Wilms肿瘤基因反义寡苷酸对白血病细胞凋亡的影响
作者：吴晓雄 汪月增 裴雪涛 楼方定 张伯龙 王立生 徐黎
单位：吴晓雄 汪月增 楼方定 张伯龙(解放军总医院血液科，北京 100853)；裴雪涛 王立生 徐黎(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
关键词：白血病；反义寡核苷酸；Wilms’肿瘤基因；凋亡
军医进修学院学报000210 【摘要】目的：了解Wilms肿瘤基因(WT1)反义寡核苷酸(ASO)对白血病细胞凋亡的作用。方法：应用WT1 ASO以及足叶乙甙(VP-16)作用K562、HL-60细胞系，然后应用流式细胞仪测定DNA含量以确定白血病细胞的凋亡数。结果：K562细胞系经WT1 ASO作用24 h和60 h后细胞凋亡数分别为14.6%和26.8%；而WT1有义寡核苷酸(SO)组分别为3.1%(24 h)和3.9%(60h)；加入少量VP-16后凋亡数达到37.2%(24 h)和66.6%(60 h)。HL-60细胞经WT1 ASO作用24 h及60 h后细胞凋亡数无明显增高，但作用60 h后与VP-16联合作用，细胞凋亡可达34.7%，大于单用VP-16(13.7%)及VP-16+SO(15.4%)诱导的细胞凋亡数。结论：WT1 ASO可以导致K562细胞凋亡并可提高白血病细胞对VP-16的敏感性。WT1基因与白血病细胞的凋亡有关，其在不同细胞中所发挥的作用不同。
, http://www.100md.com
中图号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0111-03
Effect of WT1 antisense oligonucleotide on apoptosis of leukemic cells
WU Xiao-xiong,WANG Yue-zeng,PEI Xue-tao,LOU Fang-ding,ZHANG Bo-long,WANG Li-sheng,XU Li
(Department of Hematology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:To elucidate the effect of WT1 antisense oligonuclenotide (WT1 ASO) on apoptosis of leukemia cells and the role of WT1 gene in apoptosis of leukemia cells.Methods:K562,HL-60 cells were treated with WT1 ASO and VP-16.Then apoptosis was quantified by flow cytometric analysis assay.Results:WT1 ASO could induce apoptosis of k562 cells and the level of apoptosis increased markedly when combined with VP-16;WT1 ASO alone couldn't induce apoptosis of HL-60 cells,but it could also increase the level of apoptosis of HL-60 cells when combined with VP-16.Conclusion:WT1 ASO could increase the susceptibility of leukemia cells to VP-16 and WT1 gene may play a role in apoptosis of leukemic cells and the rule in different cells is variable,which is influenced by the type of cell.
, 百拇医药
Key words:leukemia;antisense oligonucleotide;Wilm's tumor gene;apoptosis
