氯丙烯对鸡胚脑神经细胞钙稳态与能量合成影响的研究
http://www.100md.com
山东医科大学学报 2000年第1期第38卷 论著
作者：赵 丽 谢克勤 厉保秋 孙克任
单位：山东医科大学毒理学省级重点实验室
关键词：氯丙烯；神经元；钙；能量代谢；鸡胚
山东医科大学000114
摘 要：进一步研究氯丙烯的中毒机理，探讨氯丙烯对神经细胞内钙稳态与能量合成的影响。方法:用Fura-2/AM、电子探针X线微区分析、ATP生物发光分析等方法测定氯丙烯染毒后鸡胚脑神经细胞内游离Ca2+、钙百分含量及ATP、ADP、AMP含量的改变。 结果：随着氯丙烯浓度的增加，细胞内游离Ca2+浓度、钙百分含量明显增加(P<0.01)；细胞内ATP、ADP、AMP含量明显减低，细胞外ADP、AMP含量明显增高(P<0.01)。结论：氯丙烯可引起神经细胞内Ca增加和ATP合成减少，氯丙烯引起的细胞内Ca稳态失调可能与能量合成减少有关。
, http://www.100md.com
分类号：R994.3 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)01-0041-03
STUDY OF THE ACTION OF ALLYL CHLORIDE ON CALCIUM HOMEOSTASIS AND ENERGY SYNTHESIS IN CHICKEN EMBRYO BRAIN CELLS
ZHAO Li ,XIE Ke-qin ,ZHANG Min
(Institute of Toxicology, Shandong Medical University)
Abstract：To research the poisoning mechanisms of allyl chloride and probe into the action of allyl chloride on calcium homeostasis and energy synthesis in brain cells. Methods: Contents of Ca, ATP,ADP, AMP were studied tn allyl chloride-induced chicken embryo brain cells with the methods of fluorescence molecular probe Fura-2/AM, electron probe X-ray microanalysis (EXMA)and ATP bioluminescence analysis.Results: With the increase of allyl chloride, the contents of Ca2+ increased significantly (P<0.01), while the contents of ATP, ADP, AMP markedly decreased (P<0.01). Conclusion: The results suggested that allyl chloride can increase the concents of calicium and decrease energy synthese in nerve cells. Inhibition of energy synthesis in duced by allyl chloride in nerve cells might be one of the mechanisms of calcium unhomeostasis.
, 百拇医药
Keywords：Allyl chloride; Neurons; Calcium; Energy metabolism; Chickens 我国自70年代起发现长期接触低密度氯丙烯(allylchloride，AC)可引起对称性轴突变性型周围神经病[1,2]。动物和离体细胞超微病理结构观察，除发现神经轴浆内微管和神经丝改变以外，还伴有线粒体明显增多，少部分可见嵴脱落呈空泡变性[3,4]。近年研究发现神经病理改变与细胞内钙增高有关[5]。为进一步研究氯丙烯的中毒机理，我们用Fu-ra-2/AM、电子探针X线微区分析、ATP生物发光分析等方法测定氯丙烯染毒后鸡胚脑神经细胞内游离Ca2+、钙百分含量及ATP、ADP、AMP含量的改变，探讨氯丙烯引起的细胞内钙稳态失调与细胞线粒体能量合成代谢之间的关系。1材料与方法1.1试剂AC由上海试剂一厂生产。Fura-2/AM、荧光素-荧光素酶、ATP、ADP、AMP均购于Sigma公司。1.2鸡胚脑神经细胞原代培养见文献6。1.3鸡胚脑神经细胞内游离ca2+([Ca2+]i)测定取培养5～7d的鸡胚脑神经细胞，加入AC，终浓度依次为40.7，81.2，161.3，318.4mmol/L，同时设阴性对照。测定方法见文献7。1.4鸡胚脑神经细胞内钙百分含量测定取培养5～7d的鸡胚脑神经细胞，加入AC，氯丙烯终浓度依次为1.225，2.45mmol/L，同时设阴性对照。测定方法见文献5。1.5鸡胚发光分析法。