粘附分子在淋巴细胞穿越血管内皮过程中的作用的研究进展
作者：冷启新1
单位：1 原在潍坊医学院, 华西医科大学97级博士生, 现在山东医科大学解剖教研室, 邮政编码 济南250012
关键词：
粘附分子在淋巴细胞穿越血管内皮过程中的 作用的研究进展 综述 刘执玉2 李瑞祥3审校
淋巴细胞和多形核细胞向血管外迁移是一个复杂的过程, 其中涉及了大量的粘附分子, 包括选择素、 整合素、 免疫球蛋白基因超家族、 钙依赖性粘附素家族等, 是目前研究的热点, 白细胞的大量浸润在某些疾病的发生发展过程中起重要作用, 明确其机理对于疾病的防治有重要意义。 现将近几年有关粘附分子在淋巴细胞穿越内皮过程中的作用及其机理的研究进展作一综述。
, 百拇医药 正常情况下, 淋巴细胞不断地从血液经毛细血管后微静脉进入组织, 周游全身监视侵入体内的外来抗原和改变了的自身细胞, 并能迅速地聚积到损伤和感染部位, 参与炎症反应, 以维持机体内环境的稳定。 淋巴细胞穿出微血管内皮不是一个盲目的过程, 而是由表达在淋巴细胞和微血管内皮上的粘附分子相互识别和相互作用的结果[1]。 趋化因子通过一定的浓度梯度在淋巴细胞定向迁移中起导向的作用[2]。 参与淋巴细胞穿出血管的粘附分子包括五类: ① 选择素家族(Selectin Family, SF; 包括E-, P-, L-选择素); ② 整合素家族(Integrin Family, IF; 包括α4β1, α4β7, CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18等); ③ 免疫球蛋白基因超家族(Immunoglobulin gene Super Family, IgSF; 包括ICVM-1,2,3及VCAM-1, PECAM-1, MAdCAM-1等); ④ 钙依赖性粘附素家族(Cadhein Family, CF; 包括E-, P-, N-Cadhein等); ⑤ 其它, 如CD44等尚未分类的重要分子。
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淋巴细胞向血管外迁移(Extravasation)发生在毛细血管后微静脉, 又称高内皮静脉(High Endothelial Venules, HEVs), 其内皮呈现立方形, 与其它部位的扁平形态有着明显的差异, 光镜下这些内皮细胞深面有大量淋巴细胞, 说明HEVs有参与募集淋巴细胞的功能。 电镜下HEV内有大量的高尔基复合体、 丰富的核糖体和粗面内质网。 说明HEV有蛋白质合成的功能。 Weibel-Palade小体也很丰富, 其内含有P-选择素, 此处的切应力大约为3 Pa, 血流速度慢, 有利于淋巴细胞与内皮的粘附接触。 体内淋巴细胞通过HEVs迁移是一个非常特别和有效的过程, 循环中的淋巴细胞能区分HEVs和邻近的非淋巴样组织内皮细胞, 循环中的淋巴细胞大约有25%将通过与HEVs结合外移, 即1.4×104个/s淋巴细胞从血液中进入每个淋巴结。
淋巴细胞迁移的过程是一个多步级联过程[3], 包括:
, http://www.100md.com 1 初始粘附(Primary adhesion)
初始粘附这一过程主要是由选择素家族介导的, 是短暂和可逆的, 发生在数秒钟之内。 主要表现在淋巴细胞沿着血管内皮的滚动。 继而将淋巴细胞锚定(Techering)在内皮上。 这主要是由淋巴细胞上的L-选择素介导的。 实际上通过L-选择素的相互作用常常需要淋巴细胞的运动[4]。 L-选择素主要存在于淋巴细胞表面微绒毛的末端, 这是在生理切应力下淋巴细胞与HEVs有效接触的部位[5]。 L-选择素(又名LAM-1, Leu-8, Mel-14, LECAM-1, CD62L)分布在所有的白细胞上, 但在不同的白细胞上其分子量不同, 淋巴细胞上的分子量为75 KD, 中性粒细胞上的为95～105 KD, 单核细胞为110 KD。 L-选择素在细胞表面不断表达而活化后脱落。 其配基是HEVs内皮上的SLex。 淋巴细胞上的L-选择素首先与血管内皮细胞的L-选择素配体结合, 介导淋巴细胞与内皮细胞的粘附。 有文献报道L-选择素在体内或体外均参与介导多形核细胞和单核细胞向炎性内皮的募集[6]。 L-选择素的单克隆抗体可大部分抑制淋巴细胞的滚动。 以前认为E-选择素在白细胞滚动中起重要作用[7], 但近年来则认为E-选择素在这方面的作用很小[8]。 在E-选择素缺乏的小鼠白细胞从血管内穿出的功能在几种炎症模型中不受影响。 然而, 应用P-选择素的抗体可明显减少白细胞外移, 说明P-选择素也参与粘附过程。 Connolly等[9]发现: P-选择素缺乏的鼠, 脑缺血再灌注后, 脑缺血损伤的程度要比正常鼠的明显减轻, P-选择素是多形核细胞(PMN)滚动的早期介导者, 其作用有利于ICAM-1介导的PMN捕捉, 提示抗P-选择素的治疗可以减少PMN的浸润、 减轻脑缺血再灌注的损伤。
