在综合基础上创新——鼠伤寒菌pla基因及其功能研究的思考
作者：郑铃 张金钟 陈锦英 包幼迪
单位：郑铃(福建医科大学基因工程研究室，福建 福州 350004)；张金钟(天津医科大学社科部，天津 300070)；陈锦英(天津医科大学微生物学教研室，天津 300070)；包幼迪(福建医科大学基因工程研究室，福建 福州 350004)
关键词：综合研究方法；创新；科学研究
医学与哲学000307
摘要：鼠伤寒菌pla基因及功能的研究从课题确立到取得结果整个过程，充分展现了综合研究方法在现代科学研究中的重要作用；在综合基础上的创新是科学研究成功的中心环节。
中图分类号：R516.3 文献标识码：A
文章编号：1002-0772(2000)03-0020-03
, 百拇医药
Creativity on Basis of Comprehensive Studies:Philosophy of Study on pla Gene of S.typhimurium and its Function
ZHENG Ling,BAO You-di
(Laboratory of Genetic Engineering,Fujian Medical University,Fujian Fuzhou 350004,China)
ZHANG Jin-zhong
(Department of Philosophy & Social Science,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)
, http://www.100md.com
CHEN Jin-ying
(Department of Microbiology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)
Abstract：Through an analysis of the philosophy in the study of the pla gene of s.typhimurium,it is obvious that,in scientific researches,comprehensive studies preform an important function,and the creativity originated from them has great beneficial effect.
Key Words：comprehensive studies;creativity;scientific research
, http://www.100md.com
1991年，革兰氏阴性致病菌纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,Pla)活性及其与细菌致病性关系的研究课题得到了国家自然科学基金资助。通过3年的研究，在国际上首次证明了鼠伤寒沙门氏菌具有Pla活性；确定了该活性是由其染色体上一未知功能基因(prtA)所编码，初步证明了该基因及其编码的蛋白产物是参与或影响细菌侵袭力的又一重要因素。这项研究从立题到完成的整个过程，充分体现了综合研究方法在现代科学研究中的巨大作用。
1 在综合的基础上确定课题
沙门氏菌是主要的革兰氏阴性肠道致病菌，能引起伤寒、副伤寒、败血症、急性胃肠炎等多种疾病，严重地危害人类健康。在我国，伤寒和鼠伤寒的感染率分别占全部沙门氏菌感染的第一、二位，尤其是鼠伤寒在学龄儿童中有较高的发病率。沙门氏菌，特别是鼠伤寒沙门氏菌的减毒突变株，是近年来逐渐引起重视的一种新型活疫苗载体，可直接传递抗原至淋巴组织，诱发粘膜免疫反应。沙门氏菌分泌的IgA可浸润全身所有的粘膜表面，形成强有力的粘膜屏障作用。从基因水平研究沙门氏菌的致病机理，既有助于阐明细菌致病的分子机制，指导选用有效的预防措施，也有助于发展无毒的高免疫原性的基因工程疫苗。
, 百拇医药
