一种新的转录因子——EPAS1
作者：陈伟
单位：军事医学科学院放射医学研究所, 北京100850
关键词：EPAS1；转录因子；内皮细胞
摘要 EPAS1是一种近年来被发现的转录蛋白摘要 EPAS1是一种近年来被发现的转录蛋白，主要存在于内皮细胞内。EPAS1能与芳香烃受体核转移蛋白(ARNT)一起形成异二聚体，调节一系列基因的转录和表达，维持机体正常的生长和发育。
学科分类号 Q473; Q71
含有碱性区-螺旋-环-螺旋-PAS(basic-helix-loop-helix-PER-AHR-SIM)结构域的转录因子超家族在机体生长发育过程中起着十分重要的作用。其中缺氧诱导因子1(HIF-1)存在于许多类型的细胞内，在缺氧条件下能上调促红细胞生成素(EPO)和糖酵解酶等基因的转录和表达,保持体内氧的稳态[1]。EPAS1(endothelia PAS domain protein1)是1997年由Tian等克隆出的一种含有bHLH-PAS域的细胞因子，在机体内起着十分重要的作用[2]。
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一、EPAS1 的cDNA
从小鼠下丘脑细胞和HeLa细胞cDNA文库内分别克隆出小鼠和人的EPAS1全长cDNA序列。其中人的EPAS1cDNA开放阅读框有2607bp,编码869个氨基酸(约为96.5kD)，人的EPAS1基因位于第2号染色体上(2p16-21)[3]。小鼠EPAS1 cDNA开放阅读框为2622bp，编码874个氨基酸(97kD)，与人的EPAS1cDNA序列有88%的同源性，小鼠EPAS1基因位于第17号染色体上(17p4-5)[2]。而人的HIF-1α在14q21-24上，小鼠的HIF-1α在12号的染色体中,这表明:含bHLH-PAS域的转录因子超家族基因在基因组中非簇集在一起。人的EPAS1基因长约为120kb, 含有15个外显子和14个内含子，基因的5'-端部分有7个内含子，其位点与AHR基因5'-端部分内含子位点高度保守，而EPAS1基因的3'-端部分含有7个内含子,AHR只有1个内含子，这显示：bHLH-PAS超家族成员的基因3'-端序列进化较明显。
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二、EPAS1结构与功能的关系
分析小鼠的EPAS1蛋白序列发现：肽链N-端为碱性区(b)，接着是α-螺旋-环-α-螺旋区(HLH)、PAS等结构域。b区(aa5～27)能识别并能与DNA的特异性序列相结合；HLH域(aa28～77)负责亚基间相互聚合形成异二聚体；PAS域(aa96～344)含有两个重复子,两者都约由50个氨基酸残基组成，且都含有组氨酸-X-X-天冬氨酸序列，PAS能增加亚基间以及亚基与DNA的亲和作用。在EPAS1的C-端含有两个转录激活域TAD-N(aa517～682)和TAD-C(aa828～870)，在两者间还有一转录抑制域(ID，aa683～827)。在正常氧压条件下，TAD-N和TAD-C的转录活性被ID抑制，而在缺氧条件下，ID的抑制作用被解除，EPAS1的转录活性增大[4]。EPAS1与HIF-1α的氨基酸序列有48%的同源性，其中N-端序列(1～344)保守性较大，bHLH(84%同源)，PAS(66.5%同源)；而紧接的序列(345～559)中度保守(36.4%)；羧基端部分氨基酸序列变化较大,但C-末端序列(824～874)保守性较大(63%)。值得注意的是，EPAS1和HIF-1α碱性区(b)序列完全一致，这表明两者的DNA结合位点可能一致[5]。
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三、EPAS1的分布及表达调控
EPAS1mRNA在不同细胞系内含量变化较大。在血管内皮细胞、胎肺成纤维细胞系内含量较高，而在白细胞系内含量非常少[6]。缺氧能够明显提高胞内EPAS1蛋白质含量。缺氧诱导EPAS1蛋白质升高，主要积累于细胞核内。缺氧处理半小时后，核内EPAS1含量逐渐增大，2～4小时后，达到最大值，随后细胞恢复供氧，胞内EPAS1含量就迅速降低，15分钟后降低到基础水平。进一步研究发现：随着氧浓度的降低，细胞内EPAS1含量逐渐升高，5% O2处理能够诱导EPAS1含量开始升高，在3% O2或1% O2条件下细胞内EPAS1含量升高得更加明显。其机制可能是:在EPAS1蛋白质内存在有一依赖氧压的降解域,在正常氧压条件下,EPAS1蛋白质迅速降解,而缺氧能够提高其稳定性，使其含量升高。
