脑缺血再灌流过程中沙土鼠脑组织和血浆SOD、 MDA含量的变化
作者：赵秀梅* 刘育英* 姜 澜*
单位：* 中国人民解放军总医院微循环研究室, 邮政编码 北京100853
关键词：脑；缺血再灌流；超氧化物歧化酶；丙二醛
微循环学杂志990106
复制沙土鼠实验性脑缺血再灌流模型, 测定了在缺血及再灌流不同阶段血清及脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和脂质过氧化反应最终产物(MDA)的含量变化, 结果发现单纯缺血组与再灌流各组脑组织MDA的含量均高于正常对照组, 且再灌流1 h、 6 h组的MDA含量明显高于单纯缺血组(P<0.05), 并有随再灌时间延长不断升高的趋势, 但三个再灌流组之间比较无明显差异。 单纯缺血组与再灌流各组比较脑组织SOD的活性均较正常对照组降低, 以再灌1 h、 6 h最为明显, 与单纯缺血组比较P<0.05。 实验各组与正常对照组比较血浆SOD的活性无显著差异。 表明单纯缺血和再灌流后均发生了脂质过氧化反应, 并认为自由基引起的损伤, 在缺血后再灌流中比单纯缺血更为严重。
, 百拇医药
在脑缺血再灌流过程中, 氧自由基的大量形成和脂质过氧化的增加是细胞损伤的主要病理过程之一[1,2]。 丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应的最终产物, 测定MDA的含量可反映组织中自由基的含量和脂质过氧化程度[3]。 而超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内主要的抗氧化酶-超氧自由基清除剂。 本实验通过沙土鼠实验性脑缺血再灌流模型, 分别测定了血清及脑组织中SOD和MDA在缺血及再灌流不同阶段的含量变化, 探讨其相互关系, 为缺血后再灌流损伤的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及模型制作
雄性蒙古沙土鼠40只, 体重55～68 g, 中国人民解放军总医院动物中心提供。 随机分为正常对照, 单纯缺血15 min、 30 min, 缺血30 min后再灌流30 min、 1 h、 6 h等6组。 20%乌拉坦腹腔麻醉(1.5 g/kg)。 颈正中切口分离双侧颈总动脉, 用小动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉15 min、 30 min, 造成单纯脑缺血模型。 夹闭30 min后恢复血流制成再灌流模型。 正常对照组不夹闭颈总动脉。
, 百拇医药
1.2 样本制备及测定方法
颈动脉穿刺抽血(1∶9枸橼酸钠抗凝), 立即离心(4 000 r/min)10 min, 取血清存入-20 ℃冰箱待测。 快速断头取脑, 取一侧半球的颞叶及顶叶皮质, 称重量, 放入预冷的PBS缓冲液中(pH 7.0), 用玻璃匀浆器制成10%的匀浆液, 离心(4 000 r/min)10 min, 取上清液存入-20 ℃冰箱待测。 MDA的测定采用比色法[4], SOD采用化学发光法[5]。 结果用t检验进行统计学处理。
从表1可以看出, 单纯缺血组与再灌流各组脑组织MDA的含量均高于正常对照组, 且再灌流1 h、 6 h组的MDA含量明显高于单纯缺血组(P<0.05～0.01), 并有随再灌时间延长不断升高的趋势, 但三个再灌流组之间比较无明显差异。 单纯缺血组与再灌流各组脑组织SOD的活性均较正常对照组降低, 以再灌1 h、 6 h最为明显, 且与单纯缺血组比较, P<0.05。 表2显示实验各组与正常对照组比较, 血浆SOD的活性均无显著性差异。
, 百拇医药
2 结 果
表 1 沙土鼠脑缺血再灌流不同阶段脑组织中SOD活性和MDA含量的比较(
±s) 组 别
n
SOD(U/ml)
MDA(nmol/ml)
正常组
5
92.78±1.38
4.28±0.31
缺血15 min
, 百拇医药
6
87.92±1.74
4.31±0.71
缺血30 min
8
84.50±1.901)
5.74±0.53
再灌30 min
6
82.47±2.051)