鼠伤寒菌的致病作用是多因素造成的，包括侵袭因子、毒力因子等。这些因子分别由染色体上特定基因所编码。此前，已从染色体上克隆到一些有关的侵袭性基因和调控因子。由于这些基因只决定寄主菌部分侵袭力，而不是全部的侵袭力，因此，这些基因的缺失，可造成细菌侵袭力不同程度地降低，却不能使细菌的侵袭力完全丧失。1989年，Gatan,J.E.和Curtiss,R.III.等学者从鼠伤寒菌染色体克隆到4个与侵袭力有关的基因：invA(编码54KD蛋白)、invB(编码64KD蛋白)、invC(编码47KD蛋白)和invD(编码30KD蛋白)。这些基因位于染色体第58分钟，其中invABC处于同一转录单位，形成一个完整的操纵子；invD则是位于下游的一个独立转录单位。他们的研究表明inv基因失活后，可导致细菌侵袭力减弱，在经口感染小鼠时，LD50明显升高；如果将细菌直接注射入腹腔内时，则LD50就与野生型几无差别；而当inv基因转移入减毒株后，虽然能够增强减毒株的侵袭力，但增强程度均不能达到同源野生株的水平。该实验说明，这些基因与细菌对宿主的侵袭能力有着密切关系；但还存在有其它未知因素的影响，说明尽管对鼠伤寒菌的研究由来已久，但它仍然是国内外病原学研究的热点之一，仍有许多空白点值得深入研究。
, 百拇医药
1986年，美国麻省理工学院学者Guan-quao Yu等在研究位于染色体第74分钟的鼠伤寒菌可诱导磷酸甘油酸转移基因时，从染色体上同时克隆到一个能编码大约30KD蛋白的未知基因，称之为E基因。他们对E基因进行了DNA序列分析并根据DNA序列推导出编码蛋白的氨基酸顺序，但不知该基因及其产物的功能[1]。自1989年起，美国Massachusetts大学医学院学者Sodeinde,O.A.等开始从基因水平研究烈性传染病鼠疫的病源——鼠疫杆菌的致病性，相继在Science等著名期刊上发表了他们的研究成果，举世瞩目。他们的研究表明鼠疫杆菌9.5kb质粒上的pla基因能够编码纤溶酶原激活剂pla，该基因及其编码的pla是此细菌强大侵袭力的重要组成部分，对促进细菌在机体内的扩散起着十分重要的作用。无pla活性的鼠疫杆菌从皮下感染小鼠时，与野生株相比，小鼠的存活率明显升高，其LD50增加几百万倍。用pla+株感染小鼠时，细菌会很快地侵入到肝脾等深层组织中，致使宿主很快死亡。据此提出pla及其同类物可能以一种很微妙的方式赋于细菌能够在机体内产生扩散感染的能力，从而大大增强了细菌的致病性。他们猜测其它一些高侵袭性的革兰氏阴性致病菌可能亦存在这种特性。因此，他们对伤寒、鼠伤寒菌及大肠杆菌等进行了已知DNA序列的比较，发现这些细菌的染色体上都存在有pla基因的同源序列，但以鼠伤寒菌中的E基因与pla基因的同源程度最高：它们的DNA序列之间有69%同源，根据DNA序列推导出的蛋白之间有71%同源。这些学者推测鼠伤寒菌可能具有纤溶酶原激活剂的特性。他们将该基因命名为prtA(protease A)。但由于他们在鼠伤寒菌中并未检测到pla活性，不能确定prtA基因在菌体内是否表达及可能的作用。Sodeinde,O.A.在发表于“Science”一文中指出，这些与鼠疫杆菌pla同源的基因均位于细菌的染色体上，但不知其生理功能如何。因为他们的精力主要集中在鼠疫杆菌的pla研究上，未能对鼠伤寒菌的这种现象进行深入探讨[2]。
, http://www.100md.com
在全面收集、研究并综合了有关的论文资料后，研究者及时提出了革兰氏阴性致病菌纤溶酶原激活剂活性及其与细菌致病性关系的研究课题。该课题旨在对革兰氏阴性致病菌的pla特性较为全面了解的基础上，重点对鼠伤寒菌的prtA基因及功能进行深入研究。
2 研究成果的取得在于创新
2.1 在综合分析他人研究的基础上，创建了一个敏感度特异的检测手段
Sodeinde等人为什么没能检测出鼠伤寒菌pla活性呢?原因有三：(1)检测方法敏感度不够。革兰氏阳性致病菌的pla是一分泌性蛋白酶，具有很强的活性；而革兰氏阴性菌编码的蛋白很多是属于非分泌性的菌体细菌膜结构蛋白，需要更为灵敏的方法才可能检测出。因此利用革兰氏阳性菌pla的检测方法就可能检测不出革兰氏阴性菌的pla活性。(2)待测菌株在实验室内保存时间太长，可能影响一些菌体蛋白的表达功能。(3)鼠伤寒菌可能就不表达此蛋白活性。
, 百拇医药
可见，要开展本课题的研究，首先必需建立一个灵敏度更高的纤溶酶原激活剂活性的检测方法。在传统的纤维蛋白平板检测法基础上进行改良。在原纤维蛋白平板中，去除了固定剂——琼脂，添加了适量的纤溶酶原；同时，另设一含有纤溶酶抑制剂的对照平板以排除其它蛋白酶的作用。这样，与原方法相比，这种改良的溶解圈测定法不仅大大地提高了检测的敏感性，而且提高了检测的特异性。改良溶解圈测定法的建立为本研究的开展创造了条件。