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Kitayama等[8]研究了生理状态下P-和L-选拔素在嗜酸性粒细胞锚定和捕捉的作用, 发现嗜酸性粒细胞利用P-选择素而非E-选择素在活化的内皮细胞上初次锚定(Primary Tethering)。 L-选择素在介导再次锚定(Secondary Tethering)中起重要的作用。 α4亚单位在起始锚定中作用不大, 但在捕捉形成中起关键的作用, α4β1/VCAM-1介导嗜酸性粒细胞的捕捉无需以滚动为前提, 化学趋化因子的刺激进一步加强这一途径的作用并且增加嗜酸性粒细胞在切应力下的聚集。 β2整合素促进嗜酸性粒细胞的聚集, 但作用比α4β1作用要晚。 联合应用α4和β2的单抗可几乎完全阻断嗜酸性粒细胞的聚集和捕捉。
P-选择素存在于静息的血小板的α颗粒中和内皮细胞的Weibel-Palade小体中。 组织胺、 LPS、 TNF-α、 IL-1β等都可刺激内皮细胞上P-选择素的迅速一过性表达, 注射组织胺后5 min P-选择素表达明显升高, 并持续1 h。 因此可以设想P-选择素在诱导白细胞粘附中起重要作用, L-选择素由于位于其表面微绒毛的末端, 其作用是介导白细胞于微血管内皮细胞的初次接触, 使白细胞沿内皮细胞滚动, 并将其锚定在内皮细胞上。 E-选择素的作用较小, 可能对P-和L-选择素起协同的作用。 α4整合素介导的粘附则无需选择素介导的滚动为前提, 直接与其相应配体结合如α4β1/VCAM-1、 α4β7/MAdCAM-1。
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2 活化(Activation)
淋巴细胞的活化是一个快速反应的过程, 大约1～20 s。 整合素激活可发生在淋巴细胞-内皮细胞的相互作用过程中, 最快可在接触后的1～3 s。 激发整合素依赖捕捉与百日咳毒素敏感的Gαi蛋白相关受体, 它是七次跨膜蛋白或蛇根碱化学趋化因子家族, 这些受体高表达在中性粒细胞和趋化因子受体转染的淋巴细胞, 可激发整合素在数秒钟通过与GTP结合蛋白Rho的细胞内信号传导途径使其粘附到血管内皮细胞上的配体。 然而这种整合素活化如果没有外渗(Diapedesis)信号在数分钟内可以逆转, 细胞由捕捉恢复到滚动状态。 活化的过程需要化学趋化因子, 静息的淋巴细胞仅表达低水平的化学趋化因子受体。
Syrovets等(1997)用百日咳毒液(Pertussis Toxin, PTX)研究其对Lp(a)、 C5a、 MIP-1α、 FMLP诱导的单核细胞迁移的影响。 发现PTX抑制这些趋化因子诱导的信号传递和趋化磷脂蛋白A诱导的单核细胞的迁移, 说明PKC的活化在Lp(a)诱导的单核细胞迁移中起重要的作用。 cGMP在单核细胞的化学趋化中也起重要的作用, 单核细胞中cGMP水平升高, 单核细胞增加对化学趋化因子的反应性增加。 相反单核细胞cAMP水平的增加将降低单核细胞的迁移。 Lp(a)诱导单核细胞内cGMP水平的持续升高, 是引起单核细胞迁移的关键, 这在动脉粥样硬化的发生中有重要意义[10]。
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3 活化依赖的捕捉(Activation-dependent arrest)
这一过程的参与主要由淋巴细胞上的整合素家族和其对应的免疫球蛋白超家族的配体结和所介导的。 主要包括α4β1/VCAM-1、 α4β7/MAdCAM-1、 LFA-1/ICAM-1、 MAC-1/ICAM-1、 LFA-1/ICAM-2。 和α4整合素不同, β2整合素(LFA-1和MAC-1)主要位于淋巴细胞的表面, 而且大部分不在微绒毛上[11]。
整合素家族为粘附分子中的一类跨膜异二聚体糖蛋白, 目前已知有20多种, 分别由14种α链和8种β链组合而成, 其介导细胞与细胞及细胞与基质/基底膜之间的粘附, 在细胞代谢、 分化、 迁移、 胚胎发生、 维持组织结构的完整性及信号传递中起重要的作用。 整合素的α、 β链均为长的细胞外区、 跨膜区和短的细胞内区(β9例外)。 细胞外区的α、 β链共同组成整合素受体, 与特异的配体结合, β链的细胞内区与细胞骨架的成分相连, 可完成细胞内外的双向信号传递。 整合素受体与细胞外基质配体相结合的识别位点已被确定, 最常见的是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽结构(Arg-Gly-Asp, RGD结构), 许多整合素为RGD依赖的。 现以α4β1/VCAM-1为例加以说明。