取培养5～7d的鸡胚脑神经细胞，加入AC，终浓度依次为0.613，1.225，2.45mmol/L，同时设阴性对照。24h后，细胞反复冻融3次，使细胞破碎，加生理盐水到lml，取0.2ml于0.5cm比色杯中，放入发光暗室，然后注入0.8ml荧光素-荧光素酶溶液，立即用FG-300发光光度计记录发光强度，查ATP标准曲线计算样品ATP含量。1.6细胞内和细胞外ADP和AMP含量测定氯丙烯染毒浓度及时间同ATP含量测定，弃培养液后加入0.2ml5mol/LHClO,用吸管吹打混匀，放置4℃2h。然后移入卡巴氏管20000Xg4C离心10min。以上清液20ul进样，用高压液相色谱仪测定细胞内ADP和AMP含量。细胞外测定直接取培养液20ul进样。测定方法见文献8。1.7数据处理所有数据均经PEMS统计软件包进行方差、直线相关分析。2结果2.1鸡胚脑神经细胞内[Ca2+]i的改变见表1。表l鸡胚脑神经细胞内[Ca2+]i的浓度(n＝4,x=s)·P<0.OlvsOmmol·L-1由表1可见，随着AC浓度的增加，[Ca2-]i明显升高,且有显著的剂量效应关系(r=0.9958，P<0.01)。2.2鸡胚脑神经细胞内钙百分含量改变鸡胚脑神经细胞内Ca百分含量，AC0,1.225，2.450mmol/L组分别为(0.08±0.05)%，(0.32土O.031)%，(0.42土0.14)%，随着氯丙烯浓度的增加，钙百分含量明显增加(P<0.01)，在2.45mm01/L氯丙烯染毒的鸡胚脑神经细胞内，与对照相比，钙增加了525%。2.3鸡胚脑神经细胞内外ATP、ADP和AMP含量改变2.3.1鸡胚脑神经细胞内ATP、ADP和AMP含量改变见表2。表2鸡胚脑神经细胞内ATP、ADP和AMP含量(n＝8,x±s)·P<0.01vsOmmol·L-1由表2可见，随着氯丙烯浓度增高，细胞内ATP含量与对照组相比，中、高剂量组分别减少了75.2%和93.3%，有明显的统计学差异(P<0.01)；对ADP、AMP含量的影响高剂量组与对照组相比则明显减少(P<0.01)，分别减少了66.3%和52.2%。2.3.2鸡胚脑神经细胞外AnP和AMP含量改变见表3。表3鸡胚脑神经细胞外ADP和AMP含量改变·P<0.05··P<0.OlvsOmmol·L-13讨论正常生理情况下，细胞外Ca2+浓度在l0-3～10-2M，胞外内Ca2+浓度为l0-8～10-6M。细胞内Ca2+以结合和游离两种形式不均匀地分布在细胞核、细胞浆和其他细胞器内，由于线粒体和内质网中Ca2+含量为10-3M，与胞外Ca2+含量相同，因此又把线粒体和内质网视为细胞内Ca2-的主要贮存库-Ca2+库。当细胞活动时，Ca2+库释放Ca2+。胞外Ca2+跨膜进入以增加Ca2+浓度；安静时，胞浆内Ca2+进入Ca2+库和跨膜外流以减少细胞内Ca2+水平，达到稳态平衡；胞浆内Ca2+稳态平衡主要是靠胞膜上的Ca2+通道、Ca2+-ATPase、Na+-Ca2+交换器调节，另外，内质网、线粒体膜上也有Ca2+通道、Ca2+-ATPase、Ca2+单一运送器，Na+-Ca2+交换系统使Ca2+进出细胞内钙库[9]。Ca2+通道是细胞外Ca2+进入细胞内的主要方式，神经细胞膜的Ca2+通道主要是电压依赖性通道，它受膜电位的影响，膜内Ca2+跨膜外流主要靠Ca2+-ATPase和Na+-Ca2+交换器调节。Na+-Ca2+交换器是一种膜结合蛋白，具有低亲和力高容量的特点，大量的Ca2+需要Na+-Ca2-交换器排出细胞，Na+-Ca2+交换器需要间接消耗能量，它的交换动力主要也是来自膜电位，而膜电位的维持靠Na+-K+泵，Na+-K+泵需要消耗大量能量来维持细胞膜电位，这是一个主动运输过程，细胞能量约1/3以上被用到运输Na+和K+。Ca2+-ATPase直接消耗ATP进行Ca2+的逆浓度转运,因此，能量合成降低可影响膜电位的维持，导致钙通道、Na+-Ca2+交换器Ca2+-ATPase的功能下降，引起Ca2+稳态失调，使细胞内Ca2+增高[10]。我们研究结果与之相符，随着氯丙烯浓度的增高,胞内ATP、AMP、ADP明显减少，而Ca2+明显增高，提示氯丙烯引起的细胞内ca2+增加与细胞能量合成受抑有关。这可能是由于ATP供应缺乏，Na+/K+泵不能维持正常细胞膜电位，导致Ca2+通道、Ca2+-ATPase、Na+-Ca2+交换器功能受损,引起细胞内Ca2+增高。因此，细胞能量合成受抑是氯丙烯引起细胞内钙稳态失调的原因之一。至于滞留的Ca2+是否也直接影响线粒体能量合成需要进一步探讨。
, http://www.100md.com
基金项目：山东省自然科学基金资助课题
参考文献：
[1]山东省人民医院职业病科，等.环氧氯丙烷生产中中毒性神经炎的研究[J].卫生研究，1976，5(6)：463
[2]中国医学科学院卫生研究所临床研究室，中国人民解放军总医院脑系科肌电图室.慢性氯丙烯中毒引起多发性神经病的临床研究[J].中华医学杂志，1980,60(12):746
[3]孙克任，于丽华，杨东昌，等.关于氯丙烯对周围神经纤维超微结构影响的研究[J].中华劳动卫生与职业病杂志，1986，4(3):174