5.82±0.402)
, 百拇医药
再灌1 h
8
74.98±3.181)3)
7.08±0.301)3)
再灌6 h
7
75.48±3.171)3)
7.72±0.441)4)
注: 与正常对照组比较: 1) P<0.01, 2) P<0.05; 再灌组与单纯缺血组比较: 3) P<0.05, 4) P<0.01表 2 沙土鼠脑缺血再灌流不同阶段血浆中SOD的活性(±s) 组 别
, 百拇医药
n
SOD(U/ml)
正常组
5
69.98±2.27
缺血15 min
7
70.37±4.43
缺血30 min
7
62.92±5.18
再灌30 min
, 百拇医药 7
60.44±4.03
再灌1 h
8
59.35±4.15
再灌6 h
7
62.08±2.14
3 讨 论
众所周知, 脑对缺血极为敏感, 短期脑缺血即能导致一系列的功能及代谢紊乱。 因此, 尽快恢复脑血流是改善缺血脑功能的重要措施。 然而许多实验证明, 一定程度脑缺血后, 血流再通会引起更为严重的脑组织损伤。 研究表明在脑缺血再灌流过程中自由基急剧增高是再灌流损伤的主要病理基础, 它对细胞的损伤作用是引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应, 而中枢神经系统中含有丰富的不饱和脂肪酸, 最易发生脂质过氧化反应。 因此测定MDA的含量可反应组织中自由基的含量和脂质过氧化程度。 SOD是一种金属蛋白酶, 也是机体内非常重要的氧自由基清除剂, 实验证明外源性SOD对脑缺血再灌流损伤有保护性作用[6]。 本实验测得脑组织MDA的含量在缺血组与再灌流各组均增高, 且随再灌时间延长有继续升高的趋势, 而SOD的活性则降低, 再灌流后较单纯缺血期改变明显。 表明在单纯缺血和再灌流后均发生了脂质过氧化反应, 并认为自由基引起的损伤在再灌流后比单纯缺血更为严重[7]。 血清SOD的活性在脑缺血与再灌流损伤中无明显变化, 与文献[8～10]报导的研究结果一致, 提示氧自由基的损伤作用主要在脑组织局部, 表现为脑组织自由基产生增多, 脑组织SOD因消耗而使抗氧化酶活性降低、 氧自由基清除减少, 造成脑组织损伤。 由于SOD是一种带负电荷的大分子蛋白酶, 分子量为31 000左右, 不能通过血脑屏障[10,11], 因此虽然脑组织SOD下降, 血浆SOD不一定会降低。
, 百拇医药
参考文献
[1] Jack D. Free radical pathology. Stroke, 1978, 9:443.
[2] Kinute Y. Lipid peroxdation in focal cerebral ischemia. J Neurosury, 1989, 7:421.
[3] Branghler JM, Solis H, Meldrum BS. Central nervous system trama and stroke:1. Biochemical consideration. Free Radical Biolmed, 1989, 6:289.
[4] 田亚平, 沈文梅. 血清总TBA反应物、 LPO及MDA样物质的联合测定. 解放军医学情报, 1990, 4:323.
, 百拇医药
[5] 李益新. 血液和组织中超氧化物歧化酶的微量测定. 中国人民解放军军事医学科学院院刊, 1984, 3:359～361.
[6] Uyama H. Protective effects of superoxide on actute reperfusion injury of gerbil brain. Free Radical biolmed, 1990, 7:265.
[7] Brament C. Increased lipid peroxidation in vulnerable brain regions after transient forebrain ischemia in rats. Stroke, 1989, 20:918.
[8] 何庆, 邓常青. 家兔脑缺血再灌流损伤机制的研究. 中国危重病急救医学, 1994, 6(6):324.