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整合素介导的一个重要信号传递是FAK/Paxillin的磷酸化。 FAK(Focal Adhesion Kinase)和Paxillin位于集中粘附区(focal adhesion), 在整合素介导的粘附中发生磷酸化。 FAK是非受体酪氨酸激酶, 与整合素的胞浆内功能区相连, 在细胞骨架重组中起重要作用。 Paxillin定位于集中粘附区, 在整合素介导的粘附中发生磷酸化[12]。 Paxillin含有与FAK相互作用的结构域[13], FAK募集到集中粘附区需与Paxillin结合, FAK和Paxillin的磷酸化促进淋巴细胞的粘附和扩展(Spreading)。 细胞松弛素D(Cytochalasin D)可以抑制FAK和Paxillin的磷酸化[14], Paxillin的磷酸化在含有信号蛋白的SH2功能区产生结合位点, 如蛋白激酶pp60src、 Tensin和Adapter蛋白Crk。 Crk的功能是连接Paxillin磷酸化和p21ras。 是否整合素介导的途径常常引起FAK/Paxillin的磷酸化, 而非整合素介导的信号传导仅仅使Paxillin磷酸化还有待进一步确定。
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α4β1与其配体VCAM-1结合后, 导致构型改变, 都成为高亲合力的粘附分子, 从而处于活化状态。 Maguire[15]等的研究表明T细胞共刺激后能调节酪氨酸局部(focal)粘附激酶pp125FAK, 且持久地增加T细胞内pp125FAK的酪氨酸磷酸化作用, 产生不同于pp59fyn和pp56lck的57-KD酪氨酸磷酸化蛋白(pp57), 通过Ras途径进行信号传导。 这条pp125FAK信号传导途径几乎存在于所有表达整合素α4β1的细胞。 VCAM-1基因的表达主要由转录因子NF-кB控制, NF-кB是一类异源的二聚体复合物, 与VCAM-1基因相关的是由50 KDa多肽(p50)和65 KDa多肽(p65, RelA)构成, 在大多数细胞系中由于抑制因子IкB及ReL蛋白前体p105与p65的偶联作用, 使整个NF-кB以无活性的复合物的形式存于在细胞质中, 内皮细胞在病毒、 IL-1、 TNF-α、 INF-γ、 PMA、 LPS或紫外光等的作用下, 激活蛋白激酶(PKC、 PKR、 PTK、 PTP), 使p105、 кB磷酸化并与编在蛋白(ubiquitin)连接, 从而从复合体上解离并降解或被蛋白酶小体(proteasome)处理, 游离的NF-кB随即转位进入细胞核, 结合靶基因的特定序列(-75～-65), 与其它转录活化因子如干扰素调节因子-1(INF Regulatory Factor-1, IRF-1)等连接形成高度有序的操纵子复合体, 从而激活这一基因的转录反应。 抗氧化剂(如Nacetyl-cysteine, NAC; Pyrrollidine Dithicarbonate, PDTC)、 PTK抑制剂(Herbimycin A, HMA; Genistein)等可以阻断p105、 IкB磷酸化和肽醛等蛋白酶体抑制剂可以抑制p105、 IкB的降解, 它们都能阻断VCAM-1的表达。 对这一方面的进一步认识可为其临床应用提供理论基础[16]。Hauzenberger[17]的研究发现: 霍乱毒素(Cholera Toxin, CT)和百日咳毒素(Pertussis Toxin, PTX)对诱导的T细胞移动无任何作用, 但用蛋白酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinase, PTK)抑制剂Genistein和蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)抑制剂Calphostin C可以抑制T细胞的移动, 说明α4β1和αLβ2(CD11a/CD18)诱导的细胞移动是PTK和PKC敏感的传导途径。 一个与这二者都有关的传导途径是经过PLC-γ的途径, PLC-γ的磷酸化可通过: ① 三磷酸肌醇(IP3)途径, 使细胞内钙离子浓度的升高。 ② 甘油二脂(DG)途径, 活化PKC, 催化各种不同的靶蛋白, 如FAK和Paxillin发生磷酸化, 引起以肌动蛋白为主的细胞骨架的重组, 从而产生细胞的运动。 细胞松弛素D(Cytochalasin D)可以抑制细胞的扩展和FAK、 Paxillin磷酸化[18,19]。 Kitazawa[20]最近的研究表明: IL-7诱导胸腺细胞与FN的粘附不伴有α4β1表达的增加, 一般情况下, 可快速激活成与配体高亲合力的状态, IL-4诱导的粘附依赖于α4β1, 并使β1亚单位快速磷酸化, α4的单抗或PTK抑制剂Genistein、 PKC抑制剂Staurosporine[21]通过抑制β1亚单位的磷酸化而阻断胸腺细胞的粘附。 胸腺细胞高表达α4β1和α5β1, 而α5β1的单抗对IL-7诱导的粘附无阻断作用。
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4 穿越内皮细胞之间迁出(Diapedesis, Transmigration)