细胞凋亡是一种不同于坏死并且受基因调控的主动性细胞消亡的过程，也是许多抗癌药物的重要效应机制之一[1]。Wilms肿瘤基因(Wilms tumor gene,WT1)位于染色体 11P1 3，编码一个能够与DNA特异结合的转录调控蛋白，能够与许多和细胞凋亡有关的基因相互作用[2]。实验证明 WT1 在肾间质细胞的凋亡中起重要作用[3]。为了解 WT1 在白血病细胞凋亡中的作用，本研究应用 WT1 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)及足叶乙甙(VP-16)处理 K562 及 HL-60 白血病细胞系，然后检测其凋亡率。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 研究对象 白血病细胞系：K562、HL-60 细胞系于 RPMI1640 全培养液中(含 15% FCS)，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，平均 2～3 d 换液 1 次；取倍增期细胞进行实验。
1.2 寡核苷酸合成 由军事医学科学院合成，其序列为[4]：
WT1反义链：5′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3′
WT1有义链：5′-CAGCAAATGGGCTCCGAC-3′
该反义链与WT1转录体翻译起始序列互补，每个碱基均经硫代修饰。
1.3 WT1反义寡核苷酸处理细胞 取倍增期白血病细胞系培养于 RPMI1640 培养液中，调整细胞浓度为 1×105 /ml，接种于 24 孔培养板，加入WT1 ASO(终浓度为 120 μg/ml)，37 ℃、 5% CO2 的培养箱中培养， 2 h 后加入人AB血清 5%，然后继续培养，每隔 24 h 加入WT1 ASO 60 μg/ml；作用一定时间后，加入凋亡诱导剂 VP-16 (10 μg/ml) 诱导 12 h；最后在FCM上测定细胞凋亡。同时设 WT1 有义寡核苷酸(sense oligonucleotide,SO)组及对照组。
, 百拇医药
1.4 细胞凋亡的测定[5] 取 WT1 ASO 处理后的细胞经PBS洗 2 次， 70% 的冷乙醇 4 ℃ 固定 24 h；然后用PBS洗去乙醇，加入RNA酶(终浓度 50 μg/ml)，37 ℃ 30 min；再加入碘化丙啶(PI，终浓度 50 μg/ml)，4 ℃ 60 min，PBS洗 2 次，最后在流式细胞仪上测定细胞凋亡，低于 G0/G1 期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
2 结 果
2.1 WT1 反义寡核苷酸对 K562 细胞凋亡的影响 WT1 ASO处理 K562 细胞 24 h 后，细胞凋亡数达 14.6%，而对照组和SO组细胞凋亡数只有 2.3% 和 3.1%；ASO+VP-16 组细胞凋亡达到 37.2%，高于SO+VP-16 组及VP-16 组(分别为 12.8% 和 9.4%)；当WT1 ASO作用 K562 细胞 60 h，ASO诱导的凋亡细胞达到 26.8%，而对照组及SO组并无明显诱导凋亡的作用(分别为 3.2% 和 3.9%)；ASO+VP-16 组细胞凋亡数达 66.6%，明显高于SO+VP-16 组及VP-16 组(分别为 11.9% 和 12.1%)。由此可见 WT1 ASO 可以引起 K562 细胞凋亡并可提高 K562 对凋亡诱导剂 VP-16 的敏感性(图 1)。
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图1 WT1反义寡核苷酸及VP-16作用不同
时间对K562细胞凋亡的影响
2.2 WT1 反义寡核苷酸对HL-60 细胞凋亡的作用 WT1 ASO处理HL-60 细胞 24 h 后细胞凋亡数为 3.8%，与WT1 SO组及对照组相似(分别是 4.1% 和 2.6%)；VP-16(10 μg/ml)组细胞凋亡为 14.5%，VP-16+SO组及VP-16+ASO组细胞凋亡分别为 16.1% 和 19.6%。当WT1 ASO作用HL-60 细胞 60 h，ASO诱导的凋亡细胞为 4.3%，与对照组及SO组并无明显差别(分别为 3.6% 和 3.2%)；VP-16(10 μg/ml)组细胞凋亡为 13.7%，ASO+VP-16(10 μg/ml)细胞凋亡数达 34.7%，大于SO+VP-16 组(15.4%)及单用VP-16 组引起的凋亡数。WT1 ASO本身不引起HL-60 细胞凋亡；但作用 60 h 后也可轻度提高HL-60 细胞对VP-16 的敏感性(图 2)。
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图2 WT1反义寡核苷酸及VP-16作用不同
时间对HL60 细胞凋亡的影响
3 讨 论
凋亡作为一种基因调节的主动的生理性细胞死亡方式，受多种基因的调控。如果其调控机制紊乱，不仅涉及造血细胞的癌变，而且使白血病细胞对多种药物产生耐药性[1，6]。随着对白血病细胞凋亡的基因调节和生物过程的了解，人们有可能人为调控白血病细胞的凋亡从而对白血病的治疗产生深刻的影响。