[4]Xie KQ，Sun KR，Gao SJ，et aL Mechanism of allyl chlorideinduced cytoskeletal injury to nerve cells[J].Chin Med J，1998，111(6):556
, 百拇医药
[5]谢克勤，高树君，张磊，等.电子探针x线微区分析1-烯丙基氯-3引起神经组织内Na、K、ca等元素的改变[J].山东医科大学学报,1996，34(3)：269
[6]赵林普，肖定华，陈士英,人，大鼠，鸡等胚胎脑细胞的分离培养及生长分化[J].解剖学杂志，1985,8(5):269
[7]谢克勤,等.氯丙烯引起的神经电生理及细胞内Na、K、ca等离子含量的改变[J].中国药理学与毒理学杂志，1996，10(3):219
[8]张新明，厉保秋.HPLC测定鼠心肌5种腺苷酸[J].山东医科大学学报，1992,30(1):88
[9]Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis[J].Ann Rev Biochem，1987,56:395
[10]Pounds JG，Rosen JF.Cellular Ca2- homeostasis and Ca2+-mediated cell processes as critical targets for toxicant action：Conceptual and methodological pitfalls[J].Toxicol Appl Pharmacol，1998,94:331
收稿日期：1999-10-13, http://www.100md.com
单位：山东医科大学毒理学省级重点实验室
关键词：氯丙烯；神经元；钙；能量代谢；鸡胚
山东医科大学000114
摘 要：进一步研究氯丙烯的中毒机理，探讨氯丙烯对神经细胞内钙稳态与能量合成的影响。方法:用Fura-2/AM、电子探针X线微区分析、ATP生物发光分析等方法测定氯丙烯染毒后鸡胚脑神经细胞内游离Ca2+、钙百分含量及ATP、ADP、AMP含量的改变。 结果：随着氯丙烯浓度的增加，细胞内游离Ca2+浓度、钙百分含量明显增加(P<0.01)；细胞内ATP、ADP、AMP含量明显减低，细胞外ADP、AMP含量明显增高(P<0.01)。结论：氯丙烯可引起神经细胞内Ca增加和ATP合成减少，氯丙烯引起的细胞内Ca稳态失调可能与能量合成减少有关。
, http://www.100md.com
分类号：R994.3 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)01-0041-03
STUDY OF THE ACTION OF ALLYL CHLORIDE ON CALCIUM HOMEOSTASIS AND ENERGY SYNTHESIS IN CHICKEN EMBRYO BRAIN CELLS
ZHAO Li ,XIE Ke-qin ,ZHANG Min
(Institute of Toxicology, Shandong Medical University)
Abstract：To research the poisoning mechanisms of allyl chloride and probe into the action of allyl chloride on calcium homeostasis and energy synthesis in brain cells. Methods: Contents of Ca, ATP,ADP, AMP were studied tn allyl chloride-induced chicken embryo brain cells with the methods of fluorescence molecular probe Fura-2/AM, electron probe X-ray microanalysis (EXMA)and ATP bioluminescence analysis.Results: With the increase of allyl chloride, the contents of Ca2+ increased significantly (P<0.01), while the contents of ATP, ADP, AMP markedly decreased (P<0.01). Conclusion: The results suggested that allyl chloride can increase the concents of calicium and decrease energy synthese in nerve cells. Inhibition of energy synthesis in duced by allyl chloride in nerve cells might be one of the mechanisms of calcium unhomeostasis.