淋巴细胞在内皮细胞之间穿出, 正常情况下在内皮细胞之间有血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1或CD31), PECAM-1是130 KD糖蛋白, 分布于内皮细胞之间的连接处、 血小板及一些白细胞上, 如单核细胞、 PMN、 T细胞亚群(尤其是幼稚CD8+T细胞)及NK细胞表面, 在内皮细胞上不断表达, 在内皮细胞之间的附着和白细胞的跨内皮迁移过程中起重要的作用。 PECAM-1的作用是通过内皮细胞上的PECAM-1与淋巴细胞上的PECAM-1相互作用完成的。 Muller等人证实: PECAM-1的单抗或可溶性重组的PECAM-1预处理内皮细胞, 能够阻断70%～90%的单核细胞穿越活化的内皮细胞。 用抗体预处理内皮细胞或单核细胞可阻断迁移。 光、 电镜下观察被阻断的白细胞主要紧密聚积在内皮细胞的顶面。 移出(Transmigration)由PECAM-1介导[22]。 体内单核细胞不断穿过内皮细胞, 在炎症部位数量增加, 相对而言, 中性粒细胞主要限于急性炎症的部位, 单核细胞穿越静息和活化的内皮细胞, 而中性粒细胞只穿越活化的内皮细胞。 PECAM-1在单核细胞的不断迁移和单核细胞激活移出的过程中起重要的作用。 PECAM-1的单抗可阻断有害的炎症反应, 而对免疫反应无负作用。
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取决于细胞的类型和炎性刺激的不同, 许多粘附分子以不同方式参与了白细胞的滚动、 活化、 紧密粘附, 因此很难用阻断一种粘附分子的方法去阻断炎性反应, 而PECAM-1是介导白细胞受不同刺激后外移的最后步骤, PECAM-1的阻断将为抗炎治疗提供新的目标。
淋巴细胞的跨内皮穿越, 需要通过蛋白酶小体(Proteasome)降解机制, 降解位于内皮细胞之间的血管内皮钙粘附素复合体(Vascular Endothelial-Cadherin Complex)。 最近的文献报道, 蛋白酶溶解途径包括NF-кB的激活, 它是活化内皮细胞的转录E-选择素、 ICAM-1、 VCAM-1的因子[16], Proteasome的抑制剂小肽醛(MG132, NG115)可以明显降低TNF-α诱导的HUVEC表达的E-选择素、 ICAM-1、 VCAM-1。 功能上淋巴细胞的粘附下降50%, 迁移下降大于60%。 显微摄像显示, 许多淋巴细胞已变扁平并已伸出伪足到达内皮细胞之间连接, 但不能穿越内皮。 Proteasome的抑制剂可阻断紧密粘附的淋巴细胞穿过内皮细胞之间的连结。 表明内皮细胞之间的连结在淋巴细胞穿越内皮过程中至关重要。 内皮细胞之间的连结包括钙依赖粘附素, 是单跨膜糖蛋白, 膜内与细胞骨架成分相连, 介导钙依赖的细胞-细胞的粘附。 VE-钙粘附主要存在于血管内皮细胞, 与细胞骨架蛋白α-、 β-或γ-catenins相连形成VE-钙粘附素复合体。 酪氨酸激酶pp60src的底物之一p120和一个密切相关分子p100, 与人HUVEC的α-和β-catenins和VE-钙粘附素相连[23]。 TNF-α在中性粒细胞粘附之前, 刺激内皮细胞, 使其表达丰富的VE-钙粘附素、 β-和γ-catenins、 p120/p100和PECAM-1, 中性粒细胞粘附10 min后, 内皮细胞之间的VE-钙粘附素、 β-和γ-catenins、 p120/p100染色标记消失, 表明中性粒细胞的粘附通过蛋白溶解机制诱导β-和γ-catenins、 p120/p100从VE-钙粘附素复合体上的快速、 完全的降解[24]。 相反PECAM-1不直接于VE-钙粘附素复合体相连, 也位于内皮细胞之间的连结处, 并参与淋巴细胞的跨内皮转运, 但在淋巴细胞的转运过程中没有变化[25]。 有趣的是另一种Proteasome抑制剂MG132或Lactacystin并不阻止VE-钙粘附素复合体组成成分的降解, 也抑制大于60%的淋巴细胞的跨内皮连结迁移, 提示还有其它的抑制蛋白降解途径。 因此, 淋巴细胞的跨内皮迁移是一个复杂的过程, 中性粒细胞的粘附引起内皮细胞之间连结结构成分的改变, 继而导致中性粒细胞的跨内皮迁移。 Proteasome在调节淋巴细胞-内皮细胞相互作用中起重要作用。
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淋巴细胞的穿过内皮过程中, 伴有细胞内钙离子的浓度变化。 Huang[26]报道, 中性粒细胞附着于内皮, 诱导快速短暂的胞内钙浓度成倍增加, 并伴随中性粒细胞穿过活化的内皮细胞, 胞内钙螯合剂抑制大于90%的中性粒细胞迁移, 而对中性粒细胞的粘附无抑制作用。 但Pfau等[27]用淋巴细胞在流动状态下与内皮细胞单层相互作用, 报道细胞的附着依赖于细胞内的钙离子浓度变化。