WT1 基因编码一个能够与DNA特异结合的转录调控蛋白，与许多参与造血细胞生长、分化及凋亡的基因相互作用[2]。本实验结果提示WT1 ASO可以引起 K562 细胞凋亡，结合小量VP-16 (10 μg/ml) 后可以明显提高 K562 细胞的调亡率。WT1 ASO处理HL-60 细胞 24 h 和 60 h，均未引起明显的凋亡率。接近SO组及对照组。HL-60 细胞经WT1 ASO 处理 60 h 后加入小剂量VP-16(10 μg/ml)可以增加细胞凋亡，明显大于单独应用VP-16 引起的凋亡。表明WT1 ASO自身不引起HL-60 细胞的凋亡，但结合VP-16 也可以轻度提高HL-60 细胞对VP-16 的敏感性。
, 百拇医药
细胞凋亡受多种因素的影响，即使在同一类型细胞，凋亡的途径也可能不尽相同。WT1 基因本身也许并不直接参与凋亡或者参与凋亡的作用很弱，可能是通过其他与凋亡有关的基因来诱导白血病细胞的凋亡。WT1 和 P53、bcl-2、c-myc等许多与细胞增殖、凋亡有关的基因相互作用[2]。实验证明，WT1 可以稳定 p53 基因，抑制其介导的由UV辐射引起的凋亡，也可直接抑制凋亡[8]。Bcl-2 是细胞抗凋亡基因，其第 2 个外显子内有一个完整的 WT1/EGR的结合位点， WT1 可以通过上调 bcl-2 的表达抑制细胞的凋亡。另外 WT1 有抑制c-myc促凋亡基因的功能，可能通过抑制c-myc的转录而抑制凋亡[2，7]。
总之，WT1ASO可以引起 K562 细胞的凋亡，并可提高白血病细胞对凋亡诱导剂VP-16 的敏感性；WT1 可能通过直接或间接作用与白血病细胞的凋亡相关，并在不同细胞中所起的作用不同[7]。因此 WT1 固有的特性不仅仅是激活或抑制转录，它可能在维持细胞增殖和凋亡之间的平衡上起一定作用。关于其在白血病细胞凋亡中的具体机制尚有待进一步研究。
, http://www.100md.com
作者简介：吴晓雄，男，1963-07-11生，甘肃省兰州市人，汉族，1998年军医进修学院博士毕业，解放军总医院血液科主治医师；发表论文12篇。电话：(010)66937073
参考文献
1，Dive C.Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance[J].J intern Med Suppl,1997,740(1):139-145.
2，Hewitt SM,Hamada S,McDonnell TJ et al.Regulation of the pro-onco genes bcl-2 and c-myc by the Wilms' tumor supressor gene WT1[J].Cancer Res,1995,55(22):5386-5389.
, 百拇医药
3，Kreidberg JA,Sariola H,Loring JM et al.WT1 is required for early kidney devel opment[J].Cell,1993,74(4):679-691.
4，Haber DA,Sohn RL,Buckler AJ.Alternative splicing and genomic structure of the Wilms'tumor gene WT1[J].Proc Nat1 Acad Sci USA,1991,88(21):9618-9622.
5，Darzynkiewicz Z,Bruno S,Del-Bino G et al.Features of apoptotic cells measureed by flow cytometry[J].Cytometry,1992,13(8):795-808.
, http://www.100md.com 6，Miyashita T,Reed JC.Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line[J].Blood,1993,81(1):151-157.
7，Algar EM,Khromykh T,Smith SI et al.A WT1 antisense oligonucleotide inhibits proliferation and induces apoptosis in myeoloid leukemia cell lines[J].Oncogene,1996,12(5):1005-1014.
8，Maheswaran S Englert C,Bennett P et al.The WT1 gene product stabilizes P53 and inhibits P53-mediated apoptosis[J].Gene and Develop,1995,9(17):2143-2156.