考虑到待测菌株在实验室内保存时间太长，可能影响一些菌体蛋白的表达功能，研究者从临床上采集了50份新分离的标本(包括普通大肠杆菌、致病性大肠杆菌、变形杆菌以及伤寒和鼠伤寒菌等)，应用新建立的改良溶解圈测定法进行pla活性检测。检测结果显示伤寒菌和鼠伤寒菌有pla活性，其中又以鼠伤寒菌的活性最强。以上实验证明，伤寒菌和鼠伤寒菌均表现有pla活性，并从中选出活性较强鼠伤寒菌90266作为进一步研究对象，为从基因水平探讨鼠伤寒菌的pla活性奠定了基础。
2.2 为获得染色体基因定位突变，创建了一种有效的染色体基因功能研究手段
, 百拇医药
研究基因功能的主要手段是构建基因突变型。研究染色体上某一特定基因在机体内的功能远比质粒上的同类研究困难得多。质粒分子量小，操作容易；虽然能赋予细菌某些性状，却不是细菌生存所必需的，因此质粒上基因功能的研究可以通过质粒消除；或把质粒提取出加以人工改造，在菌体外构建好突变型后，再以人工方法转化入同源菌株内进行功能测定。染色体是细菌生存所必需的物质，没有染色体，细菌就无法存活。所以对染色体基因功能的研究就不能采用质粒研究方法，而多是运用转座子插入和随机脱失等方法来获得染色体上基因的突变型。但是这些方法不但操作困难，而且由于插入或随机脱失所产生的突变是不定位的，需要经过筛选从大量的突变子中找出可供研究的突变型，并且这种突变型中其它基因是否同时发生改变就更难预测了。因此，要研究鼠伤寒菌染色体prtA基因的功能及其与pla表型之间的关系，需要创建一种染色体基因的定位突变方法。
根据基因同源交换具有很好的定位特征，如果用一外源性突变prtA基因置换染色体上的野生型prtA基因，这样就可很方便地在不改变菌体其它遗传性状的前提下，研究此基因对鼠伤寒菌的pla表型的影响作用。因此，研究者构建了带有突变prtA基因的自杀性质粒载体，利用自杀性质粒载体的可转移基因PR4mob等的转移作用，将人工构建的突变prtA基因携带入鼠伤寒菌中；然后再利用此质粒载体的复制基因R6Kori的启始复制的特性，当其进入其它细菌体内时，由于不存在复制基因R6Kori的启始复制所需的复制蛋白，质粒载体就表现出自杀性特性。在外界选择性压力的作用下，自杀性质粒载体所携带的突变prtA基因就与鼠伤寒菌染色体上的野生型发生基因同源交换，产生了带有突变PrtA的突变株；而质粒载体自身由于自杀性特性连同染色体上原有的野生型prtA基因一起随着细菌的传代从菌体内消失。通过对突变子的质粒、染色体DNA的提取、电泳、酶切以及Southern blot等分析，均表明已获得了所预期的prtA基因突变的鼠伤寒菌prtA突变型[3，4]。
, 百拇医药
2.3 运用新的检测方法和研究手段，取得新的研究结果
由于新的检测方法和研究手段的建立和成功运用，获得了鼠伤寒菌prtA突变型。通过检测和比较prtA突变型与野生型的pla活性，结果显示prtA突变型的pla活性已经完全丧失，说明其pla活性与prtA基因功能有直接关系。综合Sodeinde,O.A.等学者对该基因DNA序列的分析，可判定该prtA基因具有编码pla活性的功能，是pla的编码基因。
在研究中，采用活菌计数法比较了prtA突变型与野生型对Hep-2细胞的侵袭力，结果提示prtA突变型鼠伤寒菌在其pla活性丧失的同时，对Hep-2细胞的侵袭力也明显减弱。初步证明prtA基因与细菌的侵袭力有关，可能是鼠伤寒菌又一新的致病因子。因此，研究者建议将此基因正式命名鼠伤寒菌的pla基因(plasminogen activator gene)[5]。
虽然pla功能在革兰氏阳性致病菌，如链球菌，葡萄球菌中已有过报道，但Sodeinde OA等学者应用分子生物学手段在病原菌(鼠疫杆菌)中深入研究pla活性及功能尚属首次。这项研究结果是继Sodeinde OA等学者之后，在革兰氏阴性病原菌pla及其与致病性关系研究方面又一新的进展。而且，有研究表明pla类似物能够破坏细胞间质和基底膜蛋白，具有促进肿瘤细胞转移和扩散的作用。因此，这些有关pla的新结论、新动向已引起而且必将进一步引起国际学术界的广泛关注。
, 百拇医药
3 结语