因此, 白细胞的迁移是一个相当复杂的过程, 对这一过程发生机理的研究将有助于对白细胞迁移的控制以及对肿瘤增加淋巴细胞的浸润, 以促进肿瘤的消退, 而对一些自身免疫性疾病, 则可通过抑制炎性细胞的浸润, 以减少其对组织的损伤。 目前许多单抗通过拮抗某些粘附分子, 在减少炎症细胞的浸润方面已取得了较好的临床效果, 因此进行深入的研究将为疾病的治疗提供新的途径。
作者简介：2 山东医科大学解剖淋巴研究室； 3 华西医科大学解剖教研室
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本文1998-05-25收到, 1998-12-26修回, 1999-03-12接受, 百拇医药(冷启新1)
单位：1 原在潍坊医学院, 华西医科大学97级博士生, 现在山东医科大学解剖教研室, 邮政编码 济南250012
关键词：
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淋巴细胞和多形核细胞向血管外迁移是一个复杂的过程, 其中涉及了大量的粘附分子, 包括选择素、 整合素、 免疫球蛋白基因超家族、 钙依赖性粘附素家族等, 是目前研究的热点, 白细胞的大量浸润在某些疾病的发生发展过程中起重要作用, 明确其机理对于疾病的防治有重要意义。 现将近几年有关粘附分子在淋巴细胞穿越内皮过程中的作用及其机理的研究进展作一综述。
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淋巴细胞向血管外迁移(Extravasation)发生在毛细血管后微静脉, 又称高内皮静脉(High Endothelial Venules, HEVs), 其内皮呈现立方形, 与其它部位的扁平形态有着明显的差异, 光镜下这些内皮细胞深面有大量淋巴细胞, 说明HEVs有参与募集淋巴细胞的功能。 电镜下HEV内有大量的高尔基复合体、 丰富的核糖体和粗面内质网。 说明HEV有蛋白质合成的功能。 Weibel-Palade小体也很丰富, 其内含有P-选择素, 此处的切应力大约为3 Pa, 血流速度慢, 有利于淋巴细胞与内皮的粘附接触。 体内淋巴细胞通过HEVs迁移是一个非常特别和有效的过程, 循环中的淋巴细胞能区分HEVs和邻近的非淋巴样组织内皮细胞, 循环中的淋巴细胞大约有25%将通过与HEVs结合外移, 即1.4×104个/s淋巴细胞从血液中进入每个淋巴结。
淋巴细胞迁移的过程是一个多步级联过程[3], 包括:
, http://www.100md.com 1 初始粘附(Primary adhesion)
初始粘附这一过程主要是由选择素家族介导的, 是短暂和可逆的, 发生在数秒钟之内。 主要表现在淋巴细胞沿着血管内皮的滚动。 继而将淋巴细胞锚定(Techering)在内皮上。 这主要是由淋巴细胞上的L-选择素介导的。 实际上通过L-选择素的相互作用常常需要淋巴细胞的运动[4]。 L-选择素主要存在于淋巴细胞表面微绒毛的末端, 这是在生理切应力下淋巴细胞与HEVs有效接触的部位[5]。 L-选择素(又名LAM-1, Leu-8, Mel-14, LECAM-1, CD62L)分布在所有的白细胞上, 但在不同的白细胞上其分子量不同, 淋巴细胞上的分子量为75 KD, 中性粒细胞上的为95～105 KD, 单核细胞为110 KD。 L-选择素在细胞表面不断表达而活化后脱落。 其配基是HEVs内皮上的SLex。 淋巴细胞上的L-选择素首先与血管内皮细胞的L-选择素配体结合, 介导淋巴细胞与内皮细胞的粘附。 有文献报道L-选择素在体内或体外均参与介导多形核细胞和单核细胞向炎性内皮的募集[6]。 L-选择素的单克隆抗体可大部分抑制淋巴细胞的滚动。 以前认为E-选择素在白细胞滚动中起重要作用[7], 但近年来则认为E-选择素在这方面的作用很小[8]。 在E-选择素缺乏的小鼠白细胞从血管内穿出的功能在几种炎症模型中不受影响。 然而, 应用P-选择素的抗体可明显减少白细胞外移, 说明P-选择素也参与粘附过程。 Connolly等[9]发现: P-选择素缺乏的鼠, 脑缺血再灌注后, 脑缺血损伤的程度要比正常鼠的明显减轻, P-选择素是多形核细胞(PMN)滚动的早期介导者, 其作用有利于ICAM-1介导的PMN捕捉, 提示抗P-选择素的治疗可以减少PMN的浸润、 减轻脑缺血再灌注的损伤。
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Kitayama等[8]研究了生理状态下P-和L-选拔素在嗜酸性粒细胞锚定和捕捉的作用, 发现嗜酸性粒细胞利用P-选择素而非E-选择素在活化的内皮细胞上初次锚定(Primary Tethering)。 L-选择素在介导再次锚定(Secondary Tethering)中起重要的作用。 α4亚单位在起始锚定中作用不大, 但在捕捉形成中起关键的作用, α4β1/VCAM-1介导嗜酸性粒细胞的捕捉无需以滚动为前提, 化学趋化因子的刺激进一步加强这一途径的作用并且增加嗜酸性粒细胞在切应力下的聚集。 β2整合素促进嗜酸性粒细胞的聚集, 但作用比α4β1作用要晚。 联合应用α4和β2的单抗可几乎完全阻断嗜酸性粒细胞的聚集和捕捉。
