只含有一个或两个突变基因。Langosh等(1994)给非洲瓜蟾胚胎以1∶1∶8的比例注射野生型α1、R271L或R271Q α1和β亚单位cRNA，以形成同时表达正常和病变α1亚单位的α1/β异聚体。他们在该异聚体上发现，Gly的敏感性减少80%～83.3%，Gly激活的电流减少26～29%。另一个家族性惊厥病突变基因与此病一个常染色体隐性突变有关，导致α1亚单位M1-M2胞内环中Asn代替了Ile-244(Dees等.1994)。体外重组实验表明，含有此突变的α1/βGlyR对Gly的敏感性以及Gly电流均与野生型α1、R271L或R271Q α1和β亚单位共表达的α1/βGlyR相似。
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作为家族性惊厥病病理学基础的基因缺陷研究查明了在三个位点上的四个突变。有趣的是，这些突变通常集中在受体的通道口附近，即在M1-M2胞内环或M2-M3胞外环。毫无疑问，这些结果将进一步推动对包括马来西亚的拉塔病(latah)，美国缅因州和加拿大的jumping病，西伯利亚和亚洲、非洲的部分地区的痉跳病(myriachit)，日本的伊姆病(imu)，非洲的bantu病，缅甸的jauns病，泰国的bah-tsche病，菲利宾的silok病和lapp panic病等其他人类惊厥病(Andermann等.1988)的分子机制的深入研究。
(二)鼠惊厥综合病 这一类型惊厥病的表型类似于鼠的常染色体隐性突变，共有三种类型：spasmodic、oscillator、spastic。spasmodic、oscillator和spastic纯合子对意外刺激反应呈现肌张力过强、肌痉挛、摔倒后不能站立等。病鼠直到出生两周后表型还正常，但到第三周时出现症状。这段时间正好与胎儿α2 GlyR亚型被成体α1/βGlyR替代相对应。spasmodic是GlyR α1亚单位无义突变引起的，使得亚单位的胞外N-末端Ala-52被Ser代替。具有此突变的重组α1亚单位同聚体GlyR对Gly敏感性减小83.3%。oscillator属于spasmodic的等位基因突变体，由于移码突变引起α1亚单位M3结构域改变，产生不完整的蛋白质，因而不能组装成有功能的GlyR(Buckwalter等.1994)。尽管有些资料提示惊厥病可能与突发性婴儿死亡有关(Nigro等.1992)，但是只有oscillator型惊厥病是迄今为止可以确定的致死性惊厥综合征。与已描述过的两类鼠惊厥综合征不同，GlyR β亚单位基因的缺陷是引起spastic的原因。由于内含子LINE-1(一种独特的重复序列motif，经常被发现在不活动假基因样序列中)的插入，引起β亚单位的mRNA异常拼接，从而导致外显子略读(或跳读)和蛋白质的早熟，以及脊髓与脑中β亚单位水平急剧减少。尽管spastic脊髓GlyR功能正常，但与野生型动物相比受体数量明显减少。这说明spastic突变阻碍了协助GlyR有效组装的β亚单位的表达。
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(三)肌阵挛 脊髓中GlyR表达减少也与牛和马肌阵挛(myoclonus)有关。然而，至今人们还不知这是否同样是由于某个α或β亚单位缺陷所引起的。有趣的是，肌阵挛牛脊髓和脑中GABA结合位点增加(Lummis.1990)。在spastic小鼠的CNS中也发现GABA结合位点增加(White等.1982)。增强的GABA能抑制性神经传递可能是对惊厥综合征引起的Gly能抑制性神经传递减弱的一种补偿性反应。
(四)遗传性惊厥病的生理趋同现象 惊厥病分子基础的研究说明了不同的突变是怎样在生理上趋同的[19]。惊厥病影响Gly能中枢传递的机制可归纳为两类：(1)通过降低激动剂敏感性和/或效能而削弱GlyR功能；(2)阻碍或减少GlyR表达。这两种机制趋同于CNS中Gly能抑制性活动的破坏，最终导致惊厥综合征。
四、结语
本文讨论了正常的和疾病状态下Gly能抑制性神经传递的分子特点，描绘出了一个LGICs超家族结构和功能的理想模型。正如已被广泛接受的α7 nAChR一样，同聚体α1 GlyR由于缺乏其它亚单位的影响，大大推动了突变型受体的研究[20]。通过对突变体与某些GlyR分子病关系的研究，人们对于GlyR功能的认识有了进一步提高。今后相关领域的研究将集中在GlyR在突触后膜的簇集以及配体结合位点和离子通道孔区的三维空间结构等。分子构建和转基因动物等新技术的应用，将有助于找到这些问题的正确答案。
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徐天乐(中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230027)
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