科研选题需要综合。通过对各种资料的综合，找出现有知识上的空白点、不同作者报告中的差别、新事实与已有理论的矛盾，从而确定科研课题。观察和实验的设计安排需要综合。对观察、实验中得出的数据、现象的分析需要综合。假说的提出，各种假说的比较鉴别，假说向理论的过渡，也都离不开综合。但是，综合只是科学研究的手段，并不是目的，科学研究的目的在于创新。应用综合研究方法的目的就在于完成科学上的创新，通过借鉴有关知识和技能，完成科学上的发现或发明[6]。因此，科学工作者只有很好地掌握并自觉地运用综合研究方法，才可能在科学研究的竞赛中走在前列。
作者简介：郑铃(1962～)，女，福建福州人，天津医科大学博士研究生，现于福建医科大学基因工程研究室工作。
参考文献：
[1]Yu Guanqiao,Hong Jenshiang.Identification and nucleotide sequece of the activator gene of the externally induced phosphoglycerate transport system of salmonella typhimurium[J].Gene,1986,45:51～57.
, 百拇医药
[2]Sodeninde O A,Goguen J D.A surface protease and the invasive character of plague[J].Science,1992,258:1 004～1 007.
[3]郑 铃，包幼迪.应用自杀性质粒载体构建鼠伤寒沙门氏菌pla基因的位点专一性突变[J].中国人兽共患病杂志，1994，12(4)：7～10.
[4]郑 铃，包幼迪.改良溶解圈纤溶酶原激活物测定法及其在革兰氏阴性菌中的应用[J].中国人兽共患病杂志，1996，12(4)：7～10.
[5]郑 铃，包幼迪.鼠伤寒沙门氏菌pla基因及其功能的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(1)：60～65.
[6]张金钟.综合研究方法初探[J].天津师范大学学报，1986，3：10～14.
收稿日期：1999-11-12, 百拇医药
单位：郑铃(福建医科大学基因工程研究室，福建 福州 350004)；张金钟(天津医科大学社科部，天津 300070)；陈锦英(天津医科大学微生物学教研室，天津 300070)；包幼迪(福建医科大学基因工程研究室，福建 福州 350004)
关键词：综合研究方法；创新；科学研究
医学与哲学000307
摘要：鼠伤寒菌pla基因及功能的研究从课题确立到取得结果整个过程，充分展现了综合研究方法在现代科学研究中的重要作用；在综合基础上的创新是科学研究成功的中心环节。
中图分类号：R516.3 文献标识码：A
文章编号：1002-0772(2000)03-0020-03
, 百拇医药
Creativity on Basis of Comprehensive Studies:Philosophy of Study on pla Gene of S.typhimurium and its Function
ZHENG Ling,BAO You-di
(Laboratory of Genetic Engineering,Fujian Medical University,Fujian Fuzhou 350004,China)
ZHANG Jin-zhong
(Department of Philosophy & Social Science,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)
, http://www.100md.com
CHEN Jin-ying
(Department of Microbiology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)
Abstract：Through an analysis of the philosophy in the study of the pla gene of s.typhimurium,it is obvious that,in scientific researches,comprehensive studies preform an important function,and the creativity originated from them has great beneficial effect.