P-选择素存在于静息的血小板的α颗粒中和内皮细胞的Weibel-Palade小体中。 组织胺、 LPS、 TNF-α、 IL-1β等都可刺激内皮细胞上P-选择素的迅速一过性表达, 注射组织胺后5 min P-选择素表达明显升高, 并持续1 h。 因此可以设想P-选择素在诱导白细胞粘附中起重要作用, L-选择素由于位于其表面微绒毛的末端, 其作用是介导白细胞于微血管内皮细胞的初次接触, 使白细胞沿内皮细胞滚动, 并将其锚定在内皮细胞上。 E-选择素的作用较小, 可能对P-和L-选择素起协同的作用。 α4整合素介导的粘附则无需选择素介导的滚动为前提, 直接与其相应配体结合如α4β1/VCAM-1、 α4β7/MAdCAM-1。
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2 活化(Activation)
淋巴细胞的活化是一个快速反应的过程, 大约1～20 s。 整合素激活可发生在淋巴细胞-内皮细胞的相互作用过程中, 最快可在接触后的1～3 s。 激发整合素依赖捕捉与百日咳毒素敏感的Gαi蛋白相关受体, 它是七次跨膜蛋白或蛇根碱化学趋化因子家族, 这些受体高表达在中性粒细胞和趋化因子受体转染的淋巴细胞, 可激发整合素在数秒钟通过与GTP结合蛋白Rho的细胞内信号传导途径使其粘附到血管内皮细胞上的配体。 然而这种整合素活化如果没有外渗(Diapedesis)信号在数分钟内可以逆转, 细胞由捕捉恢复到滚动状态。 活化的过程需要化学趋化因子, 静息的淋巴细胞仅表达低水平的化学趋化因子受体。
Syrovets等(1997)用百日咳毒液(Pertussis Toxin, PTX)研究其对Lp(a)、 C5a、 MIP-1α、 FMLP诱导的单核细胞迁移的影响。 发现PTX抑制这些趋化因子诱导的信号传递和趋化磷脂蛋白A诱导的单核细胞的迁移, 说明PKC的活化在Lp(a)诱导的单核细胞迁移中起重要的作用。 cGMP在单核细胞的化学趋化中也起重要的作用, 单核细胞中cGMP水平升高, 单核细胞增加对化学趋化因子的反应性增加。 相反单核细胞cAMP水平的增加将降低单核细胞的迁移。 Lp(a)诱导单核细胞内cGMP水平的持续升高, 是引起单核细胞迁移的关键, 这在动脉粥样硬化的发生中有重要意义[10]。
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3 活化依赖的捕捉(Activation-dependent arrest)
这一过程的参与主要由淋巴细胞上的整合素家族和其对应的免疫球蛋白超家族的配体结和所介导的。 主要包括α4β1/VCAM-1、 α4β7/MAdCAM-1、 LFA-1/ICAM-1、 MAC-1/ICAM-1、 LFA-1/ICAM-2。 和α4整合素不同, β2整合素(LFA-1和MAC-1)主要位于淋巴细胞的表面, 而且大部分不在微绒毛上[11]。
整合素家族为粘附分子中的一类跨膜异二聚体糖蛋白, 目前已知有20多种, 分别由14种α链和8种β链组合而成, 其介导细胞与细胞及细胞与基质/基底膜之间的粘附, 在细胞代谢、 分化、 迁移、 胚胎发生、 维持组织结构的完整性及信号传递中起重要的作用。 整合素的α、 β链均为长的细胞外区、 跨膜区和短的细胞内区(β9例外)。 细胞外区的α、 β链共同组成整合素受体, 与特异的配体结合, β链的细胞内区与细胞骨架的成分相连, 可完成细胞内外的双向信号传递。 整合素受体与细胞外基质配体相结合的识别位点已被确定, 最常见的是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽结构(Arg-Gly-Asp, RGD结构), 许多整合素为RGD依赖的。 现以α4β1/VCAM-1为例加以说明。
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整合素介导的一个重要信号传递是FAK/Paxillin的磷酸化。 FAK(Focal Adhesion Kinase)和Paxillin位于集中粘附区(focal adhesion), 在整合素介导的粘附中发生磷酸化。 FAK是非受体酪氨酸激酶, 与整合素的胞浆内功能区相连, 在细胞骨架重组中起重要作用。 Paxillin定位于集中粘附区, 在整合素介导的粘附中发生磷酸化[12]。 Paxillin含有与FAK相互作用的结构域[13], FAK募集到集中粘附区需与Paxillin结合, FAK和Paxillin的磷酸化促进淋巴细胞的粘附和扩展(Spreading)。 细胞松弛素D(Cytochalasin D)可以抑制FAK和Paxillin的磷酸化[14], Paxillin的磷酸化在含有信号蛋白的SH2功能区产生结合位点, 如蛋白激酶pp60src、 Tensin和Adapter蛋白Crk。 Crk的功能是连接Paxillin磷酸化和p21ras。 是否整合素介导的途径常常引起FAK/Paxillin的磷酸化, 而非整合素介导的信号传导仅仅使Paxillin磷酸化还有待进一步确定。