, 百拇医药
Keywords：Allyl chloride; Neurons; Calcium; Energy metabolism; Chickens 我国自70年代起发现长期接触低密度氯丙烯(allylchloride，AC)可引起对称性轴突变性型周围神经病[1,2]。动物和离体细胞超微病理结构观察，除发现神经轴浆内微管和神经丝改变以外，还伴有线粒体明显增多，少部分可见嵴脱落呈空泡变性[3,4]。近年研究发现神经病理改变与细胞内钙增高有关[5]。为进一步研究氯丙烯的中毒机理，我们用Fu-ra-2/AM、电子探针X线微区分析、ATP生物发光分析等方法测定氯丙烯染毒后鸡胚脑神经细胞内游离Ca2+、钙百分含量及ATP、ADP、AMP含量的改变，探讨氯丙烯引起的细胞内钙稳态失调与细胞线粒体能量合成代谢之间的关系。1材料与方法1.1试剂AC由上海试剂一厂生产。Fura-2/AM、荧光素-荧光素酶、ATP、ADP、AMP均购于Sigma公司。1.2鸡胚脑神经细胞原代培养见文献6。1.3鸡胚脑神经细胞内游离ca2+([Ca2+]i)测定取培养5～7d的鸡胚脑神经细胞，加入AC，终浓度依次为40.7，81.2，161.3，318.4mmol/L，同时设阴性对照。测定方法见文献7。1.4鸡胚脑神经细胞内钙百分含量测定取培养5～7d的鸡胚脑神经细胞，加入AC，氯丙烯终浓度依次为1.225，2.45mmol/L，同时设阴性对照。测定方法见文献5。1.5鸡胚发光分析法。取培养5～7d的鸡胚脑神经细胞，加入AC，终浓度依次为0.613，1.225，2.45mmol/L，同时设阴性对照。24h后，细胞反复冻融3次，使细胞破碎，加生理盐水到lml，取0.2ml于0.5cm比色杯中，放入发光暗室，然后注入0.8ml荧光素-荧光素酶溶液，立即用FG-300发光光度计记录发光强度，查ATP标准曲线计算样品ATP含量。1.6细胞内和细胞外ADP和AMP含量测定氯丙烯染毒浓度及时间同ATP含量测定，弃培养液后加入0.2ml5mol/LHClO,用吸管吹打混匀，放置4℃2h。然后移入卡巴氏管20000Xg4C离心10min。以上清液20ul进样，用高压液相色谱仪测定细胞内ADP和AMP含量。细胞外测定直接取培养液20ul进样。测定方法见文献8。1.7数据处理所有数据均经PEMS统计软件包进行方差、直线相关分析。2结果2.1鸡胚脑神经细胞内[Ca2+]i的改变见表1。表l鸡胚脑神经细胞内[Ca2+]i的浓度(n＝4,x=s)·P<0.OlvsOmmol·L-1由表1可见，随着AC浓度的增加，[Ca2-]i明显升高,且有显著的剂量效应关系(r=0.9958，P<0.01)。2.2鸡胚脑神经细胞内钙百分含量改变鸡胚脑神经细胞内Ca百分含量，AC0,1.225，2.450mmol/L组分别为(0.08±0.05)%，(0.32土O.031)%，(0.42土0.14)%，随着氯丙烯浓度的增加，钙百分含量明显增加(P<0.01)，在2.45mm01/L氯丙烯染毒的鸡胚脑神经细胞内，与对照相比，钙增加了525%。2.3鸡胚脑神经细胞内外ATP、ADP和AMP含量改变2.3.1鸡胚脑神经细胞内ATP、ADP和AMP含量改变见表2。表2鸡胚脑神经细胞内ATP、ADP和AMP含量(n＝8,x±s)·P<0.01vsOmmol·L-1由表2可见，随着氯丙烯浓度增高，细胞内ATP含量与对照组相比，中、高剂量组分别减少了75.2%和93.3%，有明显的统计学差异(P<0.01)；对ADP、AMP含量的影响高剂量组与对照组相比则明显减少(P<0.01)，分别减少了66.3%和52.2%。2.3.2鸡胚脑神经细胞外AnP和AMP含量改变见表3。表3鸡胚脑神经细胞外ADP和AMP含量改变·P<0.05··P<0.OlvsOmmol·L-13讨论正常生理情况下，细胞外Ca2+浓度在l0-3～10-2M，胞外内Ca2+浓度为l0-8～10-6M。细胞内Ca2+以结合和游离两种形式不均匀地分布在细胞核、细胞浆和其他细胞器内，由于线粒体和内质网中Ca2+含量为10-3M，与胞外Ca2+含量相同，因此又把线粒体和内质网视为细胞内Ca2-的主要贮存库-Ca2+库。