, 百拇医药
[9] 张艳艳, 丁德云. 沙土鼠脑缺血后脑组织匀浆及血浆中SOD、 MDA的含量改变及其意义. 临床神经病学杂志, 1994, 7(6):361.
[10] Schmidley JW. Free radical in central nervous system ischemia. Stroke, 1990, 21:1 086.
[11] 于新. 脑损伤和脑水肿的氧自由基作用和超氧化物歧化酶的治疗作用. 国外医学神经病学神经外科学分册, 1994, 21(3):128.
本文1998-01-20收到, 1998-04-23修回, 1998-06-20修回, 1998-10-24接受, http://www.100md.com(赵秀梅* 刘育英* 姜 澜*)
单位：* 中国人民解放军总医院微循环研究室, 邮政编码 北京100853
关键词：脑；缺血再灌流；超氧化物歧化酶；丙二醛
微循环学杂志990106
复制沙土鼠实验性脑缺血再灌流模型, 测定了在缺血及再灌流不同阶段血清及脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和脂质过氧化反应最终产物(MDA)的含量变化, 结果发现单纯缺血组与再灌流各组脑组织MDA的含量均高于正常对照组, 且再灌流1 h、 6 h组的MDA含量明显高于单纯缺血组(P<0.05), 并有随再灌时间延长不断升高的趋势, 但三个再灌流组之间比较无明显差异。 单纯缺血组与再灌流各组比较脑组织SOD的活性均较正常对照组降低, 以再灌1 h、 6 h最为明显, 与单纯缺血组比较P<0.05。 实验各组与正常对照组比较血浆SOD的活性无显著差异。 表明单纯缺血和再灌流后均发生了脂质过氧化反应, 并认为自由基引起的损伤, 在缺血后再灌流中比单纯缺血更为严重。
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在脑缺血再灌流过程中, 氧自由基的大量形成和脂质过氧化的增加是细胞损伤的主要病理过程之一[1,2]。 丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应的最终产物, 测定MDA的含量可反映组织中自由基的含量和脂质过氧化程度[3]。 而超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内主要的抗氧化酶-超氧自由基清除剂。 本实验通过沙土鼠实验性脑缺血再灌流模型, 分别测定了血清及脑组织中SOD和MDA在缺血及再灌流不同阶段的含量变化, 探讨其相互关系, 为缺血后再灌流损伤的治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及模型制作
雄性蒙古沙土鼠40只, 体重55～68 g, 中国人民解放军总医院动物中心提供。 随机分为正常对照, 单纯缺血15 min、 30 min, 缺血30 min后再灌流30 min、 1 h、 6 h等6组。 20%乌拉坦腹腔麻醉(1.5 g/kg)。 颈正中切口分离双侧颈总动脉, 用小动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉15 min、 30 min, 造成单纯脑缺血模型。 夹闭30 min后恢复血流制成再灌流模型。 正常对照组不夹闭颈总动脉。
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1.2 样本制备及测定方法
颈动脉穿刺抽血(1∶9枸橼酸钠抗凝), 立即离心(4 000 r/min)10 min, 取血清存入-20 ℃冰箱待测。 快速断头取脑, 取一侧半球的颞叶及顶叶皮质, 称重量, 放入预冷的PBS缓冲液中(pH 7.0), 用玻璃匀浆器制成10%的匀浆液, 离心(4 000 r/min)10 min, 取上清液存入-20 ℃冰箱待测。 MDA的测定采用比色法[4], SOD采用化学发光法[5]。 结果用t检验进行统计学处理。
从表1可以看出, 单纯缺血组与再灌流各组脑组织MDA的含量均高于正常对照组, 且再灌流1 h、 6 h组的MDA含量明显高于单纯缺血组(P<0.05～0.01), 并有随再灌时间延长不断升高的趋势, 但三个再灌流组之间比较无明显差异。 单纯缺血组与再灌流各组脑组织SOD的活性均较正常对照组降低, 以再灌1 h、 6 h最为明显, 且与单纯缺血组比较, P<0.05。 表2显示实验各组与正常对照组比较, 血浆SOD的活性均无显著性差异。