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α4β1与其配体VCAM-1结合后, 导致构型改变, 都成为高亲合力的粘附分子, 从而处于活化状态。 Maguire[15]等的研究表明T细胞共刺激后能调节酪氨酸局部(focal)粘附激酶pp125FAK, 且持久地增加T细胞内pp125FAK的酪氨酸磷酸化作用, 产生不同于pp59fyn和pp56lck的57-KD酪氨酸磷酸化蛋白(pp57), 通过Ras途径进行信号传导。 这条pp125FAK信号传导途径几乎存在于所有表达整合素α4β1的细胞。 VCAM-1基因的表达主要由转录因子NF-кB控制, NF-кB是一类异源的二聚体复合物, 与VCAM-1基因相关的是由50 KDa多肽(p50)和65 KDa多肽(p65, RelA)构成, 在大多数细胞系中由于抑制因子IкB及ReL蛋白前体p105与p65的偶联作用, 使整个NF-кB以无活性的复合物的形式存于在细胞质中, 内皮细胞在病毒、 IL-1、 TNF-α、 INF-γ、 PMA、 LPS或紫外光等的作用下, 激活蛋白激酶(PKC、 PKR、 PTK、 PTP), 使p105、 кB磷酸化并与编在蛋白(ubiquitin)连接, 从而从复合体上解离并降解或被蛋白酶小体(proteasome)处理, 游离的NF-кB随即转位进入细胞核, 结合靶基因的特定序列(-75～-65), 与其它转录活化因子如干扰素调节因子-1(INF Regulatory Factor-1, IRF-1)等连接形成高度有序的操纵子复合体, 从而激活这一基因的转录反应。 抗氧化剂(如Nacetyl-cysteine, NAC; Pyrrollidine Dithicarbonate, PDTC)、 PTK抑制剂(Herbimycin A, HMA; Genistein)等可以阻断p105、 IкB磷酸化和肽醛等蛋白酶体抑制剂可以抑制p105、 IкB的降解, 它们都能阻断VCAM-1的表达。 对这一方面的进一步认识可为其临床应用提供理论基础[16]。Hauzenberger[17]的研究发现: 霍乱毒素(Cholera Toxin, CT)和百日咳毒素(Pertussis Toxin, PTX)对诱导的T细胞移动无任何作用, 但用蛋白酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinase, PTK)抑制剂Genistein和蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)抑制剂Calphostin C可以抑制T细胞的移动, 说明α4β1和αLβ2(CD11a/CD18)诱导的细胞移动是PTK和PKC敏感的传导途径。 一个与这二者都有关的传导途径是经过PLC-γ的途径, PLC-γ的磷酸化可通过: ① 三磷酸肌醇(IP3)途径, 使细胞内钙离子浓度的升高。 ② 甘油二脂(DG)途径, 活化PKC, 催化各种不同的靶蛋白, 如FAK和Paxillin发生磷酸化, 引起以肌动蛋白为主的细胞骨架的重组, 从而产生细胞的运动。 细胞松弛素D(Cytochalasin D)可以抑制细胞的扩展和FAK、 Paxillin磷酸化[18,19]。 Kitazawa[20]最近的研究表明: IL-7诱导胸腺细胞与FN的粘附不伴有α4β1表达的增加, 一般情况下, 可快速激活成与配体高亲合力的状态, IL-4诱导的粘附依赖于α4β1, 并使β1亚单位快速磷酸化, α4的单抗或PTK抑制剂Genistein、 PKC抑制剂Staurosporine[21]通过抑制β1亚单位的磷酸化而阻断胸腺细胞的粘附。 胸腺细胞高表达α4β1和α5β1, 而α5β1的单抗对IL-7诱导的粘附无阻断作用。
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4 穿越内皮细胞之间迁出(Diapedesis, Transmigration)