收稿日期：1999-08-18
修回日期：1999-09-20, 百拇医药
单位：吴晓雄 汪月增 楼方定 张伯龙(解放军总医院血液科，北京 100853)；裴雪涛 王立生 徐黎(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
关键词：白血病；反义寡核苷酸；Wilms’肿瘤基因；凋亡
军医进修学院学报000210 【摘要】目的：了解Wilms肿瘤基因(WT1)反义寡核苷酸(ASO)对白血病细胞凋亡的作用。方法：应用WT1 ASO以及足叶乙甙(VP-16)作用K562、HL-60细胞系，然后应用流式细胞仪测定DNA含量以确定白血病细胞的凋亡数。结果：K562细胞系经WT1 ASO作用24 h和60 h后细胞凋亡数分别为14.6%和26.8%；而WT1有义寡核苷酸(SO)组分别为3.1%(24 h)和3.9%(60h)；加入少量VP-16后凋亡数达到37.2%(24 h)和66.6%(60 h)。HL-60细胞经WT1 ASO作用24 h及60 h后细胞凋亡数无明显增高，但作用60 h后与VP-16联合作用，细胞凋亡可达34.7%，大于单用VP-16(13.7%)及VP-16+SO(15.4%)诱导的细胞凋亡数。结论：WT1 ASO可以导致K562细胞凋亡并可提高白血病细胞对VP-16的敏感性。WT1基因与白血病细胞的凋亡有关，其在不同细胞中所发挥的作用不同。
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中图号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0111-03
Effect of WT1 antisense oligonucleotide on apoptosis of leukemic cells
WU Xiao-xiong,WANG Yue-zeng,PEI Xue-tao,LOU Fang-ding,ZHANG Bo-long,WANG Li-sheng,XU Li
(Department of Hematology,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:To elucidate the effect of WT1 antisense oligonuclenotide (WT1 ASO) on apoptosis of leukemia cells and the role of WT1 gene in apoptosis of leukemia cells.Methods:K562,HL-60 cells were treated with WT1 ASO and VP-16.Then apoptosis was quantified by flow cytometric analysis assay.Results:WT1 ASO could induce apoptosis of k562 cells and the level of apoptosis increased markedly when combined with VP-16;WT1 ASO alone couldn't induce apoptosis of HL-60 cells,but it could also increase the level of apoptosis of HL-60 cells when combined with VP-16.Conclusion:WT1 ASO could increase the susceptibility of leukemia cells to VP-16 and WT1 gene may play a role in apoptosis of leukemic cells and the rule in different cells is variable,which is influenced by the type of cell.
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Key words:leukemia;antisense oligonucleotide;Wilm's tumor gene;apoptosis