EPAS1基因在人或小鼠的不同组织细胞内表达不同。在常压条件下EPAS1 mRNA在血管丰富的肺、心脏、胎盘等组织内含量很高，而在白细胞中却少有表达[7]。在小鼠胚胎内EPAS1几乎只在内皮细胞表达，如：体节间血管、心房、心室、腹主动脉等组织的内皮细胞。外胚胎膜细胞内亦含有较高量的EPAS1 mRNA。而HIF-1α在这些细胞内很少表达。另外，EPAS1和HIF-1α转录子在脐组织内分布也不同，EPAS1 mRNA在脐血管内皮细胞内含量较高，而HIF-1α在血管内皮细胞外周间质细胞内表达明显。十分有意义的是，EPAS mRNA在不同组织细胞内含量变化与血管内皮生长因子(VEGF) mRNA含量的变化十分吻合。在小鼠肺发育过程中EPAS1和VEGF在13.5～15.5天的胚胎中表达量都很低,而17.5天后两者的表达都明显增高,一直到发育成熟都保持较高水平,而HIF-1α在肺的发育过程中表达都不明显。这显示，EPAS1可能通过调节VEGF基因的表达，影响内皮细胞的分布和功能。
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研究表明，EPAS1能够与ARNT相互结合形成异二聚体,特异性结合在缺氧诱导基因的缺氧反应元件上(5'-TACGTGCG-3')，上调这些基因表达。缺氧、CoCl2、铁螯合剂(DFX)等处理都可以导致EPAS1-ARNT的活性增加5～10倍。蛋白酶体的抑制剂，N-乙酰-亮氨酸 -亮氨酸-正缬氨酸(NA-LLL)或N-苄氧羧基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-L-正缬氨酸(CBZ-LLL)能引起胞内EPAS1含量和活性的升高,还原性试剂(N-(2-巯基丙酰)-甘氨酸,NMPG)消除胞内活性氧的同时，促进EPAS1含量的提高。而过氧化氢(H2O2)处理细胞不仅可以导致正常氧压条件下的细胞内EPAS1含量的降低，而且还能抑制缺氧、CoCl2、DFX引起的EPAS1含量的升高。DPI(diphenylene iodonium)是黄素蛋白氧化还原酶的特异性抑制剂，处理细胞能够消除缺氧引起胞内EPAS1升高的作用，但对CoCl2、DFX的诱导作用影响很小。Tie-2、flk-1基因在内皮细胞内特异性表达，EPAS1能够诱导Tie-2、flk-1基因表达，而HIF-1α对这些基因表达没有影响[8]。这表明在缺氧条件下，EPAS1在维持内皮细胞内氧平衡过程中可能代替HIF-1α起着十分重要的作用。其信号传递途径可能为：对外界氧压变化敏感的感受体可能存在于内皮细胞的细胞膜上，是一种黄素蛋白氧化还原酶，在正常条件下，催化O2转变成H2O2，然后通过Fe2+依赖的Fenton反应，H2O2转化为OH.、OH-等，引起胞内活性氧含量升高，激活蛋白酶体的活性，使得EPAS1降解，导致EPAS1含量降低。同时，缺氧刺激还能够激活钙调蛋白敏感的信号通路，提高EPAS1的转录活性，其中MAPK起着十分重要的作用[9]。被激活的EPAS1能与胞内稳定表达的ARNT结合形成异二聚体,与缺氧诱导基因上的缺氧反应元件特异性结合,上调这些基因表达。
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四、EPAS1和HIF-1α的异同
缺氧是许多疾病过程中一个重要的病理生理因素，EPAS1和HIF-1α两种转录蛋白在缺氧引起的机体变化过程中都起着十分重要的作用，作为同一超家族的成员，它们的异同如下：
(一)相似点：(1) 两种转录因子具有相似的生化和转录激活特性。(2) 在缺氧条件下，两种蛋白质都快速增加，积累时间相似，而复氧后又都迅速降低。(3) 缺氧、CoCl2、DFX、抗氧化剂(NMPG)、蛋白酶体抑制剂等处理都能够引起胞内两种蛋白质含量的升高，而H2O2、DPI则导致两者含量的降低。
(二)不同点：(1) 在不同的组织细胞内，两种蛋白质含量不一样。一般地，在内皮细胞内EPAS1含量较 高，而HIF-1α主要存在于维管化低的组织细胞内；(2) 在能表达两种蛋白质的细胞内，正常氧压条件下，EPAS1含量比HIF-1α含量高;(3) 一方面，EPAS1和HIF-1α两种转录因子可能在不同的组织细胞内调节相同的基因表达，另一方面，在同一组织细胞内影响不同的基因表达。EPAS1是一种新发现的转录因子，它在机体内的作用、功能和病生理意义以及生成的调控机制都尚不清楚，值得进一步深入研究。
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国家自然科学基金重点资助项目(39730190)
参考文献
1，Gleadle JM, Ratcliffe PJ. Hypoxia and the regulation of gene expression .Mol Med Tod,1998,4∶122～129.