淋巴细胞在内皮细胞之间穿出, 正常情况下在内皮细胞之间有血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1或CD31), PECAM-1是130 KD糖蛋白, 分布于内皮细胞之间的连接处、 血小板及一些白细胞上, 如单核细胞、 PMN、 T细胞亚群(尤其是幼稚CD8+T细胞)及NK细胞表面, 在内皮细胞上不断表达, 在内皮细胞之间的附着和白细胞的跨内皮迁移过程中起重要的作用。 PECAM-1的作用是通过内皮细胞上的PECAM-1与淋巴细胞上的PECAM-1相互作用完成的。 Muller等人证实: PECAM-1的单抗或可溶性重组的PECAM-1预处理内皮细胞, 能够阻断70%～90%的单核细胞穿越活化的内皮细胞。 用抗体预处理内皮细胞或单核细胞可阻断迁移。 光、 电镜下观察被阻断的白细胞主要紧密聚积在内皮细胞的顶面。 移出(Transmigration)由PECAM-1介导[22]。 体内单核细胞不断穿过内皮细胞, 在炎症部位数量增加, 相对而言, 中性粒细胞主要限于急性炎症的部位, 单核细胞穿越静息和活化的内皮细胞, 而中性粒细胞只穿越活化的内皮细胞。 PECAM-1在单核细胞的不断迁移和单核细胞激活移出的过程中起重要的作用。 PECAM-1的单抗可阻断有害的炎症反应, 而对免疫反应无负作用。
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取决于细胞的类型和炎性刺激的不同, 许多粘附分子以不同方式参与了白细胞的滚动、 活化、 紧密粘附, 因此很难用阻断一种粘附分子的方法去阻断炎性反应, 而PECAM-1是介导白细胞受不同刺激后外移的最后步骤, PECAM-1的阻断将为抗炎治疗提供新的目标。
淋巴细胞的跨内皮穿越, 需要通过蛋白酶小体(Proteasome)降解机制, 降解位于内皮细胞之间的血管内皮钙粘附素复合体(Vascular Endothelial-Cadherin Complex)。 最近的文献报道, 蛋白酶溶解途径包括NF-кB的激活, 它是活化内皮细胞的转录E-选择素、 ICAM-1、 VCAM-1的因子[16], Proteasome的抑制剂小肽醛(MG132, NG115)可以明显降低TNF-α诱导的HUVEC表达的E-选择素、 ICAM-1、 VCAM-1。 功能上淋巴细胞的粘附下降50%, 迁移下降大于60%。 显微摄像显示, 许多淋巴细胞已变扁平并已伸出伪足到达内皮细胞之间连接, 但不能穿越内皮。 Proteasome的抑制剂可阻断紧密粘附的淋巴细胞穿过内皮细胞之间的连结。 表明内皮细胞之间的连结在淋巴细胞穿越内皮过程中至关重要。 内皮细胞之间的连结包括钙依赖粘附素, 是单跨膜糖蛋白, 膜内与细胞骨架成分相连, 介导钙依赖的细胞-细胞的粘附。 VE-钙粘附主要存在于血管内皮细胞, 与细胞骨架蛋白α-、 β-或γ-catenins相连形成VE-钙粘附素复合体。 酪氨酸激酶pp60src的底物之一p120和一个密切相关分子p100, 与人HUVEC的α-和β-catenins和VE-钙粘附素相连[23]。 TNF-α在中性粒细胞粘附之前, 刺激内皮细胞, 使其表达丰富的VE-钙粘附素、 β-和γ-catenins、 p120/p100和PECAM-1, 中性粒细胞粘附10 min后, 内皮细胞之间的VE-钙粘附素、 β-和γ-catenins、 p120/p100染色标记消失, 表明中性粒细胞的粘附通过蛋白溶解机制诱导β-和γ-catenins、 p120/p100从VE-钙粘附素复合体上的快速、 完全的降解[24]。 相反PECAM-1不直接于VE-钙粘附素复合体相连, 也位于内皮细胞之间的连结处, 并参与淋巴细胞的跨内皮转运, 但在淋巴细胞的转运过程中没有变化[25]。 有趣的是另一种Proteasome抑制剂MG132或Lactacystin并不阻止VE-钙粘附素复合体组成成分的降解, 也抑制大于60%的淋巴细胞的跨内皮连结迁移, 提示还有其它的抑制蛋白降解途径。 因此, 淋巴细胞的跨内皮迁移是一个复杂的过程, 中性粒细胞的粘附引起内皮细胞之间连结结构成分的改变, 继而导致中性粒细胞的跨内皮迁移。 Proteasome在调节淋巴细胞-内皮细胞相互作用中起重要作用。
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淋巴细胞的穿过内皮过程中, 伴有细胞内钙离子的浓度变化。 Huang[26]报道, 中性粒细胞附着于内皮, 诱导快速短暂的胞内钙浓度成倍增加, 并伴随中性粒细胞穿过活化的内皮细胞, 胞内钙螯合剂抑制大于90%的中性粒细胞迁移, 而对中性粒细胞的粘附无抑制作用。 但Pfau等[27]用淋巴细胞在流动状态下与内皮细胞单层相互作用, 报道细胞的附着依赖于细胞内的钙离子浓度变化。
因此, 白细胞的迁移是一个相当复杂的过程, 对这一过程发生机理的研究将有助于对白细胞迁移的控制以及对肿瘤增加淋巴细胞的浸润, 以促进肿瘤的消退, 而对一些自身免疫性疾病, 则可通过抑制炎性细胞的浸润, 以减少其对组织的损伤。 目前许多单抗通过拮抗某些粘附分子, 在减少炎症细胞的浸润方面已取得了较好的临床效果, 因此进行深入的研究将为疾病的治疗提供新的途径。
作者简介：2 山东医科大学解剖淋巴研究室； 3 华西医科大学解剖教研室
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本文1998-05-25收到, 1998-12-26修回, 1999-03-12接受, 百拇医药(冷启新1)