Key Words：comprehensive studies;creativity;scientific research
, http://www.100md.com
1991年，革兰氏阴性致病菌纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,Pla)活性及其与细菌致病性关系的研究课题得到了国家自然科学基金资助。通过3年的研究，在国际上首次证明了鼠伤寒沙门氏菌具有Pla活性；确定了该活性是由其染色体上一未知功能基因(prtA)所编码，初步证明了该基因及其编码的蛋白产物是参与或影响细菌侵袭力的又一重要因素。这项研究从立题到完成的整个过程，充分体现了综合研究方法在现代科学研究中的巨大作用。
1 在综合的基础上确定课题
沙门氏菌是主要的革兰氏阴性肠道致病菌，能引起伤寒、副伤寒、败血症、急性胃肠炎等多种疾病，严重地危害人类健康。在我国，伤寒和鼠伤寒的感染率分别占全部沙门氏菌感染的第一、二位，尤其是鼠伤寒在学龄儿童中有较高的发病率。沙门氏菌，特别是鼠伤寒沙门氏菌的减毒突变株，是近年来逐渐引起重视的一种新型活疫苗载体，可直接传递抗原至淋巴组织，诱发粘膜免疫反应。沙门氏菌分泌的IgA可浸润全身所有的粘膜表面，形成强有力的粘膜屏障作用。从基因水平研究沙门氏菌的致病机理，既有助于阐明细菌致病的分子机制，指导选用有效的预防措施，也有助于发展无毒的高免疫原性的基因工程疫苗。
, 百拇医药
鼠伤寒菌的致病作用是多因素造成的，包括侵袭因子、毒力因子等。这些因子分别由染色体上特定基因所编码。此前，已从染色体上克隆到一些有关的侵袭性基因和调控因子。由于这些基因只决定寄主菌部分侵袭力，而不是全部的侵袭力，因此，这些基因的缺失，可造成细菌侵袭力不同程度地降低，却不能使细菌的侵袭力完全丧失。1989年，Gatan,J.E.和Curtiss,R.III.等学者从鼠伤寒菌染色体克隆到4个与侵袭力有关的基因：invA(编码54KD蛋白)、invB(编码64KD蛋白)、invC(编码47KD蛋白)和invD(编码30KD蛋白)。这些基因位于染色体第58分钟，其中invABC处于同一转录单位，形成一个完整的操纵子；invD则是位于下游的一个独立转录单位。他们的研究表明inv基因失活后，可导致细菌侵袭力减弱，在经口感染小鼠时，LD50明显升高；如果将细菌直接注射入腹腔内时，则LD50就与野生型几无差别；而当inv基因转移入减毒株后，虽然能够增强减毒株的侵袭力，但增强程度均不能达到同源野生株的水平。该实验说明，这些基因与细菌对宿主的侵袭能力有着密切关系；但还存在有其它未知因素的影响，说明尽管对鼠伤寒菌的研究由来已久，但它仍然是国内外病原学研究的热点之一，仍有许多空白点值得深入研究。
, 百拇医药
1986年，美国麻省理工学院学者Guan-quao Yu等在研究位于染色体第74分钟的鼠伤寒菌可诱导磷酸甘油酸转移基因时，从染色体上同时克隆到一个能编码大约30KD蛋白的未知基因，称之为E基因。他们对E基因进行了DNA序列分析并根据DNA序列推导出编码蛋白的氨基酸顺序，但不知该基因及其产物的功能[1]。自1989年起，美国Massachusetts大学医学院学者Sodeinde,O.A.等开始从基因水平研究烈性传染病鼠疫的病源——鼠疫杆菌的致病性，相继在Science等著名期刊上发表了他们的研究成果，举世瞩目。他们的研究表明鼠疫杆菌9.5kb质粒上的pla基因能够编码纤溶酶原激活剂pla，该基因及其编码的pla是此细菌强大侵袭力的重要组成部分，对促进细菌在机体内的扩散起着十分重要的作用。无pla活性的鼠疫杆菌从皮下感染小鼠时，与野生株相比，小鼠的存活率明显升高，其LD50增加几百万倍。用pla+株感染小鼠时，细菌会很快地侵入到肝脾等深层组织中，致使宿主很快死亡。据此提出pla及其同类物可能以一种很微妙的方式赋于细菌能够在机体内产生扩散感染的能力，从而大大增强了细菌的致病性。他们猜测其它一些高侵袭性的革兰氏阴性致病菌可能亦存在这种特性。因此，他们对伤寒、鼠伤寒菌及大肠杆菌等进行了已知DNA序列的比较，发现这些细菌的染色体上都存在有pla基因的同源序列，但以鼠伤寒菌中的E基因与pla基因的同源程度最高：它们的DNA序列之间有69%同源，根据DNA序列推导出的蛋白之间有71%同源。这些学者推测鼠伤寒菌可能具有纤溶酶原激活剂的特性。他们将该基因命名为prtA(protease A)。但由于他们在鼠伤寒菌中并未检测到pla活性，不能确定prtA基因在菌体内是否表达及可能的作用。Sodeinde,O.A.在发表于“Science”一文中指出，这些与鼠疫杆菌pla同源的基因均位于细菌的染色体上，但不知其生理功能如何。因为他们的精力主要集中在鼠疫杆菌的pla研究上，未能对鼠伤寒菌的这种现象进行深入探讨[2]。