细胞凋亡是一种不同于坏死并且受基因调控的主动性细胞消亡的过程，也是许多抗癌药物的重要效应机制之一[1]。Wilms肿瘤基因(Wilms tumor gene,WT1)位于染色体 11P1 3，编码一个能够与DNA特异结合的转录调控蛋白，能够与许多和细胞凋亡有关的基因相互作用[2]。实验证明 WT1 在肾间质细胞的凋亡中起重要作用[3]。为了解 WT1 在白血病细胞凋亡中的作用，本研究应用 WT1 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)及足叶乙甙(VP-16)处理 K562 及 HL-60 白血病细胞系，然后检测其凋亡率。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 研究对象 白血病细胞系：K562、HL-60 细胞系于 RPMI1640 全培养液中(含 15% FCS)，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，平均 2～3 d 换液 1 次；取倍增期细胞进行实验。
1.2 寡核苷酸合成 由军事医学科学院合成，其序列为[4]：
WT1反义链：5′-GTCGGAGCCCATTTGCTG-3′
WT1有义链：5′-CAGCAAATGGGCTCCGAC-3′
该反义链与WT1转录体翻译起始序列互补，每个碱基均经硫代修饰。
1.3 WT1反义寡核苷酸处理细胞 取倍增期白血病细胞系培养于 RPMI1640 培养液中，调整细胞浓度为 1×105 /ml，接种于 24 孔培养板，加入WT1 ASO(终浓度为 120 μg/ml)，37 ℃、 5% CO2 的培养箱中培养， 2 h 后加入人AB血清 5%，然后继续培养，每隔 24 h 加入WT1 ASO 60 μg/ml；作用一定时间后，加入凋亡诱导剂 VP-16 (10 μg/ml) 诱导 12 h；最后在FCM上测定细胞凋亡。同时设 WT1 有义寡核苷酸(sense oligonucleotide,SO)组及对照组。
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1.4 细胞凋亡的测定[5] 取 WT1 ASO 处理后的细胞经PBS洗 2 次， 70% 的冷乙醇 4 ℃ 固定 24 h；然后用PBS洗去乙醇，加入RNA酶(终浓度 50 μg/ml)，37 ℃ 30 min；再加入碘化丙啶(PI，终浓度 50 μg/ml)，4 ℃ 60 min，PBS洗 2 次，最后在流式细胞仪上测定细胞凋亡，低于 G0/G1 期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
2 结 果
2.1 WT1 反义寡核苷酸对 K562 细胞凋亡的影响 WT1 ASO处理 K562 细胞 24 h 后，细胞凋亡数达 14.6%，而对照组和SO组细胞凋亡数只有 2.3% 和 3.1%；ASO+VP-16 组细胞凋亡达到 37.2%，高于SO+VP-16 组及VP-16 组(分别为 12.8% 和 9.4%)；当WT1 ASO作用 K562 细胞 60 h，ASO诱导的凋亡细胞达到 26.8%，而对照组及SO组并无明显诱导凋亡的作用(分别为 3.2% 和 3.9%)；ASO+VP-16 组细胞凋亡数达 66.6%，明显高于SO+VP-16 组及VP-16 组(分别为 11.9% 和 12.1%)。由此可见 WT1 ASO 可以引起 K562 细胞凋亡并可提高 K562 对凋亡诱导剂 VP-16 的敏感性(图 1)。
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图1 WT1反义寡核苷酸及VP-16作用不同
时间对K562细胞凋亡的影响
2.2 WT1 反义寡核苷酸对HL-60 细胞凋亡的作用 WT1 ASO处理HL-60 细胞 24 h 后细胞凋亡数为 3.8%，与WT1 SO组及对照组相似(分别是 4.1% 和 2.6%)；VP-16(10 μg/ml)组细胞凋亡为 14.5%，VP-16+SO组及VP-16+ASO组细胞凋亡分别为 16.1% 和 19.6%。当WT1 ASO作用HL-60 细胞 60 h，ASO诱导的凋亡细胞为 4.3%，与对照组及SO组并无明显差别(分别为 3.6% 和 3.2%)；VP-16(10 μg/ml)组细胞凋亡为 13.7%，ASO+VP-16(10 μg/ml)细胞凋亡数达 34.7%，大于SO+VP-16 组(15.4%)及单用VP-16 组引起的凋亡数。WT1 ASO本身不引起HL-60 细胞凋亡；但作用 60 h 后也可轻度提高HL-60 细胞对VP-16 的敏感性(图 2)。
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图2 WT1反义寡核苷酸及VP-16作用不同
时间对HL60 细胞凋亡的影响
3 讨 论
凋亡作为一种基因调节的主动的生理性细胞死亡方式，受多种基因的调控。如果其调控机制紊乱，不仅涉及造血细胞的癌变，而且使白血病细胞对多种药物产生耐药性[1，6]。随着对白血病细胞凋亡的基因调节和生物过程的了解，人们有可能人为调控白血病细胞的凋亡从而对白血病的治疗产生深刻的影响。