2，Tian H,Mcknight SL,Russell DW.Endothelia PAS domain protein (EPAS1),a transcription factor selectively expressed in endothelial cell.Genes Dev,1997，11∶72～82.
3，Ema M,Taya S,Yokotani N, et al. A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor-1α regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94∶4273～4278.
, 百拇医药
4，O'Rvurke JF,Tian YM，Rateliffe PJ，et al.Oxygen-regulated and transactivating domains in endothelial PAS protein 1:comparison with hypoxia inducible factor 1 alpha.J Biol Chem，1999，274∶2060～2071.
5，Flamme I,Frohlich T,Reutern M,et al.HRF,a putative basic helix -loop-helix-PAS-domain transcription factor is closely related to hypoxia-inducible factor 1α and developmentally expressed in blood vessels.Mech Dev,1997,63∶51～59.
6，Wiesener MS,Turley WE,Allen C,et al.Induction of endothelial PAS domain protein-1 by hypoxia :characterization comparison with hypoxia-inducible factor-1α.Blood,1998,92∶2260～2268.
7，Elert G,Lanz S,Kappel A，et al. mRNA cloning and expression studies of the quail homologue of HIF-2alpha.Mech Dev.1999，87∶193～197.
8，Conrad PW,Freeman TL,Beitner-Johnson D,et al.EPAS1 trans-activation during hypoxia requires p42/44 MAPK.J Biol Chem.1999,274∶33709～33713., 百拇医药
单位：军事医学科学院放射医学研究所, 北京100850
关键词：EPAS1；转录因子；内皮细胞
摘要 EPAS1是一种近年来被发现的转录蛋白摘要 EPAS1是一种近年来被发现的转录蛋白，主要存在于内皮细胞内。EPAS1能与芳香烃受体核转移蛋白(ARNT)一起形成异二聚体，调节一系列基因的转录和表达，维持机体正常的生长和发育。
学科分类号 Q473; Q71
含有碱性区-螺旋-环-螺旋-PAS(basic-helix-loop-helix-PER-AHR-SIM)结构域的转录因子超家族在机体生长发育过程中起着十分重要的作用。其中缺氧诱导因子1(HIF-1)存在于许多类型的细胞内，在缺氧条件下能上调促红细胞生成素(EPO)和糖酵解酶等基因的转录和表达,保持体内氧的稳态[1]。EPAS1(endothelia PAS domain protein1)是1997年由Tian等克隆出的一种含有bHLH-PAS域的细胞因子，在机体内起着十分重要的作用[2]。
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一、EPAS1 的cDNA
从小鼠下丘脑细胞和HeLa细胞cDNA文库内分别克隆出小鼠和人的EPAS1全长cDNA序列。其中人的EPAS1cDNA开放阅读框有2607bp,编码869个氨基酸(约为96.5kD)，人的EPAS1基因位于第2号染色体上(2p16-21)[3]。小鼠EPAS1 cDNA开放阅读框为2622bp，编码874个氨基酸(97kD)，与人的EPAS1cDNA序列有88%的同源性，小鼠EPAS1基因位于第17号染色体上(17p4-5)[2]。而人的HIF-1α在14q21-24上，小鼠的HIF-1α在12号的染色体中,这表明:含bHLH-PAS域的转录因子超家族基因在基因组中非簇集在一起。人的EPAS1基因长约为120kb, 含有15个外显子和14个内含子，基因的5'-端部分有7个内含子，其位点与AHR基因5'-端部分内含子位点高度保守，而EPAS1基因的3'-端部分含有7个内含子,AHR只有1个内含子，这显示：bHLH-PAS超家族成员的基因3'-端序列进化较明显。