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2 结 果
表 1 沙土鼠脑缺血再灌流不同阶段脑组织中SOD活性和MDA含量的比较(
±s) 组 别n
SOD(U/ml)
MDA(nmol/ml)
正常组
5
92.78±1.38
4.28±0.31
缺血15 min
, 百拇医药
6
87.92±1.74
4.31±0.71
缺血30 min
8
84.50±1.901)
5.74±0.53
再灌30 min
6
82.47±2.051)
5.82±0.402)
, 百拇医药
再灌1 h
8
74.98±3.181)3)
7.08±0.301)3)
再灌6 h
7
75.48±3.171)3)
7.72±0.441)4)
注: 与正常对照组比较: 1) P<0.01, 2) P<0.05; 再灌组与单纯缺血组比较: 3) P<0.05, 4) P<0.01表 2 沙土鼠脑缺血再灌流不同阶段血浆中SOD的活性(
±s) 组 别, 百拇医药
n
SOD(U/ml)
正常组
5
69.98±2.27
缺血15 min
7
70.37±4.43
缺血30 min
7
62.92±5.18
再灌30 min
, 百拇医药 7
60.44±4.03
再灌1 h
8
59.35±4.15
再灌6 h
7
62.08±2.14
3 讨 论
众所周知, 脑对缺血极为敏感, 短期脑缺血即能导致一系列的功能及代谢紊乱。 因此, 尽快恢复脑血流是改善缺血脑功能的重要措施。 然而许多实验证明, 一定程度脑缺血后, 血流再通会引起更为严重的脑组织损伤。 研究表明在脑缺血再灌流过程中自由基急剧增高是再灌流损伤的主要病理基础, 它对细胞的损伤作用是引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应, 而中枢神经系统中含有丰富的不饱和脂肪酸, 最易发生脂质过氧化反应。 因此测定MDA的含量可反应组织中自由基的含量和脂质过氧化程度。 SOD是一种金属蛋白酶, 也是机体内非常重要的氧自由基清除剂, 实验证明外源性SOD对脑缺血再灌流损伤有保护性作用[6]。 本实验测得脑组织MDA的含量在缺血组与再灌流各组均增高, 且随再灌时间延长有继续升高的趋势, 而SOD的活性则降低, 再灌流后较单纯缺血期改变明显。 表明在单纯缺血和再灌流后均发生了脂质过氧化反应, 并认为自由基引起的损伤在再灌流后比单纯缺血更为严重[7]。 血清SOD的活性在脑缺血与再灌流损伤中无明显变化, 与文献[8～10]报导的研究结果一致, 提示氧自由基的损伤作用主要在脑组织局部, 表现为脑组织自由基产生增多, 脑组织SOD因消耗而使抗氧化酶活性降低、 氧自由基清除减少, 造成脑组织损伤。 由于SOD是一种带负电荷的大分子蛋白酶, 分子量为31 000左右, 不能通过血脑屏障[10,11], 因此虽然脑组织SOD下降, 血浆SOD不一定会降低。
, 百拇医药
参考文献
[1] Jack D. Free radical pathology. Stroke, 1978, 9:443.
[2] Kinute Y. Lipid peroxdation in focal cerebral ischemia. J Neurosury, 1989, 7:421.
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, 百拇医药
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[6] Uyama H. Protective effects of superoxide on actute reperfusion injury of gerbil brain. Free Radical biolmed, 1990, 7:265.
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, 百拇医药
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[11] 于新. 脑损伤和脑水肿的氧自由基作用和超氧化物歧化酶的治疗作用. 国外医学神经病学神经外科学分册, 1994, 21(3):128.
本文1998-01-20收到, 1998-04-23修回, 1998-06-20修回, 1998-10-24接受, http://www.100md.com(赵秀梅* 刘育英* 姜 澜*)