WT1 基因编码一个能够与DNA特异结合的转录调控蛋白，与许多参与造血细胞生长、分化及凋亡的基因相互作用[2]。本实验结果提示WT1 ASO可以引起 K562 细胞凋亡，结合小量VP-16 (10 μg/ml) 后可以明显提高 K562 细胞的调亡率。WT1 ASO处理HL-60 细胞 24 h 和 60 h，均未引起明显的凋亡率。接近SO组及对照组。HL-60 细胞经WT1 ASO 处理 60 h 后加入小剂量VP-16(10 μg/ml)可以增加细胞凋亡，明显大于单独应用VP-16 引起的凋亡。表明WT1 ASO自身不引起HL-60 细胞的凋亡，但结合VP-16 也可以轻度提高HL-60 细胞对VP-16 的敏感性。
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细胞凋亡受多种因素的影响，即使在同一类型细胞，凋亡的途径也可能不尽相同。WT1 基因本身也许并不直接参与凋亡或者参与凋亡的作用很弱，可能是通过其他与凋亡有关的基因来诱导白血病细胞的凋亡。WT1 和 P53、bcl-2、c-myc等许多与细胞增殖、凋亡有关的基因相互作用[2]。实验证明，WT1 可以稳定 p53 基因，抑制其介导的由UV辐射引起的凋亡，也可直接抑制凋亡[8]。Bcl-2 是细胞抗凋亡基因，其第 2 个外显子内有一个完整的 WT1/EGR的结合位点， WT1 可以通过上调 bcl-2 的表达抑制细胞的凋亡。另外 WT1 有抑制c-myc促凋亡基因的功能，可能通过抑制c-myc的转录而抑制凋亡[2，7]。
总之，WT1ASO可以引起 K562 细胞的凋亡，并可提高白血病细胞对凋亡诱导剂VP-16 的敏感性；WT1 可能通过直接或间接作用与白血病细胞的凋亡相关，并在不同细胞中所起的作用不同[7]。因此 WT1 固有的特性不仅仅是激活或抑制转录，它可能在维持细胞增殖和凋亡之间的平衡上起一定作用。关于其在白血病细胞凋亡中的具体机制尚有待进一步研究。
, http://www.100md.com
作者简介：吴晓雄，男，1963-07-11生，甘肃省兰州市人，汉族，1998年军医进修学院博士毕业，解放军总医院血液科主治医师；发表论文12篇。电话：(010)66937073
参考文献
1，Dive C.Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance[J].J intern Med Suppl,1997,740(1):139-145.
2，Hewitt SM,Hamada S,McDonnell TJ et al.Regulation of the pro-onco genes bcl-2 and c-myc by the Wilms' tumor supressor gene WT1[J].Cancer Res,1995,55(22):5386-5389.
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3，Kreidberg JA,Sariola H,Loring JM et al.WT1 is required for early kidney devel opment[J].Cell,1993,74(4):679-691.
4，Haber DA,Sohn RL,Buckler AJ.Alternative splicing and genomic structure of the Wilms'tumor gene WT1[J].Proc Nat1 Acad Sci USA,1991,88(21):9618-9622.
5，Darzynkiewicz Z,Bruno S,Del-Bino G et al.Features of apoptotic cells measureed by flow cytometry[J].Cytometry,1992,13(8):795-808.
, http://www.100md.com 6，Miyashita T,Reed JC.Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line[J].Blood,1993,81(1):151-157.
7，Algar EM,Khromykh T,Smith SI et al.A WT1 antisense oligonucleotide inhibits proliferation and induces apoptosis in myeoloid leukemia cell lines[J].Oncogene,1996,12(5):1005-1014.
8，Maheswaran S Englert C,Bennett P et al.The WT1 gene product stabilizes P53 and inhibits P53-mediated apoptosis[J].Gene and Develop,1995,9(17):2143-2156.
收稿日期：1999-08-18
修回日期：1999-09-20, 百拇医药