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二、EPAS1结构与功能的关系
分析小鼠的EPAS1蛋白序列发现：肽链N-端为碱性区(b)，接着是α-螺旋-环-α-螺旋区(HLH)、PAS等结构域。b区(aa5～27)能识别并能与DNA的特异性序列相结合；HLH域(aa28～77)负责亚基间相互聚合形成异二聚体；PAS域(aa96～344)含有两个重复子,两者都约由50个氨基酸残基组成，且都含有组氨酸-X-X-天冬氨酸序列，PAS能增加亚基间以及亚基与DNA的亲和作用。在EPAS1的C-端含有两个转录激活域TAD-N(aa517～682)和TAD-C(aa828～870)，在两者间还有一转录抑制域(ID，aa683～827)。在正常氧压条件下，TAD-N和TAD-C的转录活性被ID抑制，而在缺氧条件下，ID的抑制作用被解除，EPAS1的转录活性增大[4]。EPAS1与HIF-1α的氨基酸序列有48%的同源性，其中N-端序列(1～344)保守性较大，bHLH(84%同源)，PAS(66.5%同源)；而紧接的序列(345～559)中度保守(36.4%)；羧基端部分氨基酸序列变化较大,但C-末端序列(824～874)保守性较大(63%)。值得注意的是，EPAS1和HIF-1α碱性区(b)序列完全一致，这表明两者的DNA结合位点可能一致[5]。
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三、EPAS1的分布及表达调控
EPAS1mRNA在不同细胞系内含量变化较大。在血管内皮细胞、胎肺成纤维细胞系内含量较高，而在白细胞系内含量非常少[6]。缺氧能够明显提高胞内EPAS1蛋白质含量。缺氧诱导EPAS1蛋白质升高，主要积累于细胞核内。缺氧处理半小时后，核内EPAS1含量逐渐增大，2～4小时后，达到最大值，随后细胞恢复供氧，胞内EPAS1含量就迅速降低，15分钟后降低到基础水平。进一步研究发现：随着氧浓度的降低，细胞内EPAS1含量逐渐升高，5% O2处理能够诱导EPAS1含量开始升高，在3% O2或1% O2条件下细胞内EPAS1含量升高得更加明显。其机制可能是:在EPAS1蛋白质内存在有一依赖氧压的降解域,在正常氧压条件下,EPAS1蛋白质迅速降解,而缺氧能够提高其稳定性，使其含量升高。
EPAS1基因在人或小鼠的不同组织细胞内表达不同。在常压条件下EPAS1 mRNA在血管丰富的肺、心脏、胎盘等组织内含量很高，而在白细胞中却少有表达[7]。在小鼠胚胎内EPAS1几乎只在内皮细胞表达，如：体节间血管、心房、心室、腹主动脉等组织的内皮细胞。外胚胎膜细胞内亦含有较高量的EPAS1 mRNA。而HIF-1α在这些细胞内很少表达。另外，EPAS1和HIF-1α转录子在脐组织内分布也不同，EPAS1 mRNA在脐血管内皮细胞内含量较高，而HIF-1α在血管内皮细胞外周间质细胞内表达明显。十分有意义的是，EPAS mRNA在不同组织细胞内含量变化与血管内皮生长因子(VEGF) mRNA含量的变化十分吻合。在小鼠肺发育过程中EPAS1和VEGF在13.5～15.5天的胚胎中表达量都很低,而17.5天后两者的表达都明显增高,一直到发育成熟都保持较高水平,而HIF-1α在肺的发育过程中表达都不明显。这显示，EPAS1可能通过调节VEGF基因的表达，影响内皮细胞的分布和功能。
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研究表明，EPAS1能够与ARNT相互结合形成异二聚体,特异性结合在缺氧诱导基因的缺氧反应元件上(5'-TACGTGCG-3')，上调这些基因表达。缺氧、CoCl2、铁螯合剂(DFX)等处理都可以导致EPAS1-ARNT的活性增加5～10倍。蛋白酶体的抑制剂，N-乙酰-亮氨酸 -亮氨酸-正缬氨酸(NA-LLL)或N-苄氧羧基-L-亮氨酸-L-亮氨酸-L-正缬氨酸(CBZ-LLL)能引起胞内EPAS1含量和活性的升高,还原性试剂(N-(2-巯基丙酰)-甘氨酸,NMPG)消除胞内活性氧的同时，促进EPAS1含量的提高。而过氧化氢(H2O2)处理细胞不仅可以导致正常氧压条件下的细胞内EPAS1含量的降低，而且还能抑制缺氧、CoCl2、DFX引起的EPAS1含量的升高。DPI(diphenylene iodonium)是黄素蛋白氧化还原酶的特异性抑制剂，处理细胞能够消除缺氧引起胞内EPAS1升高的作用，但对CoCl2、DFX的诱导作用影响很小。Tie-2、flk-1基因在内皮细胞内特异性表达，EPAS1能够诱导Tie-2、flk-1基因表达，而HIF-1α对这些基因表达没有影响[8]。这表明在缺氧条件下，EPAS1在维持内皮细胞内氧平衡过程中可能代替HIF-1α起着十分重要的作用。其信号传递途径可能为：对外界氧压变化敏感的感受体可能存在于内皮细胞的细胞膜上，是一种黄素蛋白氧化还原酶，在正常条件下，催化O2转变成H2O2，然后通过Fe2+依赖的Fenton反应，H2O2转化为OH.、OH-等，引起胞内活性氧含量升高，激活蛋白酶体的活性，使得EPAS1降解，导致EPAS1含量降低。同时，缺氧刺激还能够激活钙调蛋白敏感的信号通路，提高EPAS1的转录活性，其中MAPK起着十分重要的作用[9]。被激活的EPAS1能与胞内稳定表达的ARNT结合形成异二聚体,与缺氧诱导基因上的缺氧反应元件特异性结合,上调这些基因表达。