, http://www.100md.com
在全面收集、研究并综合了有关的论文资料后，研究者及时提出了革兰氏阴性致病菌纤溶酶原激活剂活性及其与细菌致病性关系的研究课题。该课题旨在对革兰氏阴性致病菌的pla特性较为全面了解的基础上，重点对鼠伤寒菌的prtA基因及功能进行深入研究。
2 研究成果的取得在于创新
2.1 在综合分析他人研究的基础上，创建了一个敏感度特异的检测手段
Sodeinde等人为什么没能检测出鼠伤寒菌pla活性呢?原因有三：(1)检测方法敏感度不够。革兰氏阳性致病菌的pla是一分泌性蛋白酶，具有很强的活性；而革兰氏阴性菌编码的蛋白很多是属于非分泌性的菌体细菌膜结构蛋白，需要更为灵敏的方法才可能检测出。因此利用革兰氏阳性菌pla的检测方法就可能检测不出革兰氏阴性菌的pla活性。(2)待测菌株在实验室内保存时间太长，可能影响一些菌体蛋白的表达功能。(3)鼠伤寒菌可能就不表达此蛋白活性。
, 百拇医药
可见，要开展本课题的研究，首先必需建立一个灵敏度更高的纤溶酶原激活剂活性的检测方法。在传统的纤维蛋白平板检测法基础上进行改良。在原纤维蛋白平板中，去除了固定剂——琼脂，添加了适量的纤溶酶原；同时，另设一含有纤溶酶抑制剂的对照平板以排除其它蛋白酶的作用。这样，与原方法相比，这种改良的溶解圈测定法不仅大大地提高了检测的敏感性，而且提高了检测的特异性。改良溶解圈测定法的建立为本研究的开展创造了条件。
考虑到待测菌株在实验室内保存时间太长，可能影响一些菌体蛋白的表达功能，研究者从临床上采集了50份新分离的标本(包括普通大肠杆菌、致病性大肠杆菌、变形杆菌以及伤寒和鼠伤寒菌等)，应用新建立的改良溶解圈测定法进行pla活性检测。检测结果显示伤寒菌和鼠伤寒菌有pla活性，其中又以鼠伤寒菌的活性最强。以上实验证明，伤寒菌和鼠伤寒菌均表现有pla活性，并从中选出活性较强鼠伤寒菌90266作为进一步研究对象，为从基因水平探讨鼠伤寒菌的pla活性奠定了基础。
2.2 为获得染色体基因定位突变，创建了一种有效的染色体基因功能研究手段
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研究基因功能的主要手段是构建基因突变型。研究染色体上某一特定基因在机体内的功能远比质粒上的同类研究困难得多。质粒分子量小，操作容易；虽然能赋予细菌某些性状，却不是细菌生存所必需的，因此质粒上基因功能的研究可以通过质粒消除；或把质粒提取出加以人工改造，在菌体外构建好突变型后，再以人工方法转化入同源菌株内进行功能测定。染色体是细菌生存所必需的物质，没有染色体，细菌就无法存活。所以对染色体基因功能的研究就不能采用质粒研究方法，而多是运用转座子插入和随机脱失等方法来获得染色体上基因的突变型。但是这些方法不但操作困难，而且由于插入或随机脱失所产生的突变是不定位的，需要经过筛选从大量的突变子中找出可供研究的突变型，并且这种突变型中其它基因是否同时发生改变就更难预测了。因此，要研究鼠伤寒菌染色体prtA基因的功能及其与pla表型之间的关系，需要创建一种染色体基因的定位突变方法。
根据基因同源交换具有很好的定位特征，如果用一外源性突变prtA基因置换染色体上的野生型prtA基因，这样就可很方便地在不改变菌体其它遗传性状的前提下，研究此基因对鼠伤寒菌的pla表型的影响作用。因此，研究者构建了带有突变prtA基因的自杀性质粒载体，利用自杀性质粒载体的可转移基因PR4mob等的转移作用，将人工构建的突变prtA基因携带入鼠伤寒菌中；然后再利用此质粒载体的复制基因R6Kori的启始复制的特性，当其进入其它细菌体内时，由于不存在复制基因R6Kori的启始复制所需的复制蛋白，质粒载体就表现出自杀性特性。在外界选择性压力的作用下，自杀性质粒载体所携带的突变prtA基因就与鼠伤寒菌染色体上的野生型发生基因同源交换，产生了带有突变PrtA的突变株；而质粒载体自身由于自杀性特性连同染色体上原有的野生型prtA基因一起随着细菌的传代从菌体内消失。通过对突变子的质粒、染色体DNA的提取、电泳、酶切以及Southern blot等分析，均表明已获得了所预期的prtA基因突变的鼠伤寒菌prtA突变型[3，4]。