当细胞活动时，Ca2+库释放Ca2+。胞外Ca2+跨膜进入以增加Ca2+浓度；安静时，胞浆内Ca2+进入Ca2+库和跨膜外流以减少细胞内Ca2+水平，达到稳态平衡；胞浆内Ca2+稳态平衡主要是靠胞膜上的Ca2+通道、Ca2+-ATPase、Na+-Ca2+交换器调节，另外，内质网、线粒体膜上也有Ca2+通道、Ca2+-ATPase、Ca2+单一运送器，Na+-Ca2+交换系统使Ca2+进出细胞内钙库[9]。Ca2+通道是细胞外Ca2+进入细胞内的主要方式，神经细胞膜的Ca2+通道主要是电压依赖性通道，它受膜电位的影响，膜内Ca2+跨膜外流主要靠Ca2+-ATPase和Na+-Ca2+交换器调节。Na+-Ca2+交换器是一种膜结合蛋白，具有低亲和力高容量的特点，大量的Ca2+需要Na+-Ca2-交换器排出细胞，Na+-Ca2+交换器需要间接消耗能量，它的交换动力主要也是来自膜电位，而膜电位的维持靠Na+-K+泵，Na+-K+泵需要消耗大量能量来维持细胞膜电位，这是一个主动运输过程，细胞能量约1/3以上被用到运输Na+和K+。Ca2+-ATPase直接消耗ATP进行Ca2+的逆浓度转运,因此，能量合成降低可影响膜电位的维持，导致钙通道、Na+-Ca2+交换器Ca2+-ATPase的功能下降，引起Ca2+稳态失调，使细胞内Ca2+增高[10]。我们研究结果与之相符，随着氯丙烯浓度的增高,胞内ATP、AMP、ADP明显减少，而Ca2+明显增高，提示氯丙烯引起的细胞内ca2+增加与细胞能量合成受抑有关。这可能是由于ATP供应缺乏，Na+/K+泵不能维持正常细胞膜电位，导致Ca2+通道、Ca2+-ATPase、Na+-Ca2+交换器功能受损,引起细胞内Ca2+增高。因此，细胞能量合成受抑是氯丙烯引起细胞内钙稳态失调的原因之一。至于滞留的Ca2+是否也直接影响线粒体能量合成需要进一步探讨。
, http://www.100md.com
基金项目：山东省自然科学基金资助课题
参考文献：
[1]山东省人民医院职业病科，等.环氧氯丙烷生产中中毒性神经炎的研究[J].卫生研究，1976，5(6)：463
[2]中国医学科学院卫生研究所临床研究室，中国人民解放军总医院脑系科肌电图室.慢性氯丙烯中毒引起多发性神经病的临床研究[J].中华医学杂志，1980,60(12):746
[3]孙克任，于丽华，杨东昌，等.关于氯丙烯对周围神经纤维超微结构影响的研究[J].中华劳动卫生与职业病杂志，1986，4(3):174
[4]Xie KQ，Sun KR，Gao SJ，et aL Mechanism of allyl chlorideinduced cytoskeletal injury to nerve cells[J].Chin Med J，1998，111(6):556
, 百拇医药
[5]谢克勤，高树君，张磊，等.电子探针x线微区分析1-烯丙基氯-3引起神经组织内Na、K、ca等元素的改变[J].山东医科大学学报,1996，34(3)：269
[6]赵林普，肖定华，陈士英,人，大鼠，鸡等胚胎脑细胞的分离培养及生长分化[J].解剖学杂志，1985,8(5):269
[7]谢克勤,等.氯丙烯引起的神经电生理及细胞内Na、K、ca等离子含量的改变[J].中国药理学与毒理学杂志，1996，10(3):219
[8]张新明，厉保秋.HPLC测定鼠心肌5种腺苷酸[J].山东医科大学学报，1992,30(1):88
[9]Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis[J].Ann Rev Biochem，1987,56:395
[10]Pounds JG，Rosen JF.Cellular Ca2- homeostasis and Ca2+-mediated cell processes as critical targets for toxicant action：Conceptual and methodological pitfalls[J].Toxicol Appl Pharmacol，1998,94:331
收稿日期：1999-10-13, http://www.100md.com