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四、EPAS1和HIF-1α的异同
缺氧是许多疾病过程中一个重要的病理生理因素，EPAS1和HIF-1α两种转录蛋白在缺氧引起的机体变化过程中都起着十分重要的作用，作为同一超家族的成员，它们的异同如下：
(一)相似点：(1) 两种转录因子具有相似的生化和转录激活特性。(2) 在缺氧条件下，两种蛋白质都快速增加，积累时间相似，而复氧后又都迅速降低。(3) 缺氧、CoCl2、DFX、抗氧化剂(NMPG)、蛋白酶体抑制剂等处理都能够引起胞内两种蛋白质含量的升高，而H2O2、DPI则导致两者含量的降低。
(二)不同点：(1) 在不同的组织细胞内，两种蛋白质含量不一样。一般地，在内皮细胞内EPAS1含量较 高，而HIF-1α主要存在于维管化低的组织细胞内；(2) 在能表达两种蛋白质的细胞内，正常氧压条件下，EPAS1含量比HIF-1α含量高;(3) 一方面，EPAS1和HIF-1α两种转录因子可能在不同的组织细胞内调节相同的基因表达，另一方面，在同一组织细胞内影响不同的基因表达。EPAS1是一种新发现的转录因子，它在机体内的作用、功能和病生理意义以及生成的调控机制都尚不清楚，值得进一步深入研究。
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参考文献
1，Gleadle JM, Ratcliffe PJ. Hypoxia and the regulation of gene expression .Mol Med Tod,1998,4∶122～129.
2，Tian H,Mcknight SL,Russell DW.Endothelia PAS domain protein (EPAS1),a transcription factor selectively expressed in endothelial cell.Genes Dev,1997，11∶72～82.
3，Ema M,Taya S,Yokotani N, et al. A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor-1α regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94∶4273～4278.
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4，O'Rvurke JF,Tian YM，Rateliffe PJ，et al.Oxygen-regulated and transactivating domains in endothelial PAS protein 1:comparison with hypoxia inducible factor 1 alpha.J Biol Chem，1999，274∶2060～2071.
5，Flamme I,Frohlich T,Reutern M,et al.HRF,a putative basic helix -loop-helix-PAS-domain transcription factor is closely related to hypoxia-inducible factor 1α and developmentally expressed in blood vessels.Mech Dev,1997,63∶51～59.
6，Wiesener MS,Turley WE,Allen C,et al.Induction of endothelial PAS domain protein-1 by hypoxia :characterization comparison with hypoxia-inducible factor-1α.Blood,1998,92∶2260～2268.
7，Elert G,Lanz S,Kappel A，et al. mRNA cloning and expression studies of the quail homologue of HIF-2alpha.Mech Dev.1999，87∶193～197.
8，Conrad PW,Freeman TL,Beitner-Johnson D,et al.EPAS1 trans-activation during hypoxia requires p42/44 MAPK.J Biol Chem.1999,274∶33709～33713., 百拇医药