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2.3 运用新的检测方法和研究手段，取得新的研究结果
由于新的检测方法和研究手段的建立和成功运用，获得了鼠伤寒菌prtA突变型。通过检测和比较prtA突变型与野生型的pla活性，结果显示prtA突变型的pla活性已经完全丧失，说明其pla活性与prtA基因功能有直接关系。综合Sodeinde,O.A.等学者对该基因DNA序列的分析，可判定该prtA基因具有编码pla活性的功能，是pla的编码基因。
在研究中，采用活菌计数法比较了prtA突变型与野生型对Hep-2细胞的侵袭力，结果提示prtA突变型鼠伤寒菌在其pla活性丧失的同时，对Hep-2细胞的侵袭力也明显减弱。初步证明prtA基因与细菌的侵袭力有关，可能是鼠伤寒菌又一新的致病因子。因此，研究者建议将此基因正式命名鼠伤寒菌的pla基因(plasminogen activator gene)[5]。
虽然pla功能在革兰氏阳性致病菌，如链球菌，葡萄球菌中已有过报道，但Sodeinde OA等学者应用分子生物学手段在病原菌(鼠疫杆菌)中深入研究pla活性及功能尚属首次。这项研究结果是继Sodeinde OA等学者之后，在革兰氏阴性病原菌pla及其与致病性关系研究方面又一新的进展。而且，有研究表明pla类似物能够破坏细胞间质和基底膜蛋白，具有促进肿瘤细胞转移和扩散的作用。因此，这些有关pla的新结论、新动向已引起而且必将进一步引起国际学术界的广泛关注。
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3 结语
科研选题需要综合。通过对各种资料的综合，找出现有知识上的空白点、不同作者报告中的差别、新事实与已有理论的矛盾，从而确定科研课题。观察和实验的设计安排需要综合。对观察、实验中得出的数据、现象的分析需要综合。假说的提出，各种假说的比较鉴别，假说向理论的过渡，也都离不开综合。但是，综合只是科学研究的手段，并不是目的，科学研究的目的在于创新。应用综合研究方法的目的就在于完成科学上的创新，通过借鉴有关知识和技能，完成科学上的发现或发明[6]。因此，科学工作者只有很好地掌握并自觉地运用综合研究方法，才可能在科学研究的竞赛中走在前列。
作者简介：郑铃(1962～)，女，福建福州人，天津医科大学博士研究生，现于福建医科大学基因工程研究室工作。
参考文献：
[1]Yu Guanqiao,Hong Jenshiang.Identification and nucleotide sequece of the activator gene of the externally induced phosphoglycerate transport system of salmonella typhimurium[J].Gene,1986,45:51～57.
, 百拇医药
[2]Sodeninde O A,Goguen J D.A surface protease and the invasive character of plague[J].Science,1992,258:1 004～1 007.
[3]郑 铃，包幼迪.应用自杀性质粒载体构建鼠伤寒沙门氏菌pla基因的位点专一性突变[J].中国人兽共患病杂志，1994，12(4)：7～10.
[4]郑 铃，包幼迪.改良溶解圈纤溶酶原激活物测定法及其在革兰氏阴性菌中的应用[J].中国人兽共患病杂志，1996，12(4)：7～10.
[5]郑 铃，包幼迪.鼠伤寒沙门氏菌pla基因及其功能的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，18(1)：60～65.
[6]张金钟.综合研究方法初探[J].天津师范大学学报，1986，3：10～14.
收稿日期：1999-11-12